专利名称：一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应用以及蓖麻碱的毒性评价方法
一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应用以及蓖麻碱的毒性评价方法技术领域
本发明属于蓖麻碱提取技术领域，尤其是一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应用以及蓖麻碱的毒性评价方法。
背景技术：
玉米象，Sitophilus zeamais (Motschusky),属鞘翅目象甲科,是我国储粮主要害虫之一，也是世界性的重要储粮害虫。它寄生于多种食物中，以玉米、小麦、高粱受灾最重。 主要危害贮存2-3年的陈粮，成虫啃食谷粒，幼虫蛀蚀谷粒。目前主要防治方法是利用马拉硫磷诱杀成虫。已经证明，茴香、八角、黑胡椒粉、红桔油、薄荷脑、樟脑、桉叶油、除虫菊等植物性提取物对储粮害虫有不同程度的防治效果。
赤拟谷盗Tribolium castaneum(Herbst),属鞘翅目拟步甲科,别名拟谷盗。主要�：γ娣郏姑娣鄄剐任叮浞置谖锘购兄掳┪镆槐锦Ｖ饕乐畏椒ㄎ涠成背�、 高温杀虫、磷化铝熏蒸法等。随着可持续植保理论的提出，储粮害虫的治理方法也面临着新挑战，植物性杀虫剂的研究与开发成为研究热点之一。
在农业领域，我国大部分地区一直沿用化学合成剧毒农药进行防治，是农、林、牧业生产中杀虫、灭菌的主导产品。化学合成剧毒农药在粮食、瓜果、蔬菜及牧草表面的残留量多、滞留时间长、不易分解，给人、畜、禽的健康造成了严重的�：�。同时，因防治对象中化学合成农药等有害成分残留量高，给我国的对外贸易造成了巨大损失，并且，化学合成农药毒性大，害虫易产生抗性。
植物源农药具有对人畜毒性低、在环境中易降解、少残留或无残留等特点，因此， 从植物中提取分离有杀虫活性物质，已成为近年来国内外植物保护工作者研究开发的热点。研究发现，蓖麻毒素粗提物对天幕毛虫、桃蚜、小菜蛾等虫有不同程度的杀灭作用，其中对小菜蛾化蛹有较强的抑制作用，化蛹率低于30 %。蓖麻碱则表现为胃毒作用，并具有一定拒食效果。蓖麻碱与Bt结合对甜菜夜蛾也有明显的防治作用。综上所述，蓖麻碱在储粮害虫防治方面的应用前景广阔。
秀丽小杆线虫Caenorhabditis elegans是一种国际公认的模式生物,为多细胞生物。其结构简单、遗传背景清楚，生活周期短，可在实验室大量培养，与其他模型生物相比可以避免个体差异造成的误差，有利于生物毒性评价的标准化与规范化，可用于毒理学研究和毒性评价体系。发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应用以及蓖麻碱的毒性评价方法，本发明利用磁力搅拌提取技术，以水作为提取溶剂， 从蓖麻籽壳和蓖麻老叶中提取高纯度蓖麻碱，利用蓖麻碱防治储粮害虫玉米象和赤拟谷盗，并利用秀丽隐杆线虫对蓖麻碱进行毒性评价，测定线虫致死率、生殖能力、体长和体内酶的活性。
本发明实现目的技术方案如下
I. 一种蓖麻碱的水提方法，其特征在于步骤如下
(I)将蓖麻籽壳蓖麻老叶=5 lm/m的比例进行混合,按水粉碎料=10 I 加水；
(2)将混合粉碎料在60°C恒温水浴，磁力搅拌，回流提取4h ；
(3)用超声波技术再次对上述混合料液进一步提�。耍厥仗崛∫海�
(4)放入50°C干燥箱内进行干燥；
(5)干燥所得固体加入IOOmL蒸馏水，加热溶解并用I %的盐酸调pH为2_3，过滤， 溶液用I %氨水调PH为9，过滤，溶液50°C进行真空干燥，得蓖麻碱。
一种由蓖麻碱的水提方法制备的蓖麻碱水提物，步骤如下
(I)将蓖麻籽壳蓖麻老叶=5 lm/m的比例进行混合,按水粉碎料=10 I 加水；
(2)将混合粉碎料在60°C恒温水�。帕涟瑁亓魈崛�4h ；
(3)用超声波技术再次提取蓖麻碱对上述混合料液进一步提�。耍厥仗崛∫海�
(4)合并步骤(2)和(3)的滤液。
一种蓖麻碱的毒性评价方法，包括如下步骤
(I)蓖麻碱对储粮害虫的趋避效果测定。采用药膜选择法；
(2)蓖麻碱对储粮害虫熏蒸效果测定，采用广口瓶密闭熏蒸法；
(3)线虫对蓖麻碱水提物的毒性评价，蓖麻碱对秀丽线虫的致死率试验；
(4)蓖麻碱对线虫生殖能力影响的试验；
(5)蓖麻碱对线虫体长影响的试验；
(6)蓖麻碱对线虫体内酶活力的影响的试验。
而且，所述步骤(I)的具体方法如下用热水溶液做溶剂将蓖麻碱配成不同浓度的药液，将直径为9cm的圆形滤纸裁成相同的两半，分别滴加0. 5mL的蓖麻碱溶液和等量蒸馏水溶液为对照，待溶剂挥发干后，将两半滤纸用胶纸粘定，置入直径为9cm的培养皿内， 每皿接入试虫30头，将培养皿放入生测室内，温度30°C ±1°C，湿度75% ±5%，分别于处理24、48、72h后观查成虫分布状况，计算其驱避率。
而且，所述步骤(2)的具体方法如下在IOOOmL广口瓶，中央悬挂一个3cm x Ilcm滤纸片，接入30头试虫，迅速用微量加样器分别在滤纸上滴加不同体积lmg/mL蓖麻碱溶液，迅速用瓶塞将瓶口封好，对照用蒸馏水溶剂处理。将各处理瓶置于生测室内，温度 300C ±1°C，湿度75% ±5%，分别于24、48、72h后观查击倒虫数，72h后打开瓶塞，散气后将试虫倒入干净的培养皿内，计算死亡数。
而且，所述步骤(I)的具体方法如下将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖麻碱提取物的NGM板内，实验板中含12. 5mg/L5-Fu并置于20°C下培养。每组实验样本数60条左右，24、48、72、96、1201!，并计算死亡率。对线虫死亡判断标准线虫不无移动及无吞咽动作，轻触后仍无任何反应。
而且，所述步骤(2)的具体方法如下挑取L4期线虫至各组单独转入NGM板，每24h移至新的NGM板，直至线虫产卵期结束；产卵板在20°C培养24h记录子代数目；产卵期为L4期结束到产卵结束；所有数据连续测定10只以上的秀丽线虫，然后取平均值。
而且，所述步骤(3)的具体方法如下从空白平板和含有蓖麻碱的实验板中随机挑取同期化后LI期的线虫，然后用热水将其烫死，在装有视觉透视标度的解剖显微镜下测量其长度；每24h从培养板中挑取线虫，连续测量5d线虫体长，每次每组三个平行，并记录测量结果。
而且，所述步骤(4)的具体方法如下将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖麻碱提取物的NGM板内；
实验板中含12. 5mg/L5-Fu并置于20°C下培养，每组实验样本数60条，用无菌水将线虫定容到200 u L，移入匀浆器中置于冰上匀浆，匀浆液定容至500 u L，加入I % Chaps buffer至ImL,冰上置冷5min, 4°C, 5000r/min离心IOmin,收集上清液4°C保存；
通过测定线虫体内黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。
本发明的优点和积极效果是
I.本发明利用水提方法从蓖麻籽壳和蓖麻老叶中提取高纯度蓖麻碱，利用磁力搅拌提取技术，以水作为提取溶剂，提取方法中不适用有机溶剂，保护环境，对下游再生产和利用有利。
2.本发明操作简单，成本低廉，减少有机试剂使用，保护环境，提取液可直接用于储粮害虫防治，为大规模工业化生产蓖麻碱生物农药提供必要条件。
3.本发明所制得的蓖麻碱粗提物可作为属植物源农药，具有对人畜毒性低、在环境中易降解、少残留或无残留等特点。
4.本发明提供了蓖麻碱水提物的另一重要功能，将其应用于农药领域，蓖麻碱水提物对赤拟谷盗、玉米象等储粮害虫有明显的趋避作用；同时，熏蒸击毙率也较高。
图I为蓖麻碱红外光谱图2为蓖麻碱液相色谱图3为本发明不同浓度蓖麻碱提取物对秀丽线虫的致死作用的影响；
图4为发明蓖麻碱提取物对线虫子代数目的影响；
图5为发明蓖麻碱提取物对线虫体长的影响；
图6为发明蓖麻碱提取物对线虫SOD活性的影响；
图7为发明蓖麻碱提取物对线虫CAT活性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明做进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
一种蓖麻碱的水提方法，步骤如下
(I)将蓖麻籽壳20. Og粉碎过后40目筛，蓖麻老叶4. Og烘干粉碎，用240mL自来水充分混合；本步骤将蓖麻籽壳蓖麻老叶=5 lm/m的比例进行混合,按水粉碎料=10 I加水；
(2)将混合粉碎料在60°C恒温水�。帕涟瑁亓魈崛�4h，
(3)用超声波高频振荡技术再次对上述混合料液进行提取30min，过滤，回收提取液；
本发明是在60°C恒温水浴，磁力搅拌，回流提取4h后，没有进行过滤和回收提取液，直接采用超声波技术再次将混合料液超声30min，过滤，回收提取液。这样做的目的是提高蓖麻碱的提取效率。)
(4)放入50°C干燥箱内进行干燥；
(5)干燥所得固体加入IOOmL蒸馏水，加热溶解并用I %的盐酸调pH为2_3，过滤， 溶液用I %氨水调PH为9，过滤，溶液50°C进行真空干燥，得蓖麻碱固体，纯度为91. I %。
利用蓖麻碱防治储粮害虫玉米象和赤拟谷盗研究杀虫效果，并利用秀丽隐杆线虫对蓖麻碱进行毒性评价，测定线虫致死率、生殖能力、体长和体内酶的活性。
一、蓖麻碱对储粮害虫的趋避效果测定，采用药膜选择法，步骤如下
用热水溶液做溶剂将蓖麻碱配成不同浓度的药液，将直径为9cm的圆形滤纸裁成相同的两半，分别滴加0. 5mL的蓖麻碱溶液和等量蒸馏水溶液为对照。待溶剂挥发干后，将两半滤纸用胶纸粘定,置入直径为9cm的培养皿内。重复3次。每皿接入试虫30头，将培养皿放入生测室内(温度30°C ±1°C，湿度75% ±5% )，分别于处理24、48、72h后观查成虫分布状况，计算其驱避率。
驱避率计算公式为
驱避率(％ )=[(对照边试虫数-处理边试虫数)/对照边试虫数]X 100%
根据驱避率的不同，将驱避效果分为六个等级，分级标准(级别，驱避率)为
0:无忌避作用；
I :0.1% 20%;
2 :20.1% 40%;
3 :40.1% 60%:
4 :60.1% 80%;
5 :80. I % 100%。
具体实例I :用热水做溶剂，将蓖麻碱配制成lmg/mL药液,将直径为9cm的圆形滤纸裁成相同的两半，分别滴加0. 5mL的蓖麻碱溶液0. 5mL和等量蒸馏水溶液为对照。待溶剂挥发干后，将两半滤纸用胶纸粘定后置入直径为9cm的培养皿内。每皿接入玉米象成虫 30头，将培养皿移入生测室内(温度30°C ±1°C，湿度75% ±5% )，72h后观查玉米象分布状况，其驱避率为100%。
具体实例2 :用热水做溶剂,将蓖麻碱配制成lmg/mL药液,将直径为9cm的圆形滤纸裁成相同的两半，分别滴加0. 5mL的蓖麻碱溶液0. 5mL，等量蒸馏水溶液为对照。待溶剂挥发干后，将两半滤纸用胶纸粘定后置入直径为9cm的培养皿内。每皿接入赤拟谷盗成虫 30头，将培养皿移入生测室内(温度30°C ±1°C，湿度75% ±5% )，72h后调查赤拟谷盗分布状况，其驱避率为98. 7%。
二、蓖麻碱对储粮害虫熏蒸效果测定，采用广口瓶密闭熏蒸法，步骤如下
在IOOOmL广口瓶，中央悬挂一个3cm X Ilcm滤纸片,接入30头试虫,迅速用微量加样器分别在滤纸上滴加不同体积lmg/mL蓖麻碱溶液，迅速用瓶塞将瓶口封好。重复3次， 对照用蒸馏水溶剂处理。将各处理瓶置于生测室内(温度30°C ±1°C，湿度75% ±5%)， 分别于24、48、72h后观查击倒虫数，72h后打开瓶塞，散气后将试虫倒入干净的培养皿内， 计算死亡数。
击倒标准在100W白炽灯下观察lmin，虫体无任何刺激性反应视为击倒。
校正击倒率计算公式为
校正击倒率(％ )=(击倒率-对照击倒率)/ (I-对照击倒率)X 100%
校正死亡率计算公式为
校正死亡率(％)=[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]X100%
具体实例I :用热水做溶剂，将蓖麻碱配制成lmg/mL药液，在IOOOmL广口瓶中央悬挂一个3cm X Ilcm滤纸片,接入30头玉米象成虫,迅速用微量加样器分别在滤纸上滴加 lmg/mL蓖麻碱溶液lmL，迅速用瓶塞将瓶口封好。重复3次，对照用蒸馏水溶剂处理。将测试瓶置于生测室内(温度30°C ±1°C，湿度75% ±5%)，72h玉米象击毙率为80. 0%，72h 后打开瓶塞，散气后将试虫倒入干净的培养皿内，玉米象死亡率为72. 3%。
具体实例2 :用热水做溶剂，将蓖麻碱配制成lmg/mL药液，在IOOOmL广口瓶中央悬挂一个3cm X Ilcm滤纸片,接入30头赤拟谷盗成虫,迅速用微量加样器分别在滤纸上滴加lmg/mL蓖麻碱溶液lmL，迅速用瓶塞将瓶口封好。重复3次，对照用蒸馏水溶剂处理。将测试瓶置于生测室内(温度30°C ±1°C，湿度75% ±5%)，72h赤拟谷盗击毙率为77. 2%， 72h后打开瓶塞，散气后将试虫倒入干净的培养皿内，赤拟谷盗死亡率为70. 1%。
三、线虫对蓖麻碱水提物的毒性评价，蓖麻碱对秀丽线虫的致死率试验，方法如下
将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖麻碱提取物的NGM板内。实验板中含12. 5mg/L5-Fu并置于20°C下培养。每组实验样本数60条左右，24、48、72、96、120h， 并计算死亡率。对线虫死亡判断标准线虫不无移动及无吞咽动作，轻触后仍无任何反应。
校正死亡率计算公式为
/o/A处理死亡率-对照死亡率1rvw 校正死亡率(％) =--X 100%I-对照死亡率
具体实例将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度为2. Omg/mLU. 5mg/ mL、I. 0mg/mL、0. 5mg/mL蓖麻碱生物农药的NGM板内。实验板中含12. 5mg/L5_Fu并置于 20°C下培养。每组实验样本数60条左右，24、48、72、96、120h。如图3所示，在蓖麻碱提取物的浓度为I. 5mg/mL，作用时间为120h时，秀丽线虫的死亡率为100%，蓖麻碱提取物浓度为2. Omg/mL，作用时间为96h时，秀丽线虫的死亡率为100%。蓖麻碱提取物的浓度增加， 秀丽线虫全部死亡的时间提前，说明蓖麻碱提取物浓度越大，毒性越强。
四、蓖麻碱对线虫生殖能力影响的试验，方法如下
挑取L4期线虫至各组单独转入NGM板，每24h移至新的NGM板，直至线虫产卵期结束。产卵板在20°C培养24h记录子代数目；产卵期为L4期结束到产卵结束。所有数据连续测定10只以上的秀丽线虫，然后取平均值。
具体实例挑取L4期线虫至各组单独转入含有0. 5mg/mL蓖麻碱生物农药的NGM 板内。每24h移至新的NGM板，直至线虫产卵期结束。产卵板在20°C培养24h记录子代数目；产卵期为L4期结束到产卵结束。如图4所示，空白组每条虫产出的子代数目均高于蓖麻碱提取物组每条虫产出的子代数目。线虫在性成熟后第二天和第三天进入生殖高峰期， 表明蓖麻碱提取物使秀丽线虫的机体生殖能力降低或丧失，为蓖麻碱制取生物农药提供了一定的理论依据。
五、蓖麻碱对线虫体长影响的试验，方法如下
从空白平板和含有蓖麻碱的实验板中随机挑取同期化后LI期的线虫，然后用热水将其烫死，在装有视觉透视标度的解剖显微镜下测量其长度；每24h从培养板中挑取线虫，连续测量5d线虫体长，每次每组三个平行，并记录测量结果。
具体实例从空白平板和含有0. 5mg/mL昆麻喊的实验板中随机挑取同期化后LI 期的线虫，然后用热水将其烫死，在装有视觉透视标度的解剖显微镜下测量其长度；每24h 从培养板中挑取线虫，连续测量5d线虫体长，每次每组三个平行，并记录测量结果。如图5 所示，第Id空白组与蓖麻碱组差异不明显，第2d以后，空白组的线虫增长的快，到第6d时差异显著，由此我们推测蓖麻碱提取物可能对秀丽线虫有限食(热量限制)作用，对其寿命产生影响，甚至致死。
六、蓖麻碱对线虫体内酶活力的影响的试验，方法如下
将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖麻碱提取物的NGM板内。实验板中含12. 5mg/L5-Fu并置于20°C下培养，每组实验样本数60条左右。用无菌水将线虫定容到200 u L，移入匀浆器中置于冰上匀浆。匀浆液定容至500 u L，加入I % Chaps buffer 至lmL，冰上置冷5min，4°C，5000r/min离心lOmin，收集上清液4°C保存。
通过测定线虫体内黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基 (02_ )，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。I个SOD活力单位(U)定义为每毫克组织蛋白在ImL反应液中SOD抑制率达50% 时所对应的SOD量。
计算公式
渺口外#中SOD活力fU/me nrot^ =(对照管⑶-测定管OD) x反应液总体积x 2 (8P )_对照管ODx取样量X样本蛋白含量
过氧化氢酶(CAT)分解H2O2的反应可通过加入钥酸铵而迅速中止,剩余的H2O2与钥酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，计算出CAT的活力。I个酶活力单位(IU)被定义为每毫克组织蛋白每秒钟分解Iumol的过氧化氢的量。
计算公式
组织匀浆液中G4r活力(U/mgprot)=(对照160 X样本蛋白含量X取样量
注*271为斜率的倒数
具体实例将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度为2. Omg/mLU. 5mg/ mL、l. Omg/mL^0. 5mg/mL菌麻碱生物农药的NGM板内。实验板中含12. 5mg/L5_Fu并置于920°C下培养，每组实验样本数60条左右。用无菌水将线虫定容到200 y L，移入匀浆器中置于冰上匀浆。匀浆液定容至500 ii L，加入I % Chaps buffer至lmL，冰上置冷5min，4°C， 5000r/min离心lOmin，收集上清液4°C保存。在给线虫喂食受试物48h以后，测定了给药 48h前后秀丽线虫体内最具有代表性的两种酶类过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶 (SOD)这两种酶的活性变化情况。对虫体的健康起着监测作用。由图6和图7可知，随着蓖麻碱提取物浓度的增加，虫体的SOD和CAT的活性逐渐降低，线虫死亡率逐渐提高。由此可知，蓖麻碱对虫体的致死率和两种酶的活性降低有一定关系。
权利要求
1.一种蓖麻碱的水提方法，其特征在于步骤如下(1)将蓖麻籽壳蓖麻老叶=5 lm/m的比例进行混合,按水粉碎料=10 : I加水；(2)将混合粉碎料在60°C恒温水�。帕涟瑁亓魈崛�4h；(3)用超声波技术再次对上述混合料液进一步提�。耍厥仗崛∫海�(4)放入50°C干燥箱内进行干燥；(5)干燥所得固体加入IOOmL蒸馏水，加热溶解并用I%的盐酸调pH为2-3，过滤，溶液用I %氨水调PH为9，过滤，溶液50°C进行真空干燥，得蓖麻碱。
2.一种由权利要求I所述的蓖麻碱的水提方法制备的蓖麻碱水提物，其特征在于步骤如下(1)将蓖麻籽壳蓖麻老叶=5 lm/m的比例进行混合,按水粉碎料=10 I加水；(2)将混合粉碎料在60°C恒温水�。帕涟瑁亓魈崛�4h；(3)用超声波技术再次提取蓖麻碱对上述混合料液进一步提�。耍厥仗崛∫海�(4)合并步骤⑵和(3)的滤液。
3.一种蓖麻碱的毒性评价方法，其特征在于包括如下步骤(1)蓖麻碱对储粮害虫的趋避效果测定。采用药膜选择法；(2)蓖麻碱对储粮害虫熏蒸效果测定，采用广口瓶密闭熏蒸法；(3)线虫对蓖麻碱水提物的毒性评价，蓖麻碱对秀丽线虫的致死率试验；(4)蓖麻碱对线虫生殖能力影响的试验；(5)蓖麻碱对线虫体长影响的试验；(6)蓖麻碱对线虫体内酶活力的影响的试验。
4.根据权利要求3所述蓖麻碱的毒性评价方法，其特征在于所述步骤(I)的具体方法如下用热水溶液做溶剂将蓖麻碱配成不同浓度的药液，将直径为9cm的圆形滤纸裁成相同的两半，分别滴加0. 5mL的蓖麻碱溶液和等量蒸馏水溶液为对照，待溶剂挥发干后，将两半滤纸用胶纸粘定，置入直径为9cm的培养皿内，每皿接入试虫30头，将培养皿放入生测室内，温度30°C 土1°C，湿度75% ±5%，分别于处理24、48、72h后观查成虫分布状况，计算其驱避率。
5.根据权利要求3所述蓖麻碱的毒性评价方法，其特征在于所述步骤(2)的具体方法如下在IOOOmL广口瓶，中央悬挂一个3cm x Ilcm滤纸片,接入30头试虫,迅速用微量加样器分别在滤纸上滴加不同体积lmg/mL蓖麻碱溶液，迅速用瓶塞将瓶口封好，对照用蒸馏水溶剂处理。将各处理瓶置于生测室内，温度30°C ±1°C，湿度75% ±5%，分别于24、 48、72h后观查击倒虫数，72h后打开瓶塞，散气后将试虫倒入干净的培养皿内，计算死亡数。
6.根据权利要求4所述蓖麻碱的毒性评价方法，其特征在于所述步骤(I)的具体方法如下将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖麻碱提取物的NGM板内，实验板中含12. 5mg/L5-Fu并置于20°C下培养。每组实验样本数60条左右，24、48、72、96、120h，并计算死亡率。对线虫死亡判断标准线虫不无移动及无吞咽动作，轻触后仍无任何反应。
7.根据权利要求4所述蓖麻碱的毒性评价方法，其特征在于所述步骤(2)的具体方法如下挑取L4期线虫至各组单独转入NGM板，每24h移至新的NGM板，直至线虫产卵期结束；产卵板在20°C培养24h记录子代数目；产卵期为L4期结束到产卵结束；所有数据连续测定10只以上的秀丽线虫，然后取平均值。
8.根据权利要求4所述蓖麻碱的毒性评价方法，其特征在于所述步骤(3)的具体方法如下从空白平板和含有蓖麻碱的实验板中随机挑取同期化后LI期的线虫，然后用热水将其烫死，在装有视觉透视标度的解剖显微镜下测量其长度；每24h从培养板中挑取线虫， 连续测量5d线虫体长，每次每组三个平行，并记录测量结果。
9.根据权利要求4所述蓖麻碱的毒性评价方法，其特征在于所述步骤(4)的具体方法如下将线虫同期化发育为L4期后，转入含有相应浓度蓖麻碱提取物的NGM板内；实验板中含12. 5mg/L5-Fu并置于20°C下培养，每组实验样本数60条，用无菌水将线虫定容到200 u L，移入匀浆器中置于冰上匀浆，匀浆液定容至500 u L，加入I % Chaps buffer 至lmL，冰上置冷5min，4°C，5000r/min离心lOmin，收集上清液4°C保存；通过测定线虫体内黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。
全文摘要
本发明涉及一种蓖麻碱的水提方法及提取物的应用以及蓖麻碱的毒性评价方法，利用磁力加热和搅拌辅助超声波提取技术，以水作为提取溶剂，从蓖麻籽壳和蓖麻老叶提取高纯度蓖麻碱的方法以及利用蓖麻碱防治储粮害虫玉米象和赤拟谷盗，并利用秀丽隐杆线虫对蓖麻碱进行毒性评价，测定线虫致死率、生殖能力、体长和体内酶的活性。本发明操作简单，成本低廉，减少有机试剂使用，保护环境，提取液可直接用于储粮害虫防治，为大规模工业化生产蓖麻碱生物农药提供必要条件。
文档编号G01N33/00GK102532013SQ201110447798
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者李贞景, 李风娟, 王昌禄, 王玉荣, 陈勉华, 魏巍 申请人:天津科技大学
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