专利名称：一种二苯甲酮的酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及二苯甲酮残留检测方法，更具体的说是用酶联免疫吸附方法(ELISA) 检测包装材料纸中的二苯甲酮的残留，属于有毒化学品残留检测方法技术领域。
背景技术：
二苯甲酮主要用于塑料等作为光稳定剂，能有效保护食品塑料包装以及有机玻璃 等因光照变质，也是紫外线吸收剂、有机颜料、医药、香料、杀虫剂的中间体。由于二苯甲酮 具有挥发性，在不具功能性阻碍的情况下会从食品包装迁移到食品中。经研究发现二苯甲 酮会严重损害动物的肝肾组织，并会慢性致癌以及生殖毒性。欧盟食品安全局制定了含 二苯甲酮及4-氨基二苯甲酮的印刷油墨食品包装的最大迁移限量，规定食品包装印刷油 墨材料内的二苯甲酮迁移极限值须低于每公斤0.6毫克。目前，国内外有关二苯甲酮及 4-氨基二苯甲酮的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法 (GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人 员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代 检测对快速、方便、准确的要求。目前尚未见国内外有二苯甲酮残留的酶联免疫检测的报 道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测包装材料中二苯甲酮残留的免疫学检测方 法，使样品无需经过繁琐的提纯或浓缩步骤，并且保证较高的敏感性和特异性。本发明的技术方案如下利用胥传来、许宙、林菲、陈莲君等“一种4-氨基二苯甲 酮人工抗原的制备方法”，中国专利申请号201010182488. 6，以4-氨基二苯甲酮为半抗原， 此半抗原与BSA偶联物作为免疫原免疫健康新西兰大白兔得到多克隆抗体，此半抗原与 OVA的偶联物作为包被抗原，建立了包装材料纸中二苯甲酮的间接竞争酶联免疫检测方法。一种二苯甲酮的酶联免疫检测方法，利用合成的4-氨基二苯甲酮与BSA偶联物免 疫原免疫得到多克隆抗体，以4-氨基二苯甲酮半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗 原，以二苯甲酮为标准品，建立了包装材料纸中二苯甲酮的间接竞争酶联免疫检测方法；步 骤如下
(1)以0. 05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1: IOOiTl 64000，加入酶标板中，每孔加 入100 μ L，4°C孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤；
(2 )用PBST将二苯甲酮标准品稀释成0. 5、1、5、10、20、50ng/mL系列浓度，将系列浓度 之一的二苯甲酮标准品或待测样品加入酶标板中，每孔加50yL;同时加入以抗体稀释液 稀释1:1000^1:4000的多克隆抗体，每孔加50yL，37°C孵育Ih后以PBST洗涤；Γ5次；
(3)以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP稀释为1:3000，每孔加 100 μ L，37°C孵育Ih后以PBST洗涤3 5次；
(4)配置显色液A 液0. 933 g 柠檬酸，3. 68 g Na2HPO4 · 12H20，18 μ L30%H202 用超纯水定容至 100 mL ； B液60 mg 3，37, 5，57-四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇中； 使用前将A液与B液以5:1体积混合；
(5)每孔加入显色液100μ L，37°C显色15min ；每孔加入终止液2M硫酸溶液100 μ L ； 酶标仪450nm测吸光值OD。所述的二苯甲酮的酶联免疫检测方法，包装材料纸中待测样品的提取方法为
(1)取阴性样本-白纸为代表性样品，将其剪碎至5mmX5mm大�。靹颍直鸪迫� l.Og试样置于IOOmL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的二苯甲酮标准品的甲醇溶液加入其 中，使二苯甲酮在纸试样体系中的终浓度分别为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，室温静置15 min ；
(2)在上述锥形瓶中继续加入20mL四氢呋喃，于超声波发生器中提取20min，将提取 液滤出，残渣再用IOmL四氢呋喃超声提取5min，再将提取液滤出，将两次滤液合并；
(3)将滤液在40°C水浴旋转蒸发器中浓缩至近干，用甲醇溶解并定容至lmL，然后用 氮气吹干，以含10% - 20%甲醇的PBS溶解，即为待测样品，用于ELISA检测。所述二苯甲酮的酶联免疫检测方法，抗原抗体反应的PH值必须在中性或弱 碱性的条件下进行。更详细的步骤为 主要溶液配制
1)配制0. OlM磷酸盐(PBS)缓冲液 Na2HPO4 · 12H203. 62 g
KH2PO4 · 2H200. 2 g
NaCl0.2g
KCl8. Og
加超纯水稀释至1000 mL。2 )配制pH9. 6、0. 05M碳酸盐(CBS )缓冲溶液 Na2CO31. 59g
NaHCO32.93g
加超纯水稀释至1000 mL。3)配制 PBST 溶液含 0. 05% Tween - 20 的 PBS 溶液。4)配制封闭液含0. 1%明胶的0. 05M碳酸盐缓冲溶液(即包被缓冲液)。5)配制抗体稀释液含0. 1%明胶的PBST溶液。6)显色液
A液0. 933 g柠檬酸，3. 68 g Na2HPO4 · 12H20，18 μ L30%H202用超纯水定容至 100 mL。B液60 mg 3，37, 5，57-四甲基联苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中。使用前将A液与B液以5 1体积混合。7)终止液2M WH2SO4。间接竞争ELISA实验方法的步骤如下
预先将二苯甲酮标准品配制成1000 μ g/mL的甲醇溶液作为工作母液，在4°C保存待 用。配制PBST溶液(0. Olmol/L，含0. 05%Tween-20)，以此为基础配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液和抗血清。a、包被用设定浓度的包被原包被酶联反应板，IOOyL /孔，4°C过夜。b、洗涤用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200 μ L/孔，然后甩干反应板。c、封闭含 0. 1% 明胶的 CBS，200 μ L/ 孔，37 °C 封闭 2h。d、洗涤同 b。e、竞争用PBST将二苯甲酮母液稀释成0. 5、1、2. 5、5、10、50ng/mL系列浓度，另设 一个PBST空白对照，50 μ L/孔。然后每孔加入50 μ L稀释1000-4000倍的抗血清，于37°C
温育Ih。f、洗涤同 b。g、加酶标二抗(羊抗兔 HRP-IgG，1:3000 )，100 μ L/孔，37°C反应 lh。h、洗涤同 b。i、显色加底物 TMB 10(^17孔，371显色15111土11。j、终止加终止液 2M WH2SO4 100 μ L/孔。k、测定用酶标仪检测0D45Qnm。取阴性样本(白纸)为代表性样品，将其剪碎至5mmX5mm大�。靹�。分别称取 l.Og试样置于IOOmL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的二苯甲酮标准品的甲醇溶液加入其 中，使二苯甲酮在纸试样体系中的终浓度分别为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL,室温静置15 min0在锥形瓶中加入20mL四氢呋喃，于超声波发生器中提取20min，将提取液滤出。残渣 再用IOmL四氢呋喃超声提取5min，再将提取液滤出，将两次滤液合并。将滤液在40°C水浴 旋转蒸发器中浓缩至近干，用甲醇溶解并定容至lmL，然后用氮气吹干，以含10% — 20%甲醇 的PBS溶解，即为待测样品，用于ELISA检测。本发明的有益效果本发明建立了包装材料中二苯甲酮的间接ELISA方法，为包 装材料中二苯甲酮残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用 较低并且稳定性和重复性较好。灵敏度为0. 5ppb，线性范围为1 lOOppb，半数抑制量 (IC50)为14. 5ng/mL,回收率为90. 9%，与其他苯酮类几乎无交叉反应。免疫反应的高特异 性和高亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。
图1 二苯甲酮的标准曲线。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明。一、仪器
TGL - 40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂
KFLOff纯水机，凯佛隆公司
ZD - 9556水平摇床，太仓科教器材厂
Costar96孔8X 12可拆酶标板，上海吉泰生物科技有限公司
MuLtiska Mks 酶标仪，Thermo Labsystems 公司
可调试移液器，Thermo Labsystems公司涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂
二、试齐U
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP - IgG)，康成生物工程公司 四甲基联苯胺(TMB)，华美生物工程公司 其他试剂均为分析纯试剂
三、步骤
1、人工抗原的制备
A液取0. Immol 4-氨基二苯甲酮溶于6mL N，N-二甲基甲酰胺，冰�。尤隝mL 2mol/ L HCl，再加13mL水，冰�。渭又柿颗ǘ萳%NaN02溶液，冰浴中持续搅拌，NaNO2溶液的加入 量用淀粉_碘化物试纸进行监控，试纸变成蓝黑色以后，4°C下搅拌孵育15分钟为A液；
B液牛血清白蛋白BSA 0. 002讓ol溶于0. 05 mol/L、pH 9. 6的碳酸盐CBS缓冲液中， 为B液，4°C保存待用；
将A液逐滴加入B液中，调pH 9. O然后置4°C下孵育半小时，室温反应4小时，即得 4-氨基二苯甲酮人工抗原混合液；
透析袋前处理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min,保存在4°C去离子水中备用。将4-氨基二苯甲酮人工抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L的0. OlM的PBS溶液 和2X2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到4-氨 基二苯甲酮人工抗原。分装冻干保存于一 20°C冰箱中。2.抗血清的制备
1)实验动物选3只2月龄、体重为1. 5 - 2 kg的健康新西兰大白兔为实验动物。2)抗原配置将免疫原用生理盐水稀释，配成2 mg/mL的溶液。3)乳化将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，直至 将一滴乳剂滴入水中，不散开漂在水面上为止。4)免疫方法初次免疫将乳化好的试剂于兔子背部多点注射，1 mL/只。初次免疫 后的免疫称为加强免疫，加强免疫用福氏不完全佐剂乳化，加强免疫为肌肉注射，每两周加 强免疫一次，剂量与初次免疫相同。5)采血4次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血 清效价。待效价达到要求后，采用耳静脉放血与心脏放血相结合获得抗血清，收集于50 mL 灭菌塑料离心管中。6)抗体的纯化和保存将抗血清XmL用等量的生理盐水稀释至2XmL，然后在搅 拌下逐滴加入与稀释后血清等量(2X)的饱和硫酸铵，4°C放置3小时使其充分沉淀。离心 (3000r/min) 20min,弃上清以生理盐水溶解沉淀至Xm，再逐渐滴加饱和硫酸铵X/2mL。4°C 放置3小时使其充分沉淀，重复上述第二步过程1次，将末次离心后所得沉淀物以0. 02mol/ LPBS (pH 7. 4)溶解至XmL,装入透析袋中0. 02mol/LPBS (pH 7. 4)充分透析，期间换液3次， 透析完浓缩，分装放-20°C冰箱保存备用。3、ELISA 反应过程 抗体效价测定步骤
1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μ L/孔，于4 °C冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 PL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉 洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 yL/孔，于37 °C温育箱内温育2 h后取出烘干待用。3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μ L/孔，37 °C孵育1 h后洗涤、拍干。4)每孔加入100 4 1^，1:3000稀释的服？标记的羊抗兔化6，371孵育111后洗涤、拍干。5)每孔加入100 μ L显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37 °C反应15 min， 取出后每孔加入100 μ L终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A45(1。抗体特异性测定步骤
a、包被用设定浓度的包被原包被酶联反应板，IOOuL /孔，4°C过夜。b、洗涤用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200 μ L /孔，然后甩干反应板。c、封闭含 0. 1% 明胶的 CBS，200 μ L/ 孔，37 °C 封闭 2h。d、洗涤同 b。e、竞争用PBST将二苯甲酮标准品稀释成0. 5,1,5,10，20，50ng/mL系列浓度，另设一 个PBST空白对照，50 μ L /孔。然后每孔加入50 μ L稀释4000倍的抗血清，于37°C温育lh。f、洗涤、同 b
g、加酶标二抗(羊抗兔 HRP-IgG, 1 3000 )，100 μ L/ 孔，37 C 反应 lh。h、洗涤同 b
i、显色加底物TMB 100μ L/孔，显色15min。j、终止加终止液100 μ L/孔。k、测定用酶标仪检测0D45Qnm。回收率及样品提取方法的确定
1)取阴性样本(白纸)为代表性样品，将其剪碎至5mmX5mm大�。靹颉７直鸪迫�1. Og 试样置于IOOmL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的二苯甲酮标准品的甲醇溶液加入其中， 使二苯甲酮在纸试样体系中的终浓度分别为10ng/g、50ng/g、100ng/g，室温静置15 min。2)在锥形瓶中加入20mL四氢呋喃，于超声波发生器中提取20min，将提取液滤出。 残渣再用IOmL四氢呋喃超声提取5min，再将提取液滤出，将两次滤液合并。3)将滤液在40°C水浴旋转蒸发器中浓缩至近干，用甲醇溶解并定容至lmL，然后 用氮气吹干，以含10% - 20%甲醇的PBS溶解，即为待测样品。4)移取50 μ L样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。5)回收率的计算根据不同添加浓度的样品OD值计算相应的抑制率，再根据相应 的抑制率从标准曲线上查到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比为对应浓度的回收率。试验结果如下
1、标准曲线本实验所获得的抗原检测的线性范围是为1 lOOng/mL，具体请见说明 书附图。2、灵敏度灵敏度是所得90%最大吸光值所对应的标准品的浓度，即IC9tl为 0.5ng/mL。
权利要求
一种二苯甲酮的酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的4 氨基二苯甲酮与BSA偶联物免疫原免疫得到多克隆抗体，以4 氨基二苯甲酮半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以二苯甲酮为标准品，建立了包装材料纸中二苯甲酮的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:1000~1:64000，加入酶标板中，每孔加入100μL，4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤；(2)用PBST将二苯甲酮标准品稀释成0.5、1、5、10、20、50ng/mL系列浓度，将系列浓度之一的二苯甲酮标准品或待测样品加入酶标板中，每孔加50μL；同时加入以抗体稀释液稀释1:1000~1:4000的多克隆抗体，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤3~5次；(3)以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR HRP稀释为1:3000，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤3~5次；(4)配置显色液A液0.933 g柠檬酸，3.68 g Na2HPO4·12H2O，18 μL30%H2O2用超纯水定容至100 mL；B液60 mg 3,3/,5,5/ 四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇中；使用前将A液与B液以5:1体积混合；(5)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；每孔加入终止液2M 硫酸溶液100μL；酶标仪450nm测吸光值OD。
2.根据权利要求1所述的二苯甲酮的酶联免疫检测方法，其特征在于包装材料纸中 待测样品的提取方法为(1)取阴性样本-白纸为代表性样品，将其剪碎至5mmX5mm大�。靹颍直鸪迫� l.Og试样置于IOOmL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的二苯甲酮标准品的甲醇溶液加入其 中，使二苯甲酮在纸试样体系中的终浓度分别为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL,室温静置15 min ；(2)在上述锥形瓶中继续加入20mL四氢呋喃，于超声波发生器中提取20min，将提取 液滤出，残渣再用IOmL四氢呋喃超声提取5min，再将提取液滤出，将两次滤液合并；(3)将滤液在40°C水浴旋转蒸发器中浓缩至近干，用甲醇溶解并定容至lmL，然后用 氮气吹干，以含10% - 20%甲醇的PBS溶解，即为待测样品，用于ELISA检测。
3.根据权利要求2所述二苯甲酮的酶联免疫检测方法，其特征在于抗原抗体反应的pH 值必须在中性或弱碱性的条件下进行。
全文摘要
一种二苯甲酮的酶联免疫检测方法，属于有毒化学品残留检测技术领域。本发明公开了利用合成的4-氨基二苯甲酮与BSA偶联物免疫原免疫得到多克隆抗体，以4-氨基二苯甲酮半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，以二苯甲酮为标准品，建立了包装材料中二苯甲酮的间接竞争酶联免疫检测方法。本发明为二苯甲酮在包装材料中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.5ppm，线性范围为1-100ppm。免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度。
文档编号G01N33/558GK101949924SQ20101029597
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘丽强, 宋姗姗, 林菲, 王利兵, 胥传来, 许宙, 陈莲君 申请人:江南大学
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