专利名称：一种检测环境雌激素效应的试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测环境雌激素效应的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
随着工农业的飞速发展，大量无机物、有机物不断被生产出来，环境作为人类和各种生物生存的基�。媸背性赝饨缗欧诺姆掀镏�。20世纪60年代，人类就开始意识到这些有毒有害化学物质对人类和生物所产生的各种不利影响，尤其是对水生生态环境的影响，因为大部分化学物质的最终归宿是水环境，途径是直接排放或是通过水气相互交换过程进入水环境。化学污染物不仅仅破坏自然资源的利用价值，例如DDTs会通过食物链�：Ω髦炙窈陀憷嗟纳婕胺毖埽绕涫嵌阅切└哂吨掷啵踔镣ü笃肥沟眉氐厍�(如北极熊)同样遭受到威胁，这最终会导致生态系统的崩溃，�：θ死啾旧�。
在这些化学物质当中，那些能够以不同途径干扰生物体正常内分泌的物质被称为内分泌干扰物(EDCs)，如引起雌激素效应、抗雌激素效应、雄激素效应、抗雄激素效应等的化学物质。这些物质的环境水平很低，对生态的�：ψ饔弥挥型üて诒┞恫拍芄槐还鄄斓剑虼硕匀死嗟奈：苣言诙唐谀诩右耘卸�。而一旦�：ψ饔帽涞妹飨裕敲春蠊簿湍岩钥刂�。这就要求建立一种早期的警报系统(生物标志物)来作为环境污染导致的生态系统即将遭受破坏的信号。当环境发生变化时，尤其是受到外源污染时，高水平的生化变化会先于早期的生物学变化，生物标志物就可以从分子、细胞和组织水平上及时、准确地反映整个生物体的生理参数、生化组成、细胞遗传物质的变化。因为不同组织之间的生物标志物可以作为有毒物质进入有机体的预警信号，当这种微观变化累积到一定程度时即会引发机体的变异，从而使得建立一种早期的生物标志物来及时反映生物体可能即将发生的生物学变化成为了可能。毒性试验对于环境生物监测(BM)来说，有着自身的局限性，这是因为它们不能合理解释化学物质在环境中的分配行为、代谢行为、吸附行为、积累行为以及本身和代谢后的毒理效应。生物标志物反应与生物机体特征(如存活、繁殖)之间建立的一种特殊的联系，将为生物标志物在环境评价方面的应用提供一个具有深远意义的基础。
对于如何选择监测生物，既要根据分析目的选择那些分布广泛的物种，同时还要有一些其它方面的考虑。在水环境中，鱼作为能量的传递者将能量从低营养级生物转移到高营养级生物，同时可以被广泛的捕获。鱼类对正确理解环境中有毒物质在生物体内的吸收、代谢行为以及引起的生理生化反应有着重要意义，因此，鱼类被选为环境监测生物。大多数生物标志物看起来可以直接应用到某一种特定的鱼体检测，但考虑到不同鱼类之间不同的生理学特征和环境污染引起不同的生物标志物反应，因此需要选择多种类进行检测以相互补充，从而为正确评价生态环境提供可靠性数据。
从理论上来说，正常情况下一种污染物应激就会引发一级生物学反应，也就可以作为一种生物标志物。而当污染物水平超出一定界限(污染物剂量和暴露时间)时，污染物-剂量反应就会脱离正常范围，使得生物体在更高水平上显示出多重作用效应。这就需要对生物所受污染建立早期的预警系统。而生物标志物可以看作是生物体受到一定毒理物质暴露后产生的早期生理生化反应，这从理论上可以作为生物反应的指示器，为外部物质暴露和体内反应之间搭建了桥梁。一般来说，细胞水平上的生物标志物相对于生物学组织具有更普遍意义，因为对于生物体而言，各种生化反应非常相似。因此好的生物标志物应该能够灵敏、快速的反映生物体所发生的微妙变化。在健康风险评价中，当生物体受到环境外源污染物作用后，生物标志物就可以用于阐明它们之间的因果关系、剂量-效应关系等。一般认为，生物标志物是反映生物体受到外源污染与所发生的生理效应中间的补偿反应。当这些补偿反应开始发生后，有机体存活的可能性就开始下降。因为当生物体遇到生存环境变动时，开始启动的补偿性反应就已经开始威胁生物体自身的安全了。利用生物标志物进行环境监测最大的优点就是它们可以为污染物所可能引起的后继生物学变化提供有用信息，而不仅仅是量化环境污染物水平。
正常情况下，繁殖季节之前卵生雌性生物体内雌激素水平升高，刺激肝细胞分泌卵黄蛋白原(Vitellogenin，VTG)，VTG通过血液循环进入卵巢，在经过滤泡细胞的吸收、转运，最后由卵母细胞本身微绒毛的微胞饮作用摄入卵质内，分解形成卵黄磷蛋白和卵黄高磷蛋白，以作为胚胎发育的前期内源营养和能量的来源。这个过程主要发生在卵母细胞发育的后期阶段，同性腺大生长期时卵母细胞的体积急剧增大、卵黄的积累是一致的。其中雌激素起着一个重要的调节作用，即在性腺的发生、发育、配子的形成、成熟过程中起到激发、反馈调节内分泌的作用。这一过程雄性生物体内不会发生，但雄性生物肝细胞核内仍然存在雌激素受体和VTG表达基因。当环境中存在雌激素和类雌激素物质时，就会以同样的途径刺激雄性生物肝细胞分泌VTG，由于缺少正常的代谢、分解途径，异常产生的VTG就会在生物体内(尤其是雄性生物)累积，阻碍正常的代谢。同时，雌/类雌激素物质还会对生物体的正常内分泌系统产生干扰作用，引发一系列的生理病变，并威胁到生物种群的繁衍和生态环境的健康、持续发展。而每种鱼VTG分子量、结构性征是不同的(已经通过SDS-PAGE和Western blotting方法证实)，这说明了鱼体所产生的VTG具有种(或属)的特异性。这样就需要针对不同种的鱼类制备不同的特异性抗体，以用来准确反映环境雌激素存在水平。鲫是一种分布广、易捕获、普遍性的鱼类。
免疫系统作为针对侵入物质的主要防御机构，所有外源物质(称为抗原)均能够刺激机体免疫系统产生针对性的应答反应，产生特异性的抗体。抗原和抗体的特异性结合促使机体产生一系列反应，最终使得抗原物质被机体代谢出体外，机体恢复正常。许多分子都能引起免疫应答，而每种抗原分子各有其独特的形状，从而导致抗原抗体特异性反应。较小的抗原可能只有一个抗原决定部位，而较大、较复杂的分子可能有的抗体-抗原相互作用的基础是两个互补形状的分子正好能配成一对。ELISA方法就是根据这种抗原--抗体间的特异性结合，将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，即为酶结合物。该酶结合物在酶的催化作用下发生水解、氧化反应，生成有色产物，因为酶结合物的活性与产物呈现的色泽浓度成正比，并反映被测抗原的量，因此根据颜色的有无和深浅，来定位或定量抗原。而根据所产生抗原水平，就可以判断水域环境中环境激素的存在水平及其可能带来的生态影响。
发明创造内容本发明的目的是提供一种较灵敏地检测环境雌激素效应的试剂盒。
本发明所提供的检测环境雌激素效应的试剂盒，它包括包被在酶标板上的鲫卵黄蛋白原多克隆抗体，鲫卵黄蛋白原单克隆抗体和酶标记的二抗。
为了更方便现场操作，所述试剂盒还包括标准浓度的鲫卵黄蛋白原、氧化剂、显色剂和质控血清。
所述鲫卵黄蛋白原多克隆抗体优选的为鲫卵黄蛋白原兔多克隆抗体；所述鲫卵黄蛋白原单克隆抗体优选的为鲫卵黄蛋白原鼠源单克隆抗体；所述酶标记的二抗优选的为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗。
所述鲫卵黄蛋白原多克隆抗体、鲫卵黄蛋白原单克隆抗体及二抗均可按常规方法制备。
所述酶标板可以是96孔单条酶标板，也可以是双条可拆酶标板。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测环境雌激素效应的试剂盒的方法。
本发明所提供的制备上述检测环境雌激素效应的试剂盒的方法，包括以下步骤1)制备鲫卵黄蛋白原多克隆抗体，并包被于酶标板上，用BSA封闭；2)制备鲫卵黄蛋白原单克隆抗体，并与等量甘油混合；3)制备用酶标记的二抗；4)将步骤1)中得到的鲫卵黄蛋白原多克隆抗体、步骤2)中得到的鲫卵黄蛋白原单克隆抗体及将步骤3)中得到的用酶标记的二抗共同包装，得到检测环境雌激素效应的试剂盒。
所述鲫卵黄蛋白原多克隆抗体、鲫卵黄蛋白原单克隆抗体和酶标记的二抗均可按常规方法制备。所述鲫卵黄蛋白原多克隆抗体优选的为鲫卵黄蛋白原兔多克隆抗体；所述鲫卵黄蛋白原单克隆抗体优选的为鲫卵黄蛋白原鼠源单克隆抗体；所述酶标记的二抗优选的为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗。
本发明巧妙地利用鲫卵黄蛋白原并结合免疫学ELISA反应机理，提供了一种简便、高效、灵敏地检测环境中雌激素效应的试剂盒。相对于其它的生物种而言，鲫在我国分布十分广泛，并且适应能力极强，几乎在各个水域均有分布，因此为环境雌激素的调查取材提供了极大的方便，也为判断不同水环境受环境雌激素污染及其对生物造成的影响提供了不可缺少的生物材料。本发明的检测环境中雌激素效应的试剂盒操作简便、快速，没有特殊的仪器要求，样品需要量少，从而大大降低了分析成本并提高了分析效率。本发明的试剂盒为检测我国水环境中可能存在的环境雌激素污染行为提供了重要的分析手段，也为分析水环境中生物体健康所受到的影响以及环境雌激素对生态可能造成的影响提供了一种新的工具。本发明具有广泛的应用前景，尤其是对于那些不具备大型分析仪器的实验室和科研机构具有广泛的应用前景。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为本发明的试剂盒检测效能曲线具体实施方式
实施例1、鲫卵黄蛋白原单克隆抗体的制备将鲫卵黄蛋白原经乳化(弗氏完全佐剂和不完全佐剂)后注射到BalB/C小鼠肢周、背部多点，剂量为50μg/0.5ml/只，每10天一次，共免疫四次(最后一次为脾免25μg/0.5ml/只)；同时培养骨髓瘤细胞Sp2/0至细胞呈圆满、透亮、个体均匀后，取免疫小鼠脾，与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，37℃、HAT培养基、CO2培养箱培养，每2天换半液，2周后间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞并换HT培养液。将筛选所得阳性细胞克隆化培养(间接ELISA检测)，扩大化培养后冻存部分细胞，部分注入小鼠体内，以诱生含有抗体的腹水。10天后连续取腹水，离心4500rpm/min，30min，腹水上清保存于-80℃超低温冰箱中。提纯腹水采用辛酸-饱和硫酸铵方法，提纯抗体经PBS、4℃条件下透析24小时以上，中间换液3-4次。用BaCl2检测无沉淀产生。然后将抗体与等量甘油混匀，分装，保存在-20℃冰箱中。ELISA法测定抗原抗体的亲合常数Kaff为7.0×108l/mol。
实施例2、鲫卵黄蛋白原ELISA试剂盒的制备首先将按常规方法制备的鲫卵黄蛋白原兔多克隆抗体包被于单条可拆酶标板(聚苯乙烯板)上，BSA封闭，37℃、2h后，洗涤，置于4℃条件下密封保存、备用。同时配制实验室诱导、提纯制备的鲫卵黄蛋白原标准浓度。将上述抗原、鲫卵黄蛋白原兔多克隆抗体，鲫卵黄蛋白原鼠源单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠二抗、显色底物(TMB)、终止液、洗涤液(PBS+0.05％体积的Tween20)、鲫阴性血清包装得到试剂盒，试剂盒中每种试剂分别为鲫卵黄蛋白原多克隆抗体包被的酶标板；鲫卵黄蛋白原鼠源单克隆抗体100μl(稀释1000倍使用)；鲫卵黄蛋白原标准浓度100μl(1mg/ml)；HRP标记二抗(稀释2500倍使用)；显色液PB、底物(TMB)、过氧化氢(使用时1000∶10∶1.5倍使用)；终止液(2mol/L H2SO4)为5ml；PBS(配成2L使用)；TWEEN20∶1.0ml；鲫阴性血清为100μl(稀释500倍使用)。
实施例3、鲫卵黄蛋白原ELISA试剂盒对环境雌激素效应污染水平的检测用实施例2得到的试剂盒对E2诱导鲤、鲟和从环境中捕获的狼鱼、梭鱼、鲈、铜鱼进行交叉测定，分析样品中可能具有的卵黄蛋白原。具体过程如下选择E2诱导鲤、鲫、鲟和从环境中捕获的狼鱼、梭鱼、鲈、铜鱼，抽血分离得血清，低温保存，同时将组织材料固定保存备于生化分析。测定样品时，将标准浓度的鲫卵黄蛋白原稀释成0.5、0.8、1.0、1.2、1.4μg/ml和适当稀释的样品同时加入酶标板中(100μl/孔)，37℃孵育1h后洗涤，加入鲫卵黄蛋白原鼠源单克隆抗体(稀释成1000倍，100μl/孔)，37℃孵育1h，后洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(2-3％脱脂奶粉稀释2500倍，100μl/孔)，37℃孵育1h，洗涤，加入底物液(100μl/孔)暗处反应10-15min，加入2M H2SO4终止液(50μl/孔)，酶标仪(450nm)比色测定吸光度值(OD450nm)，根据标准曲线定量样品中卵黄蛋白原含量OD(样)＝OD(样)-2OD(阴性)。结果显示鲤的交叉明显(66.9％)，而鲟和狼鱼、梭鱼、鲈、铜鱼则没有明显的交叉(使用HPLC检测具有一定水平的VTG)。这说明本试剂盒具有非常强的特异性。
通过本试剂盒，可以快速、灵敏的检测鲫血清(或血浆)中可能含有的卵黄蛋白原，只需要3-4小时就可以得出结果，灵敏度可达50ng/孔。其检测效能如图1所示，结果表明该方法的线性范围在500-1400ng/ml，回收率在95.95-108.5％。测定时所需要的样品量(血清或者血浆)非常少，大约100μl左右即可。图1中VTG即为双夹心法测定鲫卵黄蛋白原标准曲线Y＝0.7175X-0.2971(R2＝0.98)，所配制标准浓度抗原(0.5、0.8、1.0、1.2、1.4μg/ml)。
权利要求
1.一种检测环境雌激素效应的试剂盒，它包括包被在酶标板上的鲫卵黄蛋白原多克隆抗体，鲫卵黄蛋白原单克隆抗体和酶标记的二抗。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记为辣根过氧化物酶标记。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包标准浓度的鲫卵黄蛋白原。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括氧化剂、显色剂和质控血清。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述鲫卵黄蛋白原多克隆抗体为鲫卵黄蛋白原兔多克隆抗体。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述鲫卵黄蛋白原单克隆抗体为鲫卵黄蛋白原鼠源单克隆抗体，所述酶标记的二抗为羊抗鼠二抗。
7.一种制备检测环境雌激素效应的试剂盒的方法，包括以下步骤1)制备鲫卵黄蛋白原多克隆抗体，并包被于酶标板上，用BSA封闭；2)制备鲫卵黄蛋白原单克隆抗体，并与等量甘油混合；3)制备用酶标记的二抗；4)将步骤1)中得到的鲫卵黄蛋白原多克隆抗体、步骤2)中得到的鲫卵黄蛋白原单克隆抗体及将步骤3)中得到的用酶标记的二抗共同包装，得到检测环境雌激素效应的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于还将标准浓度鲫卵黄蛋白原包装进所述检测环境雌激素效应的试剂盒。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于还将氧化剂、显色剂和质控血清包装进所述检测环境雌激素效应的试剂盒。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述鲫卵黄蛋白原多克隆抗体为鲫卵黄蛋白原兔多克隆抗体；所述鲫卵黄蛋白原单克隆抗体为鲫卵黄蛋白原鼠源单克隆抗体，所述酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗。
全文摘要
本发明公开了一种检测环境雌激素效应的试剂盒及其制备方法，本发明所提供的检测环境雌激素效应的试剂盒，它包括包被在酶标板上的鲫卵黄蛋白原多克隆抗体，酶标记鲫卵黄蛋白原单克隆抗体。该试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)制备鲫卵黄蛋白原多克隆抗体，并包被于酶标板上，用BSA封闭；2)制备鲫卵黄蛋白原单克隆抗体，并用酶标记，将标记的抗体与等量甘油混合；3)将步骤1)中得到的鲫卵黄蛋白原多克隆抗体与步骤2)中得到的酶标记鲫卵黄蛋白原单克隆抗体共同包装，得到检测环境雌激素效应的试剂盒。本发明的试剂盒为检测水环境中可能存在的环境雌激素污染行为提供了重要的分析手段和工具。
文档编号G01N33/74GK1624483SQ20031011578
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月2日 优先权日2003年12月2日
发明者胡建英, 邓宝山, 郭振泉, 安立会, 朱修义 申请人:北京大学
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