专利名称：一种检测酶促降解烟草中纤维素和果胶程度的方法
技术领域：
本发明涉及酶促降解水不溶高分子技术领域，尤其是涉及一种酶促烟草水不溶物质降解率的测定方法。
背景技术：
随着我国加入WTO和签署《烟草控制框架公约》，烟草行业面临诸多方面的压力，降低烟叶有害成分、提高烟叶质量成为烟草行业关注的热点问题。目前卷烟减害多侧重于工业减害技术(如改善过滤和透气条件)研究。降低烟叶有害成分(主要是有害成分前体物)，减少烟草燃烧后产生的有害物质是卷烟减害的另外一条有效途径，目前正日益受到研究者关注。纤维素和果胶等都是生物大分子，在燃烧过程中常产生有害成分，它们的降解不 仅有利于降焦减害，同时可提高烟叶品质。在研究其降解的过程中不可避免地涉及到降解率的测定。目前利用酶或者微生物对水不溶高分子的降解性能测定评价方法很多，包括检测降解过程中产生的CO2为度量指标，如STURM法；以B0D/C0D为度量指标，测定生物降解过程中O2的消耗量，如MITI法；还有测定降解产物中某个指标的变换来度量水不溶高分子降解程度。对于水不溶高分子的降解程度的测定而言，上述方法操作复杂，耗时太长。
发明内容
针对现在技术存在的不足之处，本发明提供一种检测酶促降解烟草中纤维素和果胶程度的方法。该方法是一种科学合理、简单实用、准确性高、重复性好的测定酶液对烟草水不溶物质降解率的方法。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案一种检测酶促降解烟草中纤维素和果胶程度的方法，具体实施步骤如下I)烟草清洗用去离子水充分洗涤烟草，达到除去烟草表面杂质及可溶物的目的；2)烟草干燥用干燥设备在60°C _100°C下将洗涤干净的烟草干燥至恒重；3)烟草称重准确称量干燥后烟草的质量m。；4)喷酶液在干燥并称重过的烟草上喷洒能达到降解要求的酶液；5)烟草控温控湿反应将喷过酶液的烟草在25°C _65°C温度范围内保持恒温，并控制湿度在30%- 80%，根据降解要求反应一定时间；6)烟草漂洗将控温控湿反应后的烟草用去离子水充分漂洗，达到去除酶制剂与反应产物的目的；7)干燥将漂洗过的烟草用干燥设备在60°C _100°C下将洗涤干净的烟草干燥至
恒重；8)称重准确称量干燥后烟草的质量Hi1 ；9)计算降解率利用公式降解度(100%)=[(降解前质量Hi0-降解后质量Hi1)/降解前质量mj X 100%计算出烟草的降解率。上述技术方案的有益之处在于本发明采用测定降解高分子样品的质量减少值，通过公式“降解度(100%)=[(降解前质量-降解后质量)/降解前质量]X100%”来计算水不溶高分子的降解率，是一种科学合理、简单实用、准确性高、重复性好的测定酶液对烟草水不溶物质降解率的方法。本发明还可广泛用于其他水不溶高聚物的酶促降解与微生物降解率测定。
图I是果胶酶试验中对照样片烟扫描电镜照片，放大倍数为1000倍。图2是果胶酶试验中果胶酶处理后片烟扫描电镜照片，放大倍数为1000倍。图3是纤维素酶试验中对照样片烟扫描电镜照片，放大倍数为1000倍。 图4是纤维素酶试验中纤维素酶处理后片烟扫描电镜照片，放大倍数为1000倍。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照各酶液最适条件进行。实施例I材料I)片烟样品为2006年津巴布韦片烟烟叶B10T，装入封口聚乙烯袋中，常温保存。2)果胶酶液所用菌株为Aspergillus niger A2,100L发酵罐进行发酵,所得发酵液于4 0CuOOOO r/min离心，上清液即为待用果胶酶液。方法称取6份片烟样品，每份2. 5kg，分为两组，每组3份。一组是酶液处理样，另一组是实验对照样。步骤如下I)烟草清洗用去离子水充分洗涤片烟样品，达到除去烟草表面杂质及可溶物的目的。清洗设备既要能清洗掉烟草表面的杂质，又要对烟草的组织结构不产生二次损伤。2)烟草干燥在80°C烘箱中将洗涤干净的片烟样品烘至恒重。3)烟草称重准确称量干燥后片烟样品的质量πν称重设备需要能精确到毫克。4)喷酶液以50 ml/min的喷洒量相对均匀的将IOOg果胶酶液喷洒到干燥并称重过的每份片烟表面，实验对照样喷同样质量(IOOg)的去离子水。5)烟草控温控湿反应将喷过酶液和去离子水的片烟样品控制在温度条件为50 0C、湿度条件为60%的恒温恒湿条件，反应24 h。6)烟草漂洗将控温控湿反应后的片烟样品用35°C的去离子水充分漂洗20分钟，去除酶液及降解物。7)干燥将漂洗过的片烟样品在80°C烘箱中烘至恒重。8)称重准确称量干燥后片烟样品的质量叫。称重设备需要能精确到毫克。9)计算相对降解率利用公式降解度(100%)=[(降解前质量Hicr降解后质量Hi1)/降解前质量mj X 100%计算出烟草的降解率。
验证方法I)比色法测定片烟中果胶含量取片烟样品进行切丝，于鼓风干燥箱中60°C烘干过夜，用粉碎机粉碎至60目待用，同时测定片烟含水率。准确称取上述烟末样品O. 5 g，标记为A(对照样)、B(酶液处理样)，分别放入具塞试管。将50 mL热水分别加入每支试管中，充分振荡，然后置于沸水中，沸水浴2 h，以去除片烟中可溶性糖(期间不时震荡试管，混匀样品，以增强去除效果)。然后对烟样进行抽滤，润洗试管，将洗液一同并入抽滤漏斗，同时充分淋洗漏斗中的烟样，弃去滤液，将抽滤后的烟样转入对应标号的三角瓶中，加入50 mL含O. 2 g果胶酶(2.3 U/mg) pH 4. O柠檬酸钠-柠檬酸的缓冲液中，摇匀，50 °C下振荡水浴2 h，然后抽滤，取滤液，调pH> 12，将滤液定容至100 mL，取其中I mL溶液稀释至10 mL即得待测样品。取待测样品2 mL分别加入编号为A、B的具塞比色管，另取一支编号为O具塞比·色管加等量的去离子水，再分别加入2 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴10 min，冷却，定容至15mL,于550 nm下测0D，根据D-半乳糖醛酸标准曲线计算样品中D-半乳糖醛酸的量。片烟样品中果胶含量可由下式计算X= (( ~( X 100%
m x( l-W)式中X——样品中果胶含量，以D-半乳糖醛酸含量计，单位为质量百分数(100%)；C——测试样品溶液中D-半乳糖醛酸含量测定值，单位为毫克每升(mg/L)；C0——空白样品溶液中D-半乳糖醛酸含量测定值，单位为毫克每升(mg/L)；V-----样品定容体积，单位为升(L)；η-----溶液稀释倍数；m-----样品质量，单位为毫克(mg)；W——样品含水率(参照烟草行业YC/T31-1996烟草样品水分的测定标准方法测定)。2)片烟表面结构表征方法利用扫描电镜观察烟叶表面的结构变化，了解果胶酶处理烟叶后对烟叶微观结构产生的影响。结果I)利用本发明获得的实验结果对照组实验组
编号1 23 4 56
处理前质量2147.31 2175.652193. 53 2154.36 2136.27 2146.72 m0/g处理后质量2()92.39 2126.712130.42 1579.30 1550.29 1599.52
mi/g
降解率/%2.56 2. 252.88 26.69 27.43 25.49
平均降解率/%2. 5626.54
酶促降解率％23. 98 2)片烟中果胶含量的检测结果经果胶酶液处理，果胶含量明显降低，比色法检测结果为果胶含量下降了 25. 50%,用本发明中的快速方法测得果胶含量下降了 23. 98%。3)片烟表面结构变化将果胶酶液处理的片烟样品及其对照样品进行扫描电镜观察，结果如图I和图2，与对照组相比较，果胶酶液处理的片烟烟叶，其细胞皱缩加大，细胞与间隙连接处出现明显裂痕。据文献报道，烟叶中果胶主要存在于细胞间隙中，由此表明，果胶酶液对片烟果胶起到了有效的降解作用。实施例2材料I)片烟样品为2006年津巴布韦片烟烟叶B10T，装入封口聚乙烯袋中，常温保存。2)纤维素酶液所用菌株为Bacillus subtilis C_11，100L发酵罐进行发酵，所得发酵液于4 0CuOOOO r/min离心，上清液即为待用纤维素酶液。方法称取6份片烟样品，每份2. 4kg，分为两组，每组3份。一组是酶液处理样，另一组是实验对照样。步骤如下I)烟草清洗用去离子水充分洗涤片烟样品，达到除去烟草表面杂质及可溶物的目的。清洗设备既要能清洗掉烟草表面的杂质，又要对烟草的组织结构不产生二次损伤。2)烟草干燥在60°C烘箱中将洗涤干净的片烟样品烘至恒重。3)烟草称重准确称量干燥后片烟样品的质量πν称重设备需要能精确到毫克。4)喷酶液以50 ml/min的喷洒量相对均匀的将IOOg纤维素酶液喷洒到干燥并称重过的每份片烟表面，实验对照样喷同样质量(IOOg)的去离子水。5)烟草控温控湿反应将喷过酶液和去离子水的片烟样品控制在温度条件为30V，湿度条件为40%的恒温恒湿条件，反应24 h。
6)烟草漂洗将控温控湿反应后的片烟样品用35°C的去离子水充分漂洗20分钟，去除酶液及降解物。7)干燥将漂洗过的片烟样品在80°C烘箱中烘至恒重。8)称重准确称量干燥后片烟样品的质量叫。称重设备需要能精确到毫克。9)计算相对降解率利用公式降解度(100%)=[(降解前质量mQ-降解后质量Hi1)/降解前质量mj X 100%计算出烟草的降解率。验证方法I)片烟中纤维素含量的检测方法本试验采用范氏中性洗涤剂，综合运用2 mol/L盐酸水解法、72%浓硫酸水解法测定纤维素含量。称取I. 0000 g处理后片烟，放入到100 mL三角瓶中，加入70 mL的范氏中 性洗涤剂。在115°C 121°C条件下保温20 min，取出之后采用三号30 mL砂芯坩锅(孔径为30微米)过滤。然后使用无水乙醇和丙酮溶液洗涤。弃掉滤液，用真空干燥器干燥滤渣20 min。将滤渣和坩埚一起放入到100 mL烧杯中，加入70 mL 2mol/L的盐酸溶液，放入高压灭菌锅，100°c条件下保温50 min,取出之后采用三号30 mL砂芯坩锅过滤。使用无水乙醇和丙酮溶液洗涤。同样去掉滤液，将滤渣连同坩埚烘干至恒重，记为I。将烘干至恒重的残渣和坩埚一起放入150 mL烧杯内，加入10 mL 72%硫酸溶液，常温下降解4 h后加入90mL蒸馏水。放置过夜，并用蒸馏水洗涤。烘干至恒重，记为W2。W1- W2为纤维素的含量。2)片烟表面结构表征方法利用扫描电镜观察烟叶表面的结构变化，了解纤维素酶处理烟叶后对烟叶微观结构产生的影响。结果
权利要求
1.一种检测酶促降解烟草中纤维素和果胶程度的方法，特征在于具体实施步骤如下 1)烟草清洗用去离子水充分洗涤烟草，达到除去烟草表面杂质及可溶物的目的； 2)烟草干燥用干燥设备在60°C_100°C下将洗涤干净的烟草干燥至恒重； 3)烟草称重准确称量干燥后烟草的质量Hltl； 4)喷酶液在干燥并称重过的烟草上喷洒能达到降解要求的酶液； 5)烟草控温控湿反应将喷过酶液的烟草在25°C_65°C温度范围内保持恒温，并控制湿度在30%- 80%，根据降解要求反应一定时间； 6)烟草漂洗将控温控湿反应后的烟草用去离子水充分漂洗，达到去除酶制剂与反应产物的目的；7)干燥将漂洗过的烟草用干燥设备在60°C_100°C下将洗涤干净的烟草干燥至恒重； 8)称重准确称量干燥后烟草的质量Hl1； 9)计算降解率利用公式降解度(100%)=[(降解前质量Hi0-降解后质量Hl1)/降解前质量mj X 100%计算出烟草的降解率。
2.如权利要求I所述的一种检测酶促降解烟草中纤维素和果胶程度的方法，特征在于步骤4所述喷酶液涉及的喷酶装置的喷洒量控制在lOOml/min以下。
3.如权利要求I或2所述的一种检测酶促降解烟草中纤维素和果胶程度的方法，特征在于步骤3和步骤8中的称重设备需要能精确到毫克。
全文摘要
本发明涉及一种检测酶促降解烟草中纤维素和果胶程度的方法，应用于烟草中纤维素、果胶等水不溶高分子的酶促降解率的测定。通过快速水洗方法来测定降解烟草样品的质量减少值，然后通过公式 “降解度(100%)=[(降解前质量-降解后质量)/降解前质量]×100%”来计算烟草中纤维素和果胶相对降解率。
文档编号G01N5/04GK102890038SQ20121037789
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者范坚强, 王金华, 宋纪真, 包可翔, �：�, 陈少滨, 龙腾, 陈义强, 崔振伟, 张永安, 黄剑滨, 赖荣华 申请人:福建中烟工业有限责任公司
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