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专利名称：蛋白质原位表达芯片及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片领域，尤其涉及通过无细胞表达体系和三维自组装超分子结构而构建的蛋白质原位表达芯片领域。
背景技术：
蛋白质阵列为研究蛋白质分子之间、蛋白质分子和核酸及其他小分子之间的相互作用提供了高通量的方法和手段。但是，由于缺少类似DNA阵列中PCR扩增技术的蛋白质扩增方法，在阵列表面构建高活性的功能蛋白一直是研究功能蛋白相互作用的难点所在。无细胞表达体系提供了蛋白质阵列新的构建方法——蛋白质原位表达阵列(In Situ Protein Array)，该方法的原理如下首先，它在阵列表面构建可以表达的基因阵列，包括含启动子的PCR DNA、质粒DNA以及mRNA等，然后通过转录与翻译偶联的无细胞表达体系，使得该阵列原位表达新鲜的蛋白质，以此构建出具有活性的功能蛋白质阵列(Mingyue He & Michael Taussig 2001 ；Niroshan Ramachandran &Joshua LaBaer et al. 2004 ； Sheng-Ce Tao & Heng Zhu 2006)。用原位表达的方法，不仅避免了由于分离纯化储存造成的蛋白质失活，而且可以表达在細胞内难以表达的毒素蛋白、膜蛋白以及真核細胞特有的转录后修饰蛋白。原位构建蛋白质阵列的方法主要有蛋白质原位阵列技术(PISA，ProteinIn Situ Array)、多重点样技术(MIST, Multiple Spotting Technique)、核酸编程性蛋白质阵列技术(NAPPA，Nucleic Acid Programmable Protein Array)、DNA 阵列复印蛋白质阵列技术(DAPA，DNA Array to Protein Array)以及mRNA阵列来源原位嘌呤霉素捕捉技术 (ISPCFmA, In Situ Puromycin Capture FrommRNA Array)等卞法。胃巾，PISA ^ Mingyue He等人于2001年提出，这种方法是将原核細胞裂解液和PCR DNA共混，利用蛋白质上的His 标签特异识别芯片Ni包被表面，从而固定在基底表面；MIST技术由Dolores J. Cahill等人与2003年提出，这种方法是PISA方法的改进，它重复在一块芯片上进行多次准确的打印， 首先是将DNA模板打印在氨丙基三乙氧基硅烷和Ni处理过的基底表面，然后再在DNA原位置第二次打印原核細胞裂解液使带有His标签的蛋白质表达并和Ni包被的表面识别固定； NAPPA技术由Joshua LaBaer于2004年提出，这项技术首先在固定了 GST抗体的基底上用生物素-链霉素的方法固定质粒DNA分子，之后将芯片表面浸泡在真核細胞裂解液中，使得带有GST标签的蛋白质表达井原位固定在GST抗体上面，相关工作发表在kience杂志上； DAPA技术是PISA方法的进ー步改进，于2008年提出，这个方法使用两个基底表面，其一打印并固定好模板PCR DNA分子，另ー块基底表面用M包被的表面，之后将含有原核細胞裂解液的滲透性膜放置在两个芯片基底之间，使带有His标签的蛋白表达并穿过渗透性膜被 Ni包被的基底捕获，最终形成蛋白质芯片，相关工作发表在NatureMethod ；ISPCFmA由Heng Zhu等人于2008年提出，这项技术在芯片表面固定3’ mRNA模板的同吋，固定有嘌呤霉素， 当蛋白质从mRNA的5’端向3’端翻译的最后阶段，嘌呤霉素会进入到核糖体中与合成的多肽键合，从而将多肽固定在芯片表面，之后再用RNA酶将mRNA降解，相关工作发表在NatureMethod 上面。以上这些方法各有优点，但是都存在着相同的缺点，其一，采用这些方法得到的蛋白固定量小(小于50pmoles/Cm2)；其ニ，蛋白质由于直接吸附在基底表面导致空间构象发生变化，以致丧失活性；其三，模板分子和捕获分子不能有序逐步地固定在基底表面。针对现有的无细胞体系蛋白质微阵列构建方法中出现的问题，亟需ー种可以解决蛋白质固定量�。�蛋白活性受到基底影响，以及可以有序可控地将模板分子和捕获分子固定在基底表面的原位表达蛋白质方法。

发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的ー个目的是提供一种基于蛋白质原位表达的蛋白质芯片。本发明的另ー个目的是提供所述蛋白质原位表达芯片的构建方法。本发明的又 ー个目的是提供所述蛋白质原位表达芯片和所述方法的应用。此外，本发明的目的还在于提供构建所述蛋白质原位表达芯片的装置。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一方面，本发明提供ー种蛋白质原位表达芯片，其中，所述芯片包括基底(1)、表面修饰层以及固定在表面修饰层上的蛋白质(5)；所述表面修饰层包括第二链状分子(4)和由环糊精( 包合第一链状分子C3)形成的聚轮烷，该第二链状分子和聚轮烷均勻间隔排列，分别通过第二链状分子和第一链状分子的一端固定在基底上，并且第二链状分子的长度未达到第一链状分子被环糊精包合的部分；所述蛋白质通过修饰在第一链状分子和/ 或环糊精上的活性基团固定在聚轮烷上；优选地，所述蛋白质通过环糊精上的活性基团固定于环糊精上；优选地，所述基底的材料包括金属、如金、银、钼、铜、铝和/或铬；金属氧化物，如 A1203、TiO2, SnO2 ；金属类和金属氧化物类以各种形式复合而成的基材；以及Si，玻璃，石英和/或高分子聚合物；进一步优选的基材选自玻璃、高分子聚合物以及表面蒸镀50纳米厚的金的高折射率玻璃基底。优选地，所述第二链状分子包括聚乙ニ醇、硫醇以及有类似结构的分子，分子量为50 10000，进ー步优选为50 1000 ；所述第一链状分子包括聚乙ニ醇、聚丙ニ醇、 聚ニ苯己三烯、具有相应类似结构的分子以及前述化合物組成的嵌段化合物，分子量为 400-50000，进ー步优选为400 10000 ；组装于基底的第一链状分子和第二链状分子的混合摩尔比例为1 0 1 100000，进ー步优选为1 1 1 1000，更优选为1 10 1 100。第一链状分子和第二链状分子购买自上海炎怡生物科技有限公司。优选地，所述环糊精选自α -环糊精、β -环糊精和/或Y -环糊精，进ー步优选为α-环糊精和/或β-环糊精；所述聚轮烷超分子层中第一链状分子和环糊精的混合摩尔比例为1 1 1 100，进ー步优选为1 2 1 20，更优选为1 5 1 10 ；优选地，所述第一链状分子和第二链状分子通过一端的固定基团固定于基底上， 所述固定基团包括单巯基、双巯基、羧基、氨基、氨基硅烷，通过共价键与基底连接；第二链状分子的另一端用惰性基团修饰，所述惰性基团包括ζ型酪氨酸(Z-Tyr)和/或2. 4- ニ 石肖查氟苯(参考又献参考又献 Themolecular necklace:a rotaxane containing many threaded α -cyclodextrins. Akira Harada, Jun Li&Mikiharu Kamachi· nature，1992)，从而使第二链状分子不能与环糊精发生包合反应；第一链状分子的另一端和/或环糊精上的活性基团包括-C00H、-NH2、-SH、乙ニ胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、链霉亲和素、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、环氧、-CH0、NTA-螯合基团、-OH、-CH3和/或-0CH3 ；优选地，所述蛋白质包括酶、病毒的特征蛋白、細胞内单个行使功能的蛋白以及复合蛋白中的一个单体蛋白；优选地，所述蛋白质来自一种或多种模板分子(6)的原位表达，所述模板分子固定或不固定于所述芯片的表面修饰层，其包括RNA和DNA，如单链或双链的环状DNA、线性 DNA或PCR扩增产物；优选地，所述模板分子通过第一链状分子和/或环糊精上的活性基团固定于聚轮烷上；进ー步优选地，所述模板分子通过第一链状分子上的活性基团固定于第一链状分子上。优选地，所述模板分子含有ー种或多种标签，使表达的蛋白质带有位于其不同位置的一种或多种标签，从而使得所述蛋白质通过标签连接于第一链状分子和/或环糊精的活性基团上；优选地，所述聚轮烷上第一链状分子和/或环糊精的活性基团还连接了对所述标签具有特异亲和性的捕获分子，所表达的蛋白质通过捕获分子固定于第一链状分子和/或环糊精上，所述捕获分子包括蛋白质、多肽和糖类；进一步优选地，所述捕获分子通过环糊精上的活性基团连接于环糊精上，从而使表达的蛋白质固定于环糊精上。优选地，所述蛋白质的标签包括酶类、多肽结合位点、特异识别多肽的肽段、识别金属螯合的肽段以及识别生物素链霉素的肽段，所述标签的数量可以为ー个或ー个以上， 其位置可以在蛋白质的C端或N端，其与蛋白质之间可以相邻，亦可以相隔数个或数十个氨基酸；优选地，所述蛋白质原位表达芯片上同时包含编码蛋白质的模板分子和捕获该蛋白质的捕获分子；优选地，所述模板分子和捕获分子之间的摩尔比例为10 1 1 100， 进ー步优选为5 1 1 50，更优选为1 1 1 10 ；优选地，所述蛋白质可以由単一或多种模板分子表达后经原位组装成具有功能的蛋白质复合体，经捕获分子的识别固定于聚轮烷上；进ー步优选地，所述蛋白质复合体通过捕获分子固定于环糊精上。另ー方面，本发明提供ー种构建所述蛋白质原位表达芯片的方法，其中，所述方法包括以下步骤1)选取适合的基底，清洗表面；2)选取适合的第一链状分子、第二链状分子和环糊精，其中第二链状分子一端含有能够固定到基底的固定基团，并且长度短至无法被环糊精包合或者使其另一端含惰性基团，使其不能和环糊精发生包合反应；第一链状分子一端含固定到基底的固定基团，另一端和/或环糊精含有用于固定蛋白质的活性基团；3)配制第一链状分子和第二链状分子的混合溶液，将混合溶液用于处理基底表面，使第一链状分子和第二链状分子固定于基底表面后，清洗表面；4)在基底表面包合经处理的环糊精分子，使基底表面形成由第一链状分子和环糊精組成的聚轮烷，从而聚轮烷和第二链状分子形成表面修饰层，清洗表面；
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5)选择细胞裂解液和编码要固定的蛋白质的模板分子，将模板分子溶解于细胞裂解液中，然后用细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质，反应温度为20°C 35°C，反应时间为30分钟 180分钟；优选地，反应温度为约30°C左右，反应时间约为90分钟左右；6)降低温度使蛋白质固定在第一链状分子和/或环糊精的活性基团上，反应温度为10°C 30°C，反应时间为10分钟 过夜；优选地，反应温度为约15°c，反应时间为约30 分钟左右；蛋白质充分固定后，清洗表面。可选地，在步骤幻中，选择含有用于固定蛋白质的活性基团的环糊精，修饰第一链状分子的另一端使其含有用于固定模板分子的活性基团；在步骤幻中，选择合适的模板之后使其固定于第一链状分子的活性基团上，然后使细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质。优选地，在上述方法中，所述步骤幻的环糊精的活性基团上还含有用于捕获蛋白质的捕获分子，当步骤幻中含或不含模板分子的细胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质后，所述蛋白质通过捕获分子固定于环糊精的活性基团上。优选地，在上述方法中，所述步骤幻可以通过清洗芯片后再次加入含或不含模板分子的细胞裂解液重复进行，使得模板分子充分表达蛋白质。优选地，在上述方法中，步骤幻和6)在微反应腔进行，将用于表达的细胞裂解液置于微反应腔中，使经过处理的基底表面与微反应腔中的细胞裂解液接触，以使模板分子表达蛋白；可选地，如模板分子未固定于聚轮烷上，将模板分子固定于微反应腔的表面；优选地，所述微反应腔在反应前经亲水处理。又一方面，本发明提供一种用于构建所述蛋白质芯片的装置，其中，所述装置为制作成阵列的微反应腔，将用于表达蛋白质的细胞裂解液置于所述微反应腔中，通过与经过预处理的芯片基底相接触，使模板分子表达蛋白从而构建蛋白质芯片；优选地，所述模板分子经预处理固定于所述聚轮烷上；或者，所述模板分子被加入到细胞裂解液中；或者，所述模板分子固定在所述微反应腔的表面；优选地，制备微反应腔的材料包括聚二甲基硅氧烷和/或PMMA，其中，模具整体需要与基底大小匹配，微反应腔数量为1 1000个，每个微反应腔形状为长方体空间或圆柱体空间，其底部面积约IOOnm2 1cm2，高度约10 nm 1cm。再一方面，本发明提供所述蛋白质芯片的应用，优选地，用于检测与所述蛋白质相互作用的物质，所述物质包括蛋白质、DNA、RNA、糖类、脂类以及其他小分子。此外，本发明还提供所述装置在构建蛋白质芯片中的应用。以下是本发明的详细描述本发明的目的是利用聚轮烷超分子材料构建蛋白质原位表达芯片，其具有三维、 蛋白质固定量大、活性高以及模板分子和蛋白质固定有序可控等特征。用于实现本设计目的的技术方案如下一种构建的三维无细胞体系原位表达蛋白质芯片，所采用的装置包括基底、聚轮烷超分子层、模板分子和捕获分子的固定、无细胞蛋白质表达体系以及微流控反应腔。所述的表面修饰是由超分子自组装形成的三维聚轮烷结构表面，原位表达中需要的模板分子和 /或表达形成的蛋白质有序的固定在三维环境中。
本发明中使用的基底选自金属类，如金、银、钼、铜、铝、铬，金属氧化物类如A1203、 Ti02、SnO2, Si，玻璃，石英，高分子聚合物以及前述几种基材以各种形式复合而成的基材。本发明中使用的表面修饰包括能够在基底表面上形成的三维有序的超分子聚轮烷结构，由两种或两种以上的化学物质通过分子间相互作用缔结而成的具有特定结构和功能的超分子体系——聚轮烷结构。这种超分子结构的形成利用的是氢键和各种非共价键的作用。下面以聚乙二醇和α-环糊精为例，说明这种表面修饰结构的特征。聚乙二醇是具有[C-C-0]单元结构的分子，其重复单元的数量由2到10000个以上。表面修饰中可以含有1种到100种不同重复单元数量的聚乙二醇分子，以任意比例组合。比如使用45个重复单位的长链聚乙二醇(作为第一链状分子)和6个重复单位的短链聚乙二醇(作为第二链状分子)，其比例可以由1 0，1 1,1 10000等摩尔比例构成。比例的不同，使得组装在基底表面的长链聚乙二醇分子之间的距离不同。长链聚乙二醇的末端修饰是多样的。包括单巯基、双巯基、羧基、氨基和/或氨基硅烷；另一端可用包括-C00H、-ΝΗ2、-SH、乙二胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、链霉亲和素、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、环氧、-CH0、 NTA-螯合基团、-0H、-CH3和/或-0CH3等分子修饰，其作用是方便在长链聚乙二醇末端进一步共价连接其他化学或生物分子。α-环糊精的作用是包合在聚乙二醇分子上形成纳米管型的聚轮烷结构，其浓度可以由lng/L到其饱和浓度。本发明中对环糊精分子进行了一种及以上的分子修饰(可参考本领域现有技术和戴荣继等人的“含有氨基和羧基的环糊精衍生物合成及性能测试”，北京理工大学学报，18卷第2期，第159-164页)，修饰后所含功能基团包括-C00H、-NH2, -SH、乙二胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、链霉亲合素、 马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和/或-CH0。除使用聚乙二醇和α-环糊精，其他可以构成超分子纳米管状的聚轮烷结构的化合物也可以使用，比如使用聚丙二醇和环糊精、 聚乙二醇和Y-环糊精以及聚二苯己三烯和Y-环糊精形成的聚轮烷结构等等(环糊精如

图1所示)。本发明在包含超分子纳米管状的聚轮烷结构的表面上打印阵列，可以直接用移液枪在芯片表面点样，也可使用打印机点样。点样的成分可以是模板分子和捕获分子的物质以及其他分子，其中捕获分子可以是蛋白质、糖类等。每一点打印的量可以是Inl 10 μ 1 ； 本发明中，捕获分子需要固定到聚轮烷结构的活性基团上，而模板分子可以固定，也可以不固定。模板分子和捕获分子之间的摩尔比例可以为1 1到1 10000甚至更高。其目的是使能够表达的模板分子和能够固定的捕获分子根据实际表达量进行匹配。在每平方厘米的面积里，打印的点数可以由1个到IO5个以上。两点圆心间距离的范围为IOnm 5mm。本发明中使用的表达蛋白质的模板分子可以是RNA分子、DNA分子。其中DNA分子可以是环状DNA，如质粒DNA、单链环状DNA，或者是单链DNA，比如PCR扩增后的产物。本发明中使用的质粒DNA分子需要含有多种元件，例如包括不翻译的前导序列、 核糖体识别位点、启动子、特异性的切割位点、3’不表达序列、目的蛋白序列、5’不表达序列以及3’或5’端的标签和终止子等必要成分。其中特异性的切割位点包括Nhel、)(h0l、 EcoRl、Mlul、Xbal、Sal 1、Accl、Smal、BstZl、Notl等切割位点。其启动子可以是强启动子， 包括T3、T7和SP6等启动子。其中目的蛋白可以是酶，比如β-糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶等；也可以是病毒的特征蛋白，比如乙肝病毒表面抗原、乙肝病毒核心抗原等；亦可以是细胞内单个行使功能的蛋白，比如P53、p21等；还可以是一个复合蛋白中的一个单体蛋白，比如DNA合成酶复合体中的一个单体蛋白或者是氧化还原酶体的一个单体等。本发明中每一个模板分子可以含有不同的标签，可以是较大的酶类，比如 b_半乳糖苷酶(b-Galactosidase)、谷胱甘肽转移酶(GST)、氯霉素(Chloramphenicol acetyltransferase)、二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase)等；也可以是多肽结合位点，比如ftOtein A、Protein G、Ζ、SPG、ABP等；还可以是一些特异识别多肽的肽段，比如 FLAG>c-myc>B~tag>T7tag>S~tag>calmodulin-binding tag、Coiled-coil 多月太等；识别金属螯合的肽段，比如His、ProHisSftx^HAT和FISaH tag CCXXCC等；除此之外，还有识别生物素链霉素的肽段，比如 Biotag、AviTag、Mi^p tag II、Mi^ptavidinbinding ρ印tide、 Nanotag、Photocleavable Tag 等。本发明中，一个模板中，可以使用多种不同的标签，标签的数目可以是1个、2个甚至更多个。本发明中，标签的位置可以位于表达出的蛋白质的C端，也可以位于蛋白质的N 端。根据各种标签使用方法的不同，其标签距离表达蛋白可以紧邻，也可以距离1到100个甚至更多的连接氨基酸。本发明中，模板分子可以固定在阵列的表面，亦可以不固定在阵列的表面。固定的方法可以选用生物素亲和素特异连接，也可以使用生物素链霉素特异连接以及其他使DNA 或RNA分子固定在阵列表面的方法。固定在阵列上需要的是保持模板分子表达蛋白质的能力。以由聚乙二醇和α-环糊精构建而成的聚轮烷表面为例说明有序固定质粒DNA分子和蛋白质分子的方法。其中第一链状分子聚乙二醇分子含有45个重复单元，其末端用马来酰胺修饰，另一端为巯基。第二链状分子聚乙二醇分子含有6个重复单位，其一端为羟基，另一端为巯基。长短两种聚乙二醇在金片表面以1 10的摩尔比例共混，在金片表面形成两种链状分子交替的三维结构。然后使用带有羧基修饰的οΓ-环糊精，以浓度为lOOug/ml加入IOOul到修饰表面，环糊精与第一链状分子聚乙二醇组装成聚轮烷结构。在此之后，加入用巯基修饰的质粒DNA分子(含有GST的标签)，使其与马来酰胺分子结合。最后用NHS/ EDC活化环糊精上的羧基，加入GST抗体，使GST抗体与环糊精上的羧基结合。最终形成聚轮烷末端为质粒DNA，环糊精外侧为捕获标签蛋白的三维结构(如图2所示)。冲洗掉未捕获蛋白后，即可用于蛋白质与蛋白质相互作用实验。本发明中模板分子可以是不单一的，其数量可以是1种、2种、3种甚至更多种，以此在同一位置上同时表达多种多肽段，形成由多肽组成的蛋白质。质粒种类的添加变化可以用于研究多肽形成蛋白质中某一组成成分缺失所造成的构象以及活性影响方面的研究。本发明需要捕获标签的捕获分子例如蛋白、糖类以及其他分子可以固定在聚轮烷上任何的活性基团上。修饰到功能基团上的捕获分子根据目的蛋白上带有的标签种类不同而不同，它利用与其相应标签的特异亲和性，将模板分子表达出的蛋白质固定在聚轮烷活性基团上，构成捕获蛋白质的三维空间表面。需要的捕获分子与使用标签的对应关系示例性的参照列表1。表1 标签与捕获分子对照表
权利要求
1.ー种蛋白质原位表达芯片，其中，所述芯片包括基底(1)、表面修饰层以及固定在表面修饰层上的蛋白质(5)；所述表面修饰层包括第二链状分子(4)和由环糊精( 包合第 ー链状分子C3)形成的聚轮烷，该第二链状分子和聚轮烷均勻间隔排列，井分别通过第二链状分子和第一链状分子的一端固定在基底上，并且第二链状分子的长度未达到第一链状分子被环糊精包合的部分；所述蛋白质通过修饰在第一链状分子和/或环糊精上的活性基团固定在聚轮烷上；优选地，所述蛋白质通过环糊精上的活性基团固定于环糊精上。
2.如权利要求1所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述基底包括金属，如金、银、钼、 铜、铝和/或铬；金属氧化物，如A1203、TiO2, SnO2 ；金属和金属氧化物以各种形式复合而成的基材；以及Si，玻璃，石英和/或高分子聚合物；优选的基材选自玻璃、高分子聚合物以及表面蒸镀50纳米厚的金的高折射率玻璃基
3.如权利要求1或2所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述第二链状分子包括聚乙 ニ醇、硫醇以及有类似结构的分子，分子量为50 10000，进ー步优选为50 1000 ；所述第 ー链状分子包括聚乙ニ醇、聚丙ニ醇、聚ニ苯己三烯、具有相应类似结构的分子以及前述化合物組成的嵌段化合物，分子量为400-50000，进ー步优选为400 10000 ；组装于基底的第一链状分子和第二链状分子的摩尔比例为1 0 1 100000，进ー步优选为1 1 1 1000，更优选为 1 10 1 100;优选地，所述环糊精选自α-环糊精、β-环糊精和/或γ-环糊精；进ー步优选为 α-环糊精和/或β -环糊精；所述聚轮烷超分子层中第一链状分子和环糊精的摩尔比例为1 1 1 100，进ー步优选为1 2 1 20，更优选为1 5 1 10;优选地，所述第一链状分子和第二链状分子通过一端的固定基团固定在基底上，所述固定基团包括单巯基、双巯基、羧基、氨基、氨基硅烷，通过共价键与基底连接；第二链状分子的另一端用惰性基团修饰，所述惰性基团包括？；第一链状分子的另一端和/或环糊精上的活性基团包括-C00H、-NH2、-SH、乙ニ胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、链霉亲和素、 马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、环氧、-CH0、NTA-螯合基团、-OH、-CH3和/或-0CH3。
4.如权利要求1-3所述的蛋白质原位表达芯片，所述蛋白质包括酶、病毒的特征蛋白、 細胞内单个行使功能的蛋白以及复合蛋白中的一个单体蛋白；优选地，所述蛋白质来自一种或多种模板分子(6)的原位表达，所述模板分子固定或不固定于所述芯片的表面修饰层，包括RNA和DNA，如单链或双链的环状DNA、线性DNA或 PCR扩增产物；优选地，所述模板分子通过第一链状分子和/或环糊精上的活性基团固定于所述表面修饰层的聚轮烷上；优选地，所述模板分子通过第一链状分子上的活性基团固定于第一链状分子上；优选地，所述模板分子含有ー种或多种标签，使表达的蛋白质带有位于其不同位置的一种或多种标签，从而使得所述蛋白质通过标签连接于第一链状分子和/或环糊精的活性基团上；优选地，所述聚轮烷上第一链状分子和/或环糊精的活性基团还连接了对所述标签具有特异亲和性的捕获分子，所表达的蛋白质通过捕获分子固定于第一链状分子和/或环糊精上，所述捕获分子包括蛋白质、多肽和糖类；进一步优选地，所述捕获分子通过环糊精上的活性基团连接于环糊精上，从而使表达的蛋白质固定于环糊精上。
5.如权利要求1-4中任一项所述的蛋白质原位表达芯片，其中，所述蛋白质的标签包括酶类、多肽结合位点、特异识别多肽的肽段、识别金属螯合的肽段以及识别生物素链霉素的肽段，所述标签的数量可以为ー个或ー个以上，其位置可以在蛋白质的C端或N端，其与蛋白质之间可以相邻，亦可以相隔数个或数十个氨基酸；优选地，所述蛋白质原位表达芯片上同时包含编码蛋白质的模板分子和捕获该蛋白质的捕获分子；优选地，所述模板分子和捕获分子之间的摩尔比例为10 1 1 100，进ー步优选为 5 1 1 50，更优选为1 1 1 10;优选地，所述蛋白质可以由単一或多种模板分子表达后经原位组装成具有功能的蛋白质复合体，经捕获分子的识别固定于聚轮烷上；进一步优选地，所述蛋白质复合体通过捕获分子固定于环糊精上。
6.ー种用于构建蛋白质原位表达芯片的方法，其中，所述方法包括以下步骤1)选取适合的基底，清洗表面；2)选取适合的第一链状分子、第二链状分子和环糊精，其中第二链状分子一端含有能够固定到基底的固定基团，并且长度短至无法被环糊精包合或者使其另一端为惰性基团， 使其不能和环糊精发生包合反应；第一链状分子一端含固定到基底的固定基团，另一端和 /或环糊精含有用于固定蛋白质的活性基团；3)配制步骤幻中第一链状分子和第二链状分子的混合溶液，将混合溶液用于处理基底表面，使第一链状分子和第二链状分子固定于基底表面后，清洗表面；4)在基底表面包合步骤幻中的环糊精分子，使基底表面形成由第一链状分子和环糊精組成的聚轮烷，从而聚轮烷和第二链状分子形成表面修饰层，清洗表面；优选地，所述环糊精采用lng/L到饱和浓度的水溶液；5)选择細胞裂解液和编码要固定的蛋白质的模板分子，将模板分子溶解于细胞裂解液中，然后用細胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质，反应温度为20°C 35°C，反应时间为 30分钟 180分钟；优选地，反应温度为约30°C左右，反应时间约为90分钟左右；6)降低温度使蛋白质固定在第一链状分子和/或环糊精的活性基团上，反应温度为 10°C 30°C，反应时间为10分钟 过夜；优选地，反应温度为约15°C，反应时间为约30分钟左右；蛋白质充分固定后，清洗表面；可选地，在步骤幻中，选择含有用于固定蛋白质的活性基团的环糊精，修饰第一链状分子的另一端使其含有用于固定模板分子的活性基团；在步骤幻中，选择合适的模板之后使其固定于第一链状分子的活性基团上，然后使細胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质；优选地，在上述方法中，所述步骤幻的环糊精的活性基团上还含有用于捕获蛋白质的捕获分子，当步骤幻中含或不含模板分子的細胞裂解液在芯片表面孵育产生蛋白质后，所述蛋白质通过捕获分子固定于环糊精的活性基团上；优选地，所述步骤幻可以通过清洗芯片后再次加入含或不含模板分子的細胞裂解液重复进行，使得模板分子充分表达蛋白质。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述步骤5)和6)在微反应腔进行，将用于表达的細胞裂解液置于微反应腔中，使经过处理的基底表面与微反应腔中的細胞裂解液接触，以使模板分子表达蛋白；可选地，如模板分子未固定于聚轮烷上，将模板分子固定于微反应腔的表面；优选地，所述微反应腔在反应前经亲水处理。
8.ー种用于构建如权利要求1-5所述蛋白质芯片的装置，其中，所述装置为制作成阵列的微反应腔，将用于表达蛋白质的細胞裂解液置于所述微反应腔中，通过与经过预处理的芯片基底相接触，使模板分子表达蛋白并固定于基底上从而构建蛋白质芯片；优选地，所述模板分子经预处理固定于聚轮烷上；或者，所述模板分子被加入到細胞裂解液中；或者，所述模板分子固定在所述微反应腔的表面；优选地，制备微反应腔的材料包括聚ニ甲基硅氧烷和/或PMMA，其中，模具整体需要与基底大小匹配，微反应腔数量为1 1000个，每个微反应腔形状为长方体空间或圆柱体空间，其底部面积约IOOnm2 1cm2，高度约IOnm 1cm。
9.如权利要求1-5中任一项所述的蛋白质芯片的应用；优选地，所述芯片用于检测与所述蛋白质相互作用的物质，所述物质包括蛋白质、DNA、 RNA、糖类、脂类以及其他小分子。
10.如权利要求8所述的装置在构建蛋白质芯片中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种固定量高、蛋白质活性高且有序固定的三维蛋白质原位表达芯片，该芯片包括基底(1)、表面修饰层以及固定在表面修饰层上的蛋白质(5)；其中表面修饰层包括第二链状分子(4)和由第一链状分子(3)和环糊精(2)组成的聚轮烷，所述第二链状分子和聚轮烷通过第二链状分子和第一链状分子一端的固定基团固定在基底上。本发明还提供了构建该蛋白质芯片的方法和装置，并进一步提供了所述蛋白质芯片、构建方法和装置的应用。
文档编号G01N33/68GK102565415SQ20101059560
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者周大苏, 哈维尔·巴蒂斯塔·佩雷斯, 宋炉胜, 朱劲松, 王艳梅, 程志强, 阿密达·兰德 申请人:国家纳米科学中心