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专利名称：酶法测定血清镁离子试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶学检测技术，特别是提供一种将丙酮酸激酶(EC2.7.1.40,PK)偶联乳酸脱氢酶(EC1.1.1.27,LDH)用于测定血清镁离子的酶法试剂。
镁离子是细胞内的主要阳离子，含量仅次于钾离子，其在细胞外液中的浓度为0.7-1.10mmol/L。镁离子参与机体许多生理功能，能与细胞内许多重要成分，如ATP等形成复合物，激活多种酶体系，从而对葡萄糖酵解、脂肪、蛋白质、核酸、辅酶等形成，肌肉收缩，抗体代谢过程中的转甲基作用等起调节作用；其又是氧化磷酸化的重要辅助因子，对线粒体功能有重要影响，特别与能量代谢有关；在蛋白质合成过程中，镁离子也参与mRNA和蛋白质转录等机制；另外，镁离子对维持神经肌肉的兴奋性也起重要作用。镁离子缺乏或过多，神经肌肉系统常是早期症状之一。因此血清镁离子浓度改变的临床意义越来越为医学家们所重视。
血清镁离子的检测方法很多。如火焰光度法、荧光法、原子吸收分光光度法(AAS)、层析法、离子色谱法、染料比色法、和酶法等。其中以AAS法最准确、敏感、特异性也最好，但由于仪器价格非常昂贵，不易自动化操作及必须使用可燃性气体所带来的潜在危险，而很难在临床实验室推广普及。火焰光度法、荧光法、层析法、离子色谱法测定镁离子虽有报道，但临床实际应用并不多见。染料比色法是根据在碱性环境下，染料与镁离子鳌合而改变颜色这一基础建立的，包括二甲苯胺蓝法(XLB)、达蛋黄法、Calmagite法、和甲基麝香草酚蓝法(MTB)。达蛋黄法的空白值较高、干扰较大、特异性较差、测定误差率超过30％，其余的几种比色法因使用简便、经济、延用至今，尤其是Calmagite法和甲基麝香草酚蓝法(MTB)现被卫生部推荐为血清镁离子测定的常规方法。但此类方法会不同程度受到阳离子或胆红素的干扰，也会使pH发生变化而不稳定，工作试剂须新鲜配制或反复校正，为增加试剂稳定性，需加入剧毒剂氰化物，因而对操作人员有潜在的危险。
1959年，Baum和Czok就提出了用异柠檬酸脱氢酶(EC1.1.1.42,ICD)来测定血清镁离子的方法，但由于种种原因，此方法一直未被临床所接受。直到近十余年，酶法在测定血清镁离子方面才得到进一步的发展。据统计，约有三百多种酶可被镁离子激活，依据这一原理，各国学者相继报道了采用酶偶联技术，测定血清镁离子的不同酶学方法。如Tabata等于1985年，报告己糖激酶(EC2.7.1.1,HK)偶联葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC1.1.1.49,G6PDH)的方法；1986年，他们又报道了用葡萄糖激酶(EC2.7.1.2,Gluk)取代HK，并偶联G6PDH的方法；同年，Wimmer等报告了甘油激酶(EC2.7.1.30,GK)偶联甘油-3-磷酸氧化酶(EC1.1.3.2l,GPO)和过氧化物酶(EC1.11.1.7,POD)的方法；1989年，Fossati等又报道了根据Tabata方法改进的Gluk偶联G6PDH的方法；1991年，Suzuki等报告了用磷酸葡萄糖变位酶(EC5.4.2.2,PGM)偶联G6PDH的方法。
上述四种方法除甘油激酶法外，都是催化葡萄糖1-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，再偶联G6PDH催化6-磷酸葡萄糖和NADP生成6-磷酸葡萄糖酸内酯和NADPH，通过340nm波长时NADPH引起的吸光度的增加，来间接计算血清镁离子的浓度。从费用上，偶联G6PDH的方法，配制一升试剂的费用，大约为4000至7000元人民币；按甘油激酶发，配制一升试剂的费用就更高，仅进口工具酶的费用在一万八千元人民币以上，而且，此方法还未解决钙离子的干扰问题。这些均成为阻碍酶法进一步推广的原因。
1995年，日本的Fujita等人报告了用异柠檬脱氢酶测定镁离子的方法，并使用生化技术对ICD进行修饰，以提高此酶在水溶液中的稳定性，1996年，英国人Stone等人根据日本人发表的文章也成功的建立了此种方法，并使修饰后的酶稳定性从未修饰前的两周延长到四周以上。单配制一升试剂所需ICD和NADP的费用至少也要一万七千元以上。
本发明的目的在于提供将丙酮酸激酶偶联乳酸脱氢酶用于测定血清镁离子的酶法试剂，且准确度高，精密度好，测定范围宽，抗干扰能力强，相关性、稳定性好。
本发明属于对无机离子的酶法测定研究，基于研究中镁离子对兔肌丙酮酸激酶有着明显的激活作用这一发现，丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase,PK,EC2.7.1.40)又叫三磷酸腺苷丙酮酸磷酸转移酶，是调节糖酵解的三个限速酶之一。PK在有锰离子和镁离子存在情况下催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，钾和氨离子在有镁离子存在情况下，可使PK活性大大增强，这一原理被本研究用来测定镁离子浓度。由于反应产物丙酮酸并不能直接指示PK催化反应的程度，需偶联LDH系统来间接指示PK活性或产物生成量。乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH,EC1.1.1.27)是动物体内含量最多的酶之一，广泛存在于动物组织脏器内。作为工具酶，主要催化丙酮酸与乳酸之间的氧化与还原反应，同时伴有NADH和NAD之间的转换，NADH的最大吸收峰在340nm，故其浓度变化可使340nm波长下的吸光度发生变化，把LDH偶联到PK系统进行血清镁离子的测定。PK与LDH偶联反应原理如下PKPEP+ADP--→PYRUVATE+ATPMg++LDHPYRUVATE+NADH+H+--→LACTATE+NAD+反应原理磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和二磷酸腺苷(ADP)在丙酮酸激酶(PK)催化下生成丙酮酸(Pyruvate)和三磷酸腺苷(ATP)，丙酮酸又与乳酸脱氢酶系统偶联，经乳酸脱氢酶(LDH)催化生成乳酸(Lactate)，同时NADH氧化成NAD，镁离子的存在可使丙酮酸激酶活性显著增强，故NADH在340nm波长吸光度的变化可以间接反映血清镁离子的浓度。
基于上述反应原理，本发明的试剂配方由下述浓度的R1、R2组成，其中，R1三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 110.00mmol/L，氯化钾(KCL)25.00-50.00mmol/L，乳酸脱氢酶(LDH)1500-4000U/L，丙酮酸激酶(PK)500--1300U/L，二磷酸腺苷(ADP)1.50-6.00mmol/L，还原性辅酶I(NADH)0.25-0.50mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)2.00-6.00mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)2.00-50.00mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。
上述试剂来源三羟甲基氨基甲烷(Tris,AR,上海试剂三厂)；丙酮酸激酶(PK,Sigma，比活性40U/mg冻干粉，上海试剂三厂)；乳酸脱氢酶(LDH，比活性30U/mg冻干粉，上海试剂三厂)；磷酸烯醇式丙酮酸(PEP,AR，上海试剂三厂)；还原性辅酶I(NADH,上海试剂三厂)；二磷酸腺苷(ADP，上海东风生化厂)；氯化钾(KCL,AR，上海东风生化厂)；乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA，华北特种化学试剂开发中心)。
本发明采用常规方法配制，其中Tris-HCL缓冲液的配制准确称取Tris1.21g加水溶解，用1mol/L HCL调pH至7.4(25℃)，再用去离子水稀释至100ml，置于4℃保存。
本发明自动分析参数的确定。Cobas Mira自动生化分析仪的测定参数如下Measurement Mode:Absorb,ReactionMode:R_S_SR1,CalibrationMode:StdNonlin,ReagentBlank:Reag/Sol,Wavelength:340nm,DecimalPosition:2,Unit:mmol/L,SampleCycle:1,Vol:15μl,Dil:5μl,ReagentCycle:1,Vol:160μl,StartReagentlCycle:2,Vol:40μl,Dil:0μl,Reac.Direction:Decrease,CalcStepA:Endpoint,ReadingFirst:3,Last:8,Calib.Interva1:EachRun,Std_1:0.00mmol/L,Std_2:0.40mmol/L,Std_3:0.80mmol/L,Std_4:1.40mmol/L,Std_5:2.00mmol/L,Replicate:Single,Deviation:10.0％.
Kedy Ⅲ Snijders半自动生化分析仪的测定参数如下TypeofTest:FixedTime,Wavelength:340nm,Temperature37℃,Unit:mmol/L,PathologicLow:0.700,pathologic High:1.100,Aspiration Volume:500μl,Sample Volume:60μl,Reagent 1 Volume:480μl,Reagent 2 Volume:120μl,DelayTime:40seconds,MeasureTime:60seconds,Standard 1:0.40,Standard 2:0.80,Standard 3:1.40,Standard 4:2.00mmol/L.
本发明的实验研究1阳离子对丙酮酸激酶活性的影响仪器岛津UV-240、Ciba-Corning2800分光光度计和HHW21-CR420型电热恒温水浴箱。试剂0.1mol,pH7.4,Tris-HCL缓冲液、ADP、PEP、NADH、LDH和PK；样本(S)为50mmol/L的钾、钠、钙、锂、锰、氨和镁离子溶液；实验用水均为去离子水。试剂(R1)由ADP、LDH、PK和NADH组成，试剂(R2)主要为PEP。测定参数温度37℃,340nm,R1:1.0ml,R2:0.1ml,S:0.025ml，稀释液0.125ml。测定步骤将R1和样本加入试管中，37℃水浴5分钟以上，加入R2(持续在37℃水浴中)后，立即记录单位时间内的吸光度变化(ΔA/min)。
结论锰和镁离子是PK的直接激动剂，而钾和氨离子实际上仅是其间接激活剂，氨离子对PK的间接激活作用显著大于钾离子。钙离子PK的抑制剂，由此证明使用丙酮酸激酶法测定镁离子，一定要先解决钙离子的干扰问题。
2准确性研究(1)与定值血清的比较采用双份(高、正常值)进口的Boehreiger Mannheim(BM)公司定值血清，高值血清批号为Lot/187891-187894No.651265，正常值血清批号为Lot/189636-189639No.651257。见表一，结果表明，准确性相当满意。
(2)线性研究配制0.1mol/L的醋酸钙和硫酸镁溶液，分别稀释配制成为含镁离子0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0mmol/L的系列标准液，标准液中的钙离子浓度均为2.5mmol/L。将上述标准液在Cobas Mira自动分析仪上测定两次，每次每份标本测三遍，回归方程Y=0.181x+0.011,r=0.9998,P＜0.001，见图一，结果表明，镁离子浓度在0-2.0mmol/L范围内时，吸光度与浓度有良好的线性关系。正常血清镁离子浓度一般在0.7-1.1mmol/L，故该线性范围能满足临床需要。
(3)回收实验以镁离子浓度为0.2mmol/L的基础值，分别再加入镁离子0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L，使钾离子的理论值分别成为0.8、1.0、1.2和1.4mmol/L，进行回收实验。见表二，由表中计算镁离子的回收率平均为100.76％，表明本方法的回收率相当满意。
3精密度研究批内精密度分别以正常值和高值血清在同一时间，同时重复测定15次，并计算其均值、标准差及变异系数，结果见表三；日间精密度将上述血清每天测定一次，连续两遍共测定八天，计算其均值、标准值和变异系数，结果见表四；结果表明批内及日间精密度平均仅在2.01和3.12％，此结果与其他酶法作者报告的结果非常相似，因此用此酶学方法测定血清镁离子，完全符合重复性要求。
4干扰试验选择内源性干扰物质钾、氨、钙、锰、铜、锌、铁离子，胆红素、甘油三酯和血红蛋白进行干扰实验。在进行阳离子干扰实验时，设立对照组与加入不同浓度阳离子的实验组进行比较，镁离子浓度均相同，计算同时测定10次的对照组镁离子浓度的均值和标准差，各实验组则同时测定三次，并计算均值。评价干扰程度则根据实验组均值是否在对照组的均值±2标准差(means±2S)范围内，超出此范围即为有干扰。
对照组与实验组的镁离子浓度均为0.80mmol/L。测定结果对照组x±S为0.811±0.020mmol/L，对照组范围x±2S为0.771-0.851mmol/L。
实验组A.钾离子加入不同浓度的氯化钾，使钾离子反应浓度分别为6.0、8.0和10.0mmol/L，经测定三组的镁离子均值分别为0.789、0.773和0.782mmol/L，因此10mmol/L的钾离子对本方法无干扰。
B．氨离子血清氨离子浓度上限为0.056mmol/L。干扰试验样本中加入的硫酸氨浓度反应分别为0.5、0.75和1.0mmol/L，为正常上限的8.9、13.4和17.9倍，镁离子测定值为0.839、0.802和0.821mmol/L，无干扰。
C钙离子钙离子是PK的抑制剂，已为本发明所证实，干扰试验中分别加入醋酸钙6.0、8.0和10.0mmol/L，镁离子测定值分别为0.826、0.845和0.844mmol/L，未见钙离子的干扰，而Wimmer等用甘油激酶法测定镁离子时，样本中钙离子在5.0mmol/L时，即对测定结果产生显著的负干扰作用。
D锰离子锰离子和镁离子一样，对许多酶具有激活作用，锰离子在血清中属微量元素，其血清浓度上限为0.013mmol/L。本干扰实验中加入1.0mmol/L，未见干扰。
E铜离子血清铜离子浓度的正常上限为0.025mmol/L，本试验中分别加入硫酸铜0.05、0.075和0.10mmol/L，镁离子测定值分别为0.801、0.837和0.792mmol/L，未见铜离子的干扰。
F锌离子血清锌离子浓度的正常上限0.025mmol/L，本干扰试验中分别加入二氧化锌0.05、0.07和0.10mmol/L，镁离子测定值分别为0.804、0.823和0.823mmol/L，未见锌离子干扰。
G铁离子血清铁离子浓度的正常上限为0.03mmol/L，本干扰试验中加入三氯化铁达0.10mmol/L时，镁离子浓度测定值为0.848mmol/L，未见铁离子的干扰。
胆红素、甘油三酯和血红蛋白干扰试验使用血清测定，并按下列公式计算干扰百分数p=[(AM-CM)/CM]×100，此公式中p为干扰百分数，AM为实际测定值，CM在这里为理论值，当p≤︱3.0︱时(︱3.0︱表示绝对值，相当于±3％)，被视为无干扰。
A胆红素干扰试验在高值血清中加入胆红素100mmol/L(5.85mg/dl)，使其镁离子理论值为1.62mmol/L，然后，用本方法测定为1.637mmol/L,p为1.049％，无干扰。
B甘油三酯干扰试验在血清中加入不同量的高甘油三酯血清，使甘油三酯浓度分别为4.86和7.3mmol/L，镁离子理论浓度分别为0.949和1.243mmol/L，本方法测定值为0.947和1.230mmol/L，干扰百分数p分别为-0.211％和-1.046％，未见干扰。
C血红蛋白干扰试验使用血红蛋白标准液(141g/L)进行干扰试验。分别加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0G/L血红蛋白，使血清镁离子理论浓度依次为0.986、0.972、0.944、0.916、0.888和0.860mmol/L，而实际测定浓度为1.002、0.970、0.963、0.934、0.865和0.854mmol/L，干扰百分数p分别为1.623、-0.206、2.013、1.965、-2.59和-0.698％，均小于±3.0％，因此，判定血红蛋白对此方法无干扰。
5与其它方法的方法学比较目前临床实验室常用的比色法是二甲苯胺蓝法(XLB)、Calmagite法(CAL)和甲基麝香草酚蓝法(MTB),CAL法和MTB法现仍被我国卫生部推荐为血清镁离子测定的常规方法。特作相关性研究。
(1)与原子吸收法(AAS)的方法学比较AAS法由天津市第一中心医院，微量元素室使用原子吸收分光光度计(Smith-Hieftje-22,Termo Jarrall Ash,USA)和核工业部北京化工冶金研究院生产，批号为080132，浓度为100mg/ml的国家二级镁标液GBW(E)，稀释后测定，标本由天和医院生化室提供，随机取8份病人血清及两份BM公司的定值血清(高及正常值)，用两种方法测定，数据经统计学处理AAS均值±标准差为0.936±0.249mmol/L；本法为0.905±0.254mmol/L,t=0.277,p＞0.5,两种方法的均值无显著性差异；回归方程本法Y=0.999x-0.03,r=0.980,n=10,p＜0.01，见图二，两种方法高度相关，bias(偏差)=0.031mmol/L,Sy/x=0.054mmol/L,Sd=0.051mmol/L,t=1.824,p＞0.1，故两种方法的偏差无统计学意义。
(2)与MTB发的方法学比较仪器为721分光光度计(上海第三分析仪器厂)，试剂为北京化工厂生产镁试剂盒(MTB)，批号970411，依照试剂盒说明书测定，标本由天和医院生化室提供，随机取30份新鲜病人血清及一份BM公司的定值血清(高值)，同时测定，见图三。本法与MTB法的回归方程Y=0.011+1.172x,r=0.922,n=31,p＜0.01。根据测定结果进行统计学处理，计算方法均值、标准差及t检验MTB法为0.648±0.142mmol/L；本法为0.77±0.18mmol/L,t=2.979,p＜0.005,可见此两种方法的相关性虽好，但有一显著的方法学差异，此误差是由于所使用的北京化工厂生产的批号为970411的镁试剂盒(MTB法)，使测定结果偏低所致，此由BM定值血清结果也得到证实，高值为1.62(1.43-1.81)mmol/L的定值血清，MTB法只测得为1.289mmol/L(失控)，绝对误差达0.351mmol/L(21.40％)，而本法为1.60mmol/L绝对误差仅为0.02mmol/L(1.23％)。后经多次重复结论相同。
(3)与XLB法的方法学的比较仪器721分光光度计(上海第三分析仪器厂)；试剂中生生物工程高技术公司生产镁试剂盒，批号970905，按照说明书测定；标本由天和医院生化室提供，随机取45份病人血清及两份BM公司的定值血清(高值和正常值)，同时测定，见图四。本法与XLB法的回归方程Y=0.118+0.827x,r=0.933,n=47,p＜0.01。根据测定结果进行统2计学处理，计算方法均值、标准差及t检验XLB法为0.796±0.179mmol/L，本法为0.777±0.159mmol/L,t=0.543,p＞0.5,此两种方法的相关性很好，之间的偏差无统计学意义。
(4)与CAL法的方法学比较CAL法由天津市中医学院第一附属医院生化室使用Beckman CX5自动生化分析仪和Beckman标准液及试剂盒测定，标本亦来自中医学院第一附属医院生化室，随机取31份病人血清及两份BM公司的定值血清(高值及正常值)。以上标本分别使用两种方法在两个仪器上测定。数据经统计学处理计算均值±标准差，CAL法为0.852±0.224mmol/L；本法为0.800±0.229mmol/L,t=0.929,p＞0.3，说明两种方法的均值无显著性差异；回归方程Y=0.982x-0.037,r=0.960,n=33,p＜0.01，见图五，两种方法高度相关，两种方法间的偏差无统计学意义。
6试剂稳定性观察将配制好的应用试剂置于4℃冰箱冷藏，并用来连续7天测定两种浓度的标准品。结果表明本试剂在配制为应用液后，置于4℃冷藏保存，至少可以稳定5天，此期间对测定结果无影响，说明试剂的稳定性很好。
实施例将本试剂在Kedy Ⅲ半自动生化分析仪上检查准确性。检查准确性使用BM公司两个批号的定值血清。标准液的配制用干燥的醋酸钙和硫酸镁分别配制成100mmol/L的储存试剂，试验前再用去离子水精确稀释成含镁离子0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0mmol/L的标准液，标准液中的钙离子浓度均为2.5mmol/L。试剂配方为R1三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 110.00mmol/L，氯化钾(KCL)41.25mmol/L，乳酸脱氢酶(LDH)2250U/L，丙酮酸激酶(PK)750U/L，二磷酸腺苷(ADP)2.28mmol/L，还原性辅酶I(NADH)0.41mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)3.85mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)16.50mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。操作步骤准确称取R1 480μl注入2ml试管中，再依次分别加入60μl标准液与样品，混匀，置于恒温水箱37℃孵育5分钟以上，再准确加入启动试剂R2 120μl，立即混匀，按前述参数测定，结果见表五，因此本试剂可广泛用于国内各种规模的实验室，各种自动或半自动生化分析仪，更因其成本低廉而有利于推广使用。
对本发明的临床试用观察(天津市第三中心医院检验科)仪器与方法仪器为ToshibaTBA-40FR自动生化分析仪；所使用试剂，标准液均由本发明配制提供，定值血清来自BM公司，A.高值血清批号185259，镁离子原子吸收法(AAS)靶值1.65(1.45-1.85)mmol/L；二甲基苯胺蓝法(XLB)靶值1069(1.49-1.89)mmol/L；B.正常值血清批号18968802,AAS法靶值0.88(0.77-0.99)mmol/L,XLB法靶值0.85(0.75-0.95)mmol/L。通过测定定值血清进行准确性评价，并随即选择两份病人血清进行精密度测定。结果见表六及表七，准确性与定值血清的两种方法靶值比较，本方法的测定结果在高值介于两种方法中间，在正常值，则与AAS法更接近。精密度随机选择两份病人血清进行20次测定，并计算批内不精密度，结果低值(0.485mmol/L)与正常值(0.799mmol/L)的平均不精密度仅为0.829％。
表一、测定进口定值血清结果定值血清靶值(范围) 测定值偏差(％)AAS(H)1.62(1.43-1.81)1.6370.017(1.05)XLB(H)1.64(1.44-1.84)1.637-0.003(0.18)AAS(N)0.8(0.77-0.99) 0.858-0.022(2.50)XLB(N)0.85(0.75-0.95)0.8580.008(0.94)表二、回收试验结果基础值 加入值 测定值 回收值回收率(％)0.200.600.817 0.617 102.830.200.801.003 0.803 100.380.201.001.180 0.980 98.000.201.201.422 1.222101.83表三、批内重复测定结果正常值高值 平均C.V(％)Mean 0.8581.637S 0.0210.026CV(％)2.4481.588 2.006表四、日间重复测定结果正常值 高值 平均C.V(％)Mean 0.8701.627S 0.0320.042CV(％) 3.6642.5683.116
表五、半自动测定的准确性结果定值血清 靶值(范围) 测定值偏差(％)AAS(H)1.62(1.43-1.81)1.661 0.041(2.53％)XLB(H)1.64(1.44-1.84)1.661 0.021(1.28％)AAS(N)0.88(0.77-0.99)0.902 0.022(2.50％)XLB(N)0.85(0.75-0.95)0.902 0.052(6.12％)表六、使用本发明的准确性测定结果定值血清靶值(范围)测定值偏差(％)(mmol/L) (PK)183259AAS 1.65(1.45-1.85) 1.68 0.03(1.82％)XLB 1.69(1.49-1.89) 1.68 -0.01(0.59％)18968802AAS 0.88(0.77-0.99) 0.90 0.02(2.27％)XLB 0.85(0.75-0.95) 0.90 0.05(5.88％)表七、批内不精密度测定结果低值正常值 平均(mmol/L)(mmol/L)CV(％)Mean0.485 0.799S 0.005 0.005CV(％) 1.031 0.626 0.829
权利要求
1一种将丙酮酸激酶偶联乳酸脱氢酶用于测定血清镁离子的酶法试剂，其特征在于由下述浓度组份的R1、R2所组成，其中，R1三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4110.00mmol/L，氯化钾(KCL)25.00-50.00mmol/L，乳酸脱氢酶(LDH)1500--4000U/L，丙酮酸激酶(PK)500-1300U/L，二磷酸腺苷(ADP)1.50-6.00mmol/L，还原性辅酶I(NADH)0.25-0.50mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)2.00-6.00mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)2.00--50.00mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。
2如权利要求1所述用于测定血清镁离子的酶法试剂，其特征在于由下述浓度组份的R1、R2所组成，其中，R1三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 110.00mmol/L，氯化钾(KCL)41.25mmol/L，乳酸脱氢酶(LDH)2250U/L，丙酮酸激酶(PK)750U/L，二磷酸腺苷(ADP)2.28mmol/L，还原性辅酶I(NADH)0.41mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)3.85mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)16.50mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。
全文摘要
本发明涉及酶学检测技术，特别是将丙酮酸激酶(EC2.7.1.40，PK)偶联乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27，LDH)用于测定血清镁离子的酶法试剂。研究表明，该试剂准确度高，精密度好，批内平均不精密度< 2.45%，日间平均不精密度< 3.10%，测定范围宽(0.1—2.0mmol/l)，抗干扰能力强，与原子吸收法及比色法有极好的相关性，试剂复溶后(4℃)稳定至少5天，价廉(0.5元/ml)，适用于多种自动生化分析仪和半自动生化仪以及手工测定。且由于价廉，全部试剂国产化而优于目前使用的国外各种酶法试剂。
文档编号G01N33/84GK1227920SQ98123138
公开日1999年9月8日 申请日期1998年12月9日 优先权日1998年12月9日
发明者张孝山, 帅真, 李明润, 李明, 杨彬, 温庭民, 王瑛, 徐海津 申请人:天津市医药科学研究所