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专利名称：一种基于量子点均相免疫检测病毒的方法
技术领域：
本发明涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，更具体涉及一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测多种病毒的方法。
背景技术：
检测多种病毒通常采用蛋白质阵列的方法，该法虽然选择性好，但是操作步骤多， 费时费力，成本高，并且不能同时检测不同性质的病毒。采用均相免疫反应进行病毒检测以及疾病诊断，具有快速、灵敏、特异等优点，而且可以同时检测不同性质的多种病毒。许多由病毒感染导致的疾病征兆很相似，单从并发症状看无法确定到底是由哪一种病毒感染导致的疾病。因此，就需要采用简便快速的检测方法高通量地检测多种病毒，用于临床疾病早期诊断。近年来，由于量子点技术的兴起，不少研究者将量子点技术引入到病毒检测中，但他们用的大多是有机相量子点，由于有机相量子点合成产量有限，大规模使用受到限制。另外，合成有机相量子点需使用有毒的有机溶剂，容易对人体健康产生危害并对环境造成污染。不仅如此，有机相量子点在进行水溶性化转化中荧光性能还会受到影响。为解决以上问题，基于水溶性量子点建立的化学传感器普遍受到青睐。由于量子点具有一元激发多元发射的性质，故在同一激发波长激发下，可以获得不同颜色的量子点发射峰信号。

发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测多种病毒的方法。采用量子点为荧光信号输出材料，检测灵敏度高；氧化石墨烯作为一种新兴的碳材料，具有刚性的平面共轭结构和良好的电子传递性能，使其被用来作为高效的荧光猝灭剂；量子点标记抗体(QDs-Ab)与待测抗原免疫反应进行检测，特异性强。首先将一定量的不同颜色的链霉亲和素(SA)修饰的量子点(均购自武汉珈源量子点技术开发有限公司)分别与不同种类病毒的生物素化抗体混合制备偶联物，再加入过量氧化石墨烯，量子点的突光被粹灭，再加入与抗体相对应的病毒后，量子点的突光分别回升， 这样既可根据不同颜色量子点的荧光强度是否回升对病毒种类进行定性识别，还可以根据量子点的荧光强度回升强度值对病毒含量进行定量检测，同时还可以在紫外分析仪中用紫外灯激发样品溶液进行拍照，得到可视化的图片，通过颜色变化对病毒进行半定量检测。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测病毒的方法，其步骤如下(I)将链霉亲和素修饰的量子点溶解于15mM pH 8. O的磷酸盐缓冲溶液(简称 PBS)中，得到浓度为I. OX 10_n-l. OX 10_9mol/L的链霉亲和素修饰的量子点反应液；所述链霉亲和素修饰的量子点为SA-CdSe、SA-CdTe、SA-CdSe/ZnS、SA-CdTe/ ZnS、SA-CdTe/CdS/ZnS、SA-CdSe/CdS/ZnS、SA-CdSe :Mn2+、SA-CdTe:Mn2+、SA-CdSe: Zn2+ 或 SA-CdTe: Zn2+ ；(2)将步骤(I)得到的链霉亲和素修饰的量子点反应液与生物素化病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物反应液B;(3)向反应液B中加入过量的荧光猝灭剂氧化石墨烯，使氧化石墨烯的终浓度为 10ng/mL,得到反应液D ；(4)以激发波长280 480nm激发，测定反应液D在发射波长350 700nm处的荧光强度，得到量子点被氧化石墨烯猝灭后的荧光强度；(5)加入不同浓度的与步骤(2)中生物素化病毒单克隆抗体相对应的病毒于反应液D中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度；所述病毒为人体肠道病毒EV71、SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、 出血热病毒、乙肝病毒或柯萨奇B3病毒；(6)将量子点的荧光强度回升值对应于病毒浓度作图，得到定量检测病毒的工作曲线；或将比色皿或比色管放置于紫外分析仪中，用紫外灯激发样品溶液，观察到不同颜色，用数码相机拍照，通过溶液颜色变化对病毒进行半定量检测。本方法用于人体肠道病毒EV71和柯萨奇B3病毒(CVB3)的定量检测,可在1_15 分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测病毒溶液加入反应液D中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，以量子点的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析；或用紫外灯激发样品溶液，并用数码相机拍照，通过溶液颜色变化即可实现病毒的半定量检测。本发明方法与现有技术相比，具有以下优点和效果与蛋白质阵列分析及芯片技术相比，本方法灵敏度高、简便快速、选择性好、通用性强。将本方法应用于抗原-抗体反应检测病毒，将使现有的标准检测技术发生根本性变革。如果有多种病毒需要进行检测，只要选择多种颜色的量子点与病毒抗体进行偶联再用氧化石墨烯猝灭其荧光后形成病毒捕获探针，便可以建立一种通用的多种病毒检测的新技术。基于量子点和氧化石墨烯均相免疫荧光检测病毒的方法将实现生物样品如人体肠道病毒EV71, SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒、柯萨奇B3病毒的实时、快速、均相、灵敏及选择性检测。本发明的检测方法响应快，亲水性好，灵敏度高，选择性好，通用性强。


图I为绿色量子点(QDs)的紫外吸收和荧光发射光谱图(实施例I)；图2为红色量子点(QDs)的紫外吸收和荧光发射光谱图(实施例I)；图3-1和图3-2分别为氧化石墨烯猝灭绿色量子点与病毒抗体偶联物的荧光图和猝灭曲线图(实施例I);图4-1和图4-2分别为氧化石墨烯猝灭红色量子点与病毒抗体偶联物的荧光图和猝灭曲线图(实施例I);图5为人体肠道病毒EV71和CVB3免疫荧光识别和检测过程的示意图；与病毒抗体偶联的量子点受到氧化石墨烯的影响使荧光猝灭，加入抗原EV71和 CVB3后，由于抗体-抗原间的特异性相互作用，使荧光回升。图6为定性识别人体肠道病毒EV71和CVB3的荧光图(实施例I)；
(其中(A)中a为量子点的荧光，b为氧化石墨烯猝灭量子点后的荧光；(B)，(C)， (D)中a为加入病毒后的荧光，b为未加病毒前的荧光)图7为同时定量检测人体肠道病毒EV71和CVB3的工作曲线(实施例I)。
具体实施例方式下面申请人将结合具体的实施例对本发明方法作进一步的描述，以便本领域技术人员进一步理解本发明，但以下实施例并不以任何形式限制本发明的保护范围。实施例I :一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测病毒的方法，其步骤为(I)将发射波长分别为520nm和610nm的绿色和红色SA-CdSe量子点(均购自武汉珈源量子点技术开发有限公司)分别溶解于15mM pH 8. O的磷酸盐缓冲溶液，得到量子点浓度均为I. OX 10_9mol/L的两份反应液；(2)将步骤(I)得到的绿色量子点的反应液与生物素化的EV71病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.2X10_9mol/L的反应液 B ；(3)将步骤(I)得到的红色量子点的反应液与生物素化的CVB3病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.4X10_9mol/L的反应液 C；(4)将反应液B和反应液C等体积混合后加入10ng/mL的氧化石墨烯，得到反应液 D ；(5)取反应液D 600 μ L于微量荧光比色皿中，以激发波长400nm激发，测量其在发射波长350 700nm处的荧光强度，得到量子点被氧化石墨烯猝灭后的荧光强度；(6)加入3 μ L不同浓度的被测样品EV71和/或CVB3病毒于前述600 μ L反应液 D中(加入后反应液中EV71、CVB3病毒浓度范围均为Ι-lOOOng/mL)，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处(520nm和610nm)的荧光强度，得到病毒使量子点荧光回升的荧光强度；(7)根据量子点的荧光强度回升值对EV71和CVB3病毒浓度作图，可以得到同时定量检测EV71和CVB3病毒的工作曲线。该荧光均相免疫检测EV71病毒的方法检出限达到0.42ng/mL，线性范围为 l-14ng/mL ;检测CVB3病毒的检出限达到O. 39ng/mL，线性范围为l_19ng/mL。加标回收实验表明回收率在98. 7% -101. 8%之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显地看到加入不同浓度的病毒EV71和CVB3后，溶液颜色发生明显变化，检测范围为10ng/mL-100ng/mL，检测下限为 10ng/mLo实施例2 一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测病毒的方法，其步骤为(I)将绿色和红色SA-CdTe量子点(均购自武汉珈源量子点技术开发有限公司) 分别溶解于15mM pH 8. O的磷酸盐缓冲溶液，得到量子点浓度均为I. O X 10_1(lmOl/L的两份反应液；
(2)将步骤(I)得到的绿色量子点的反应液与生物素化的禽流感病毒HlNl单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2. 2X 10_1(lmOl/L的反应液B ；(3)将步骤(I)得到的红色量子点的反应液与生物素化的禽流感病毒H9N2单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2. 4X 10_1(lmOl/L的反应液C ；(4)将反应液B和反应液C等体积混合后加入10ng/mL的氧化石墨烯，得到反应液 D ；(5)取反应液D600 μ L于微量荧光比色皿中，以激发波长385nm激发，测量其在发射波长350 700nm处的荧光强度，得到量子点被氧化石墨烯猝灭后的荧光强度；(6)加入3 μ L不同浓度的被测样品HlNl和/或Η9Ν2病毒于前述600 μ L反应液 D中(加入后反应液中HlNl、Η9Ν2病毒浓度范围均为Ι-lOOOng/mL)，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，得到病毒使量子点荧光回升的荧光强度；(7)根据量子点的荧光强度回升值对HlNl和H9N2病毒浓度作图，可以得到同时定量检测HlNl和H9N2病毒的工作曲线。该荧光均相免疫检测HlNl病毒的方法检出限达到O. 24ng/mL,线性范围为 l-16ng/mL ;检测H9N2病毒的检出限达到O. 28ng/mL，线性范围为l_25ng/mL。加标回收实验表明回收率在98. 8%-103. 4%之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显地看到加入不同浓度的病毒HlNl和H9N2后，溶液颜色发生明显变化，检测范围为10ng/mL-100ng/mL，检测下限为 10ng/mLo实施例3一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测病毒的方法，其步骤为(I)将绿色和红色SA-CdSe/ZnS量子点(均购自武汉珈源量子点技术开发有限公司)分别溶解于15mM pH 8. O的磷酸盐缓冲溶液，得到量子点浓度均为I. O X 10_nmol/L的两份反应液；(2)将步骤(I)得到的绿色量子点的反应液与生物素化的炭疽病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.7X10_9mol/L的反应液 B ；(3)将步骤(I)得到的红色量子点的反应液与生物素化的出血热病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.9X10_9mol/L的反应液 C；(4)将反应液B和反应液C等体积混合后加入10ng/mL的氧化石墨烯，得到反应液 D ；(5)取反应液D 600 μ L于微量荧光比色皿中，以激发波长360nm激发，测量其在发射波长350 700nm处的荧光强度，得到量子点被氧化石墨烯猝灭后的荧光强度；(6)加入3 μ L不同浓度的被测样品炭疽病毒和/或出血热病毒于前述600 μ L反应液D中(加入后反应液中炭疽病毒、出血热病毒浓度范围均为0. 01-100ng/mL)，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，得到病毒使量子点荧光回升的荧光强度；(7)根据量子点的荧光强度回升值对炭疽病毒和出血热病毒浓度作图，可以得到定量同时检测炭疽病毒和出血热病毒的工作曲线。该荧光均相免疫检测炭疽病毒的方法检出限达到0.45ng/mL，线性范围为 l-24ng/mL ;检测出血热病毒的检出限达到O. 63ng/mL,线性范围为l_32ng/mL。加标回收实验表明回收率在97. 5% -104. 6%之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显地看到加入不同浓度的炭疽病毒和出血热病毒后，溶液颜色发生明显变化，检测范围为10ng/mL-100ng/mL，检测下限为10ng/mL。实施例4一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测病毒的方法，其步骤为(I)将绿色和红色SA-CdSe/CdS/ZnS量子点(均购自武汉珈源量子点技术开发有限公司)分别溶解于15mM pH 8. O的磷酸盐缓冲溶液，得到量子点浓度均为I. O X I(T1V)I/ L的两份反应液；(2)将步骤(I)得到的绿色量子点的反应液与生物素化的艾滋病病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.6X10_9mol/L的反应液 B ；(3)将步骤(I)得到的红色量子点的反应液与生物素化的SARS病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.8X10_9mol/L的反应液 C；(4)将反应液B和反应液C等体积混合后加入10ng/mL的氧化石墨烯，得到反应液 D ；(5)取反应液D 600 μ L于微量荧光比色皿中，以激发波长280nm激发，测量其在发射波长350 700nm处的荧光强度，得到量子点被氧化石墨烯猝灭后的荧光强度；(6)加入3 μ L不同浓度的被测样品艾滋病病毒和/或SARS病毒于前述反应液D 中(加入后反应液中艾滋病病毒、SARS病毒浓度范围均为Ι-lOOOng/mL)，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，得到病毒使量子点荧光回升的荧光强度；(7)根据量子点的荧光强度回升值对艾滋病病毒和SARS病毒浓度作图，可以得到同时定量检测艾滋病病毒和SARS病毒的工作曲线。该荧光均相免疫检测艾滋病病毒的方法检出限达到O. 86ng/mL,线性范围为 l-56ng/mL ;检测SARS病毒的检出限达到O. 74ng/mL，线性范围为l_69ng/mL。加标回收实验表明回收率在96. 8%-105. 9%之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显地看到加入不同浓度的艾滋病病毒和SARS病毒后，溶液颜色发生明显变化，检测范围为10ng/mL-100ng/mL，检测下限为10ng/mL。实施例5一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测病毒的方法，其步骤为(I)将绿色和红色SA-CdSe = Mn2+量子点(均购自武汉珈源量子点技术开发有限公司)分别溶解于15mM pH 8. O的磷酸盐缓冲溶液，得到量子点浓度均为I. O X 10_9mol/L的两份反应液；(2)将步骤(I)得到的绿色量子点的反应液与生物素化的禽流感病毒H5N1单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.9X10_9mol/L的反应液B ；(3)将步骤(I)得到的红色量子点的反应液与生物素化的禽流感病毒H3N2单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.3X10_9mol/L的反应液C ；(4)将反应液B和反应液C等体积混合后加入10ng/mL的氧化石墨烯，得到反应液 D ；(5)取反应液D 600 μ L于微量荧光比色皿中，以激发波长300nm激发，测量其在发射波长350 700nm处的荧光强度，得到量子点被氧化石墨烯猝灭后的荧光强度；(6)加入3yL不同浓度的被测样品禽流感病毒H5N1和/或禽流感病毒H3N2 于前述反应液D中(加入后反应液中禽流感病毒H5N1、禽流感病毒H3N2浓度范围均为 Ι-lOOOng/mL)，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，得到病毒使量子点荧光回升的荧光强度；(7)根据量子点的荧光强度回升值对禽流感病毒H5N1和禽流感病毒H3N2浓度作图，可以得到同时定量检测禽流感病毒H5N1和禽流感病毒H3N2的工作曲线。该荧光均相免疫检测禽流感H5N1病毒的方法检出限达到O. 46ng/mL,线性范围为 l-35ng/mL ;检测禽流感病毒H3N2的检出限达到O. 58ng/mL，线性范围为l_48ng/mL。加标回收实验表明回收率在94. 6% -102. 6%之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显地看到加入不同浓度的禽流感病毒H5N1和H3N2后，溶液颜色发生明显变化，检测范围为10ng/mL-100ng/ mL,检测下限为10ng/mL。实施例6一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测病毒的方法，其步骤为(I)将绿色和红色SA-CdTe = Zn2+量子点(均购自武汉珈源量子点技术开发有限公司)分别溶解于15mM pH 8. O的磷酸盐缓冲溶液，得到量子点浓度均为I. O X 10_nmol/L的两份反应液；(2)将步骤(I)得到的绿色量子点的反应液与生物素化的出血热病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.6X10_9mol/L的反应液 B ；(3)将步骤(I)得到的红色量子点的反应液与生物素化的艾滋病病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物浓度为2.5X10_9mol/L的反应液 C；(4)将反应液B和反应液C等体积混合后加入10ng/mL的氧化石墨烯，得到反应液 D ；(5)取反应液D 600 μ L于微量荧光比色皿中，以激发波长330nm激发，测量其在发射波长350 700nm处的荧光强度，得到量子点被氧化石墨烯猝灭后的荧光强度；(6)加入3 μ L不同浓度的被测样品出血热病毒和/或艾滋病病毒于前述600 μ L反应液D中(加入后反应液中出血热病毒、艾滋病病毒浓度范围均为l-1000ng/mL)，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，得到病毒使量子点荧光回升的荧光强度；(7)根据量子点的荧光强度回升值对出血热病毒和艾滋病病毒浓度作图，可以得到同时定量检测出血热病毒和艾滋病病毒的工作曲线。该荧光均相免疫检测出血热病毒的方法检出限达到O. 32ng/mL，线性范围为 l-58ng/mL ;检测艾滋病病毒的检出限达到O. 48ng/mL,线性范围为l_38ng/mL。加标回收实验表明回收率在97. 3% -104. 2%之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显地看到加入不同浓度的病毒出血热病毒和艾滋病病毒后，溶液颜色发生明显变化，检测范围为10ng/mL-100ng/ mL,检测下限为10ng/mL。
权利要求
1.一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测病毒的方法，其步骤如下首先将一定量的不同颜色的链霉亲和素修饰的量子点溶液分别与不同种类病毒的生物素化抗体混合制备偶联物，将不同颜色的量子点偶联物混合后再加入过量氧化石墨烯使量子点的突光被粹灭，再加入与抗体相对应的病毒后，量子点的突光分别回升，然后根据不同颜色量子点的荧光强度是否回升对病毒种类进行定性识别，或根据量子点的荧光强度回升强度值对病毒含量进行定量检测，或在紫外分析仪中用紫外灯激发样品溶液进行拍照， 得到可视化的图片，通过颜色变化对病毒进行半定量检测。
2.根据权利要求I所述的方法，其步骤如下(1)将链霉亲和素修饰的量子点溶解于15mMpH 8. O的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为I. OX 10_n-l. OX 10_9mol/L的链霉亲和素修饰的量子点反应液；所述链霉亲和素修饰的量子点为SA-CdSe、SA-CdTe、SA-CdSe/ZnS、SA-CdTe/ZnS、 SA-CdTe/CdS/ZnS、SA-CdSe/CdS/ZnS、SA-CdSe : Mn2+、SA-CdTe : Mn2+、SA-CdSeiZn2+ 或 SA-CdTe: Zn2+ ；(2)将步骤(I)得到的链霉亲和素修饰的量子点反应液与生物素化病毒单克隆抗体按照量子点与抗体摩尔比30 I进行偶联反应，得偶联物反应液B;(3)向反应液B中加入过量的荧光猝灭剂氧化石墨烯，使氧化石墨烯的终浓度为IOng/ mL,得到反应液D ；(4)以激发波长280 480nm激发，测定反应液D在发射波长350 700nm处的荧光强度，得到量子点被氧化石墨烯猝灭后的荧光强度；(5)加入不同浓度的与步骤(2)中生物素化病毒单克隆抗体相对应的病毒于反应液D 中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度；所述病毒为人体肠道病毒EV71、SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒、乙肝病毒或柯萨奇B3病毒；(6)将量子点的荧光强度回升值对应于病毒浓度作图，得到定量检测病毒的工作曲线； 或将比色皿或比色管放置于紫外分析仪中，用紫外灯激发样品溶液，观察到不同颜色，用数码相机拍照，通过溶液颜色变化对病毒进行半定量检测。
全文摘要
本明涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，具体公开了一种基于量子点和氧化石墨烯均相免疫检测多种病毒的方法。首先将一定量的不同颜色的链霉亲和素修饰的量子点溶液分别与不同种类病毒的生物素化抗体混合制备偶联物，将不同颜色的量子点偶联物混合后再加入过量氧化石墨烯使量子点的荧光被猝灭，再加入与抗体相对应的病毒后，量子点的荧光分别回升，然后根据不同颜色量子点的荧光强度是否回升对病毒种类进行定性识别，或根据量子点的荧光强度回升强度值对病毒含量进行定量检测，或在紫外分析仪中用紫外灯激发样品溶液进行拍照，得到可视化的图片，通过颜色变化对病毒进行半定量检测。
文档编号G01N21/64GK102608090SQ20121007396
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者何治柯, 陈璐 申请人:武汉大学