专利名称：利用具有环氧基的星状聚乙二醇衍生物制备水凝胶生物芯片的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备生物芯片的方法，更具体的是，涉及利用凝胶基质制备生物芯片的方法。
背景技术：
人类基因组计划的完成大大增加了对于能为遗传疾病的诊断，治疗和预防提供必需的大量遗传信息的有效方法的需求。尽管DNA聚合酶链式反应(PCR)和其自动化得以发展，但用于核苷酸测序的Sanger方法仍然是繁重的，而且需要精细处理，耗费大量的时间，精力和费用。因此，已经进行了大量尝试力图发现能够分析大量基因的新的核苷酸测序系统。
DNA芯片指的是小于1平方英寸的微矩阵，其通过将寡核苷酸探针固定在由硅，表面改性的玻璃，聚丙烯或活化的聚丙烯酰胺制成的固体表面上的几百到几十万(hundreds of thousands of)个合适的位置上而形成，其中每个探针包括几个到数百个核苷酸。在靶DNA片段与DNA芯片结合时，靶DNA片段与固定在DNA芯片上的寡核苷酸探针互补杂交。这种杂交可通过光学或放射化学方法进行观察和分析，以鉴定靶DNA的核苷酸序列。
DNA芯片的使用减小了DNA分析系统的大�。⑶依煤哿垦肪涂山幸糯治�。另外，靶DNA的多重序列可以同时进行分析，由此可方便，快速而又低费用地提供靶DNA的遗传信息。DNA芯片可在短时间内分析大量的遗传信息和基因相关性。因此，预计DNA芯片可广泛地应用在，例如，遗传疾病和癌症的诊断，突变体和病原体的检测，基因表达的分析，药物的发现等。此外，基于遗传重组技术，DNA芯片可用作微生物或污染物检验器以发现解毒基因，并进一步大规模地制备解毒药。DNA芯片可导致大大改进大多数的生物工业，包括药用作物或低脂肪肉的生产。
DNA芯片根据固定在其上的探针类型可将其分为寡-芯片和cDNA芯片。根据制备方法可将DNA芯片分为石印(lithography chip)芯片，针型点样(pin-type spotting)芯片，喷墨型点样(pin-jet type spotting)芯片，将DNA与支持物电子地结合的电子定位(addressing)DNA芯片。
第一代DNA芯片是二维(2D)芯片，其中寡核苷酸附着于支持物成为单层，由于附着于支持物的探针点与点之间的差异，在相对地比较杂交程度时，会造成相当大的错误，并且其灵敏度低，因此需要昂贵的同焦点荧光显微镜以检测杂交的DNA。而且，固体支持物的表面用有机溶剂和水溶液的混合物处理以诱导化学反应。
美国专利5744305公开了使用光敏保护基团通过光刻法制备的第一代DNA芯片的实例。在第一代DNA芯片中，各种聚合物诸如肽和寡核苷酸都排列在支持物上。
为了致力于改进第一代DNA芯片的缺点，开发了下面的第二代DNA芯片。美国专利5736257和5847019公开了制备生物芯片的方法，其中支持物上的羟基(OH)用硅烷处理以在支持物上形成乙烯基分子层，并通过丙烯酰胺的聚合作用在该分子层上形成网络层，利用光使其活化并形成图案以将网络层与生物材料结合。这些方法中，由于在乙烯基分子层上形成聚丙烯酰胺的3-D凝胶网络，固定在其上的探针的量的差异减小，芯片的灵敏度得到改进。然而，不利的是，费用高且需要长的分析时间。
美国专利5552270，5741700和5770721公开了使用第二代DNA芯片的DNA序列分析方法，所述芯片包括寡核苷酸阵列基质和固体支持物。基质与固体支持物经由凝胶层结合，形成一种相互以恒定距离间隔的方形点阵模式。在DNA芯片的制备中，在间距约30μm的两玻璃板间应用聚丙烯酰胺凝胶。移去大小为100×100×30μm3的一玻璃板，干燥剩下的覆盖有凝胶的玻璃板，并通过使用机械工具或激光除去部分凝胶而行成斑点图案。凝胶层的酰胺基团经化学反应转换成反应性酰肼形式，那些在其5’-末端具有N-甲基尿苷的DNA探针转换成二醛。通过寡核苷酸探针与反应性凝胶的反应将探针以三维形式固定在支持物上。
在较长的1-2天时间里通过多重加工制备DNA芯片，其中每一步加工后接一种彻底的清洗程序。因此，分析结果(yield)易受反应条件的影响，凝胶表面不规则将吸收靶DNA将增加背景噪声。
WO 00/65097和WO 00/2899公开了使用具有异氰酸(isocyanate)(NCO)基团的水凝胶的3-D DNA芯片。水凝胶是亲水性网络聚合物，在脱水状态为玻璃状的，有水的情况下膨胀形成凝胶。根据该文献，已知异氰酸根基团参与水凝胶和探针间以及水凝胶自身聚合时的共价结合。具有异氰酸根基团的水凝胶，例如具有异氰酸根基团的聚环氧乙烷(polyethyleneoxide)或具有异氰酸根基团的聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的共聚物，和在5’-末端具有胺基(amine group)的探针在水溶液中混合，这些探针以三维形式固定在凝胶上，并与玻璃表面的胺基反应以将探针附着在支持物上。
异氰酸根基团水解太快不易控制。为防止异氰酸根基团的水解，需要在低温下制备DNA芯片。随着那些既没有与探针共价结合又没有参与凝胶聚合的异氰酸根基团被水解，聚合作用被加速，从而使粘稠度增加并使点样针稳固。并且，二氧化碳的产生使点样大小难以控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种易于制备的灵敏度改进的水凝胶生物芯片。
本发明的另一目的是提供一种制备灵敏度改进的生物芯片的方法。
本发明提供一种制备水凝胶生物芯片的方法，包括将在其末端具有环氧基团的星状聚乙二醇衍生物，亲水的聚合交联剂和探针在水溶液中混合以形成混合溶液；并将混合溶液应用到支持物上以形成水凝胶，使探针固定到支持物上。
根据本发明制备水凝胶生物芯片的方法可包括形成由末端带有环氧基团的星状聚乙二醇衍生物与亲水的聚合交联剂组成的基质，将该基质与探针反应以形成基质探针偶联物。
根据本发明制备水凝胶生物芯片的方法如下详述。
首先，将星状聚乙二醇衍生物与过量的表氯醇和氢氧化钠反应使其末端具有环氧基团。接着，使用低分子量，优选具有亲水羟基基团，氨基基团或硫醇基团并且平均分子量约为60-100000的亲水聚合物来作为交联剂来形成基质。那些在其末端具有亲核基团的探针与基质共价结合以形成基质-探针偶联物。基质的形成和基质-探针偶联物的形成是依次或同时进行的。说明书中所用术语“探针”指的是所有特异地与靶物质结合，并用于通过对探针和靶物质间结合的分析测定靶物质的特性的物质。优选的是，探针包括核酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，和肽核酸(PNA)，蛋白质或寡肽。本发明中所用的低分子量的亲水性聚合物包括平均分子量例如为60-100000的聚乙二醇，聚亚乙基胺(polyethyleneamine)，聚环氧丙烷和多元醇。说明书中所用术语“星状聚乙二醇”指的是具有3种或更多方向分支，由此具有星状形式的PEG衍生物。因此，本发明星状PEG衍生物可通过交联剂交联并行成三维聚合物基质。
根据本发明，通过微点样将基质-探针偶联物固定在固体支持物(优选的是，对其表面进行处理以暴露酰胺基团)上以形成本发明的水凝胶生物芯片。用于固体支持物的合适材料包括玻璃，石英，硅，塑料，聚丙烯，聚碳酸酯和活化的丙烯酰胺等。
根据本发明制备水凝胶生物芯片的方法包括制备在其末端具有环氧基团的星状聚乙二醇衍生物、亲水的交联剂、和探针的混合物溶液，以及将混合物溶液固定在支持物上。
固定在下述条件下进行，例如温度约40-70℃，湿度约60-30％，优选的是40℃和60％，60℃和40％，或70℃和30％。通过固定而在支持物上形成的斑点图案因交联剂的类型和反应条件诸如混合比例，温度和湿度的不同而不同。在本发明特定的实施方案中，使用上述相同的聚乙二烯衍生物，亲水聚合交联剂，探针，和支持物。
本发明提供一种通过上述的制备水凝胶生物芯片的方法制备的水凝胶生物芯片。本发明水凝胶生物芯片包括固体支持物，与固体支持物共价结合的基质，与该基质共价结合的探针，其中所述基质是末端具有环氧基团的星状聚乙二醇衍生物与亲水交联剂的反应产物。
本发明还提供一种检测探针和靶样品间结合的分析方法，包括将包括待与探针结合的靶物质的靶样品应用到由本发明方法制备的水凝胶生物芯片上，并检测与所述探针特异性结合的靶物质。优选的是，用信号物质例如荧光染料标记探针以便易于检测靶物质。探针和靶物质之间的结合可通过许多方法检测，例如，荧光检测方法，电化学检测方法，质量(mass)检测方法，电荷检测方法，或光学检测方法，这些方法目前都得到广泛应用并根据标记靶物质的信号物质的类型而分类。
附图简述
图1是在肝细胞核因子-1α(HNF-1α)的全长野生型基因用作靶核苷酸时所显示的杂交结果照片。
图2是在杂合子突变体用作靶核苷酸时所显示的杂交结果照片，该杂合子突变体是通过在HNF-1α基因的外显子9的第5613位核苷酸后直接插入核苷酸A获得的；和图3是靶核苷酸与按照本发明实施例6制备的生物芯片杂交后，进行的荧光扫描结果的照片。
具体实施例方式
结合下面的实施例更详细的描述本发明。下述的实施例用于解释的目的并不意欲限制本发明的范围。
实施例1具有环氧基团的星状聚乙二醇的合成将7.5mL表氯醇和0.32g溴化四丁基铵加入到2mL NaOH溶液(50％重量)中并搅拌，缓慢地将1g季戊四醇乙氧基化物加入到上述混合物中，在室温搅拌18小时。通过薄层层析鉴定反应的完成。如果反应尚未完成，将该混合物进一步在60℃搅拌1小时。接着，向反应产物添加30mL水进行稀释并用40mL二氯甲烷提取三次。用40mL饱和NaHCO3将有机溶剂层洗三次，加入无水MgSO4，低压下除去有机溶剂。然后，将所得产物在真空中干燥两天以除去表氯醇残基。所得具有环氧基的星状聚乙二醇(PEG)衍生物通过H-NMR和利用0.1N HBr/冰醋酸对环氧基团进行滴定来鉴定。
实施例2肼(diamine)交联剂的合成将5g(9.2mmol)五(乙二醇)二甲苯磺酸酯溶于40ml DMF中，依次向该溶液中加入4.2g(64.1mmol)NaN3和0.5ml吡啶并在140℃搅拌18小时。低压下除去溶剂后，搅拌所得产物并添加200ml水，用100ml二氯甲烷提取。用100mL盐水将有机溶剂层洗三次，加入无水MgSO4，低压下除去有机溶剂。然后，将所得产物进行闪蒸塔层析(flash columnchromatography)(EA∶nHex＝1∶2)以分离二叠氮基中间产物。将该中间产物溶于30ml甲醇中，添加10％Pd-C(0.1当量)，接着使用氢气进行18小时的还原反应。催化剂利用硅藻土(Celite)垫(pad)除去，用乙醇洗该垫。将滤液和用于洗垫的乙醇混合，低压下除去溶剂以得到肼交联剂。
实施例3使用交联剂制备凝胶基质溶液(1)使用肼交联剂制备凝胶基质溶液100mg在实施例1中制备的具有环氧基的星状PEG衍生物加4ml水一起搅拌。将在实施例2中合成的5.8mg肼交联剂加入到上述混合物中，室温搅拌18小时，4℃液态下储存。
(2)使用PEG作为交联剂制备凝胶基质溶液将分子量为200，400，600，和1500的PEG分别溶于2N NaOH的水溶液中，并在冰浴中搅拌以获得不同的PEG交联剂溶液。
然后，将一部分在实施例1中制备的具有环氧基的星状PEG衍生物溶于碳酸盐缓冲液中(0.1M，pH9.1)。将所制得的PEG交联溶液缓慢地添加入该溶液中，并在室温中搅拌3小时。反应结束后，用二氯甲烷提取反应产物，低压下除去有机溶剂并储藏于4℃。
比较而言，在使用分子量为100000的PEG交联溶液制备凝胶基质溶液时，可得到固体反应产物。凝胶渗透层析的结果显示，鉴定出固体产物为具有5-6个环氧基团的二聚物而不是基质材料。因此证实，分子量低于100000的PEG可在本发明中用作交联剂。
实施例4通过点样凝胶基质-DNA偶联物溶液制备生物芯片将包括具有环氧基团的星状PEG的寡核苷酸探针，交联剂和寡核苷酸以4∶1∶4的当量比加入到实施例3中制备的凝胶基质溶液中，37℃搅拌，放置14小时以得到基质-DNA偶联物的点样溶液。
将点样溶液点样到玻璃支持物上，并于37℃湿室内放置4小时，所述支持物表面已通过处理暴露出胺基。为防止靶核酸附着于玻璃表面的不需要的部分，实施进一步的反应，使玻璃支持物上未点样位置的胺基带负电荷(这是控制背景干扰(noise)的必要步骤)，将所得的生物芯片储藏于干燥器中。
实施例5芯片检验芯片性能检验中，通过多重聚合酶链式反应(PCR)获得的全长野生型肝细胞核因子-1α(HNF-1α)基因和杂合子突变体用作靶核苷酸以与探针杂交，该突变体是在HNF-1α基因外显子9的第5613位核苷酸之后(指向3’-末端)直接插入核苷酸A获得的。在靶核苷酸的PCR中，将Cy3-dUTP加入到荧光标记的靶核苷酸中。
下面的寡核苷酸(SEQ ID Nos.1-34)用作探针。
对于靶核苷酸与探针的杂交，将0.1％6SSPET(含0.1％Triton X-100的Saline Sodium Phosphate EDTA)中20nM的靶核苷酸溶液和基质-DNA偶联物固定在芯片上，并于37℃反应16小时。室温中，依次用0.05％6SSPET和0.05％3SSPET将芯片各洗5分钟，室温风干5分钟，用扫描仪(Exon CO.，GenePix4000B)扫描。
SEQ ID No.1tgaacttTggacttc-与HNF-1α基因启动子区互补的探针，其中探针序列中间的T与野生型启动子第432位的碱基配对，其侧翼的探针序列与上述第432位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.2tgaacttGggacttc-与在野生型启动子第432位碱基处包含点突变(A→C)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.3gttttggGggggcag-与HNF-1α基因启动子区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型启动子第592位的碱基配对，其侧翼的探针序列与上述第592位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.4gttttggCggggcag-与在野生型启动子第592位碱基处包含点突变(C→G)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.5tgcagctGgctcagt-与HNF-1α基因外显子1区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子1的第733位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子1的第733位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.6tgcagctAgctcagt-与在野生型外显子1的第733位碱基处包含点突变(C→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.7gcactggGtgagccg-与HNF-1α基因外显子1区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子1的第806位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子1的第806位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.8gcactggAtgagccg-与在野生型外显子1的第806位碱基处包含点突变(C→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.9caaggggGagtcctg-与HNF-1α基因外显子1区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子1第856位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子1第856位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.10caaggggAagtcctg-与在野生型外显子1的第856位碱基处包含点突变(C→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.11cggtcgaGgggagct-与HNF-1α基因外显子1区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子1的第875位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子1的第875位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.12ggcggtcGagctggc-与缺失野生型外显子1第875-879位碱基的5个碱基的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.13accatctTcgccaca-与HNF-1α基因外显子2区互补的探针，其中探针序列中间的T与野生型外显子2的第1778位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子2的第1778位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.14accatctCcgccaca-与在野生型外显子2的第1778位碱基处包含点突变(A→G)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.15cacaacaTcccacag-与HNF-1α基因外显子2区互补的探针，其中探针序列中间的T与野生型外显子2的第1812位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子2的第1812位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.16cacaacaAcccacag-与在野生型外显子2的第1812位碱基处包含点突变(A→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.17gcgggccGccctgta-与HNF-1α基因外显子2区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子2的第1910位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子2的第1910位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.18gcgggccAccctgta-与在野生型外显子2的第1910位碱基处包含点突变(C→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.19acctctcGctgcttg-与HNF-1α基因外显子2区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子2的第1940位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子2的第1940位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.20acctctcActgcttg-与在野生型外显子2的第1940位碱基处包含点突变(C→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.21aaggggcGgaggaac-与HNF-1α基因外显子3区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子3的第2659位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子3的第2659位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.22aaggggcAgaggaac-与在野生型外显子3的第2659位碱基处包含点突变(C→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.23gaggaacCgtttcaa-与HNF-1α基因外显子3区互补的探针，其中探针序列中间的C与野生型外显子3的第2667位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子3的第2667位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.24gaggaacTgtttcaa-与在野生型外显子3的第2667位碱基处包含点突变(G→A)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.25cacctccGtgacgag-与HNF-1α基因外显子4区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子4的第3297位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子4的第3297位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.26cacctccAtgacgag-与在野生型外显子4的第3297位碱基处包含点突变(C→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.27tagacacGcacctcc-与HNF-1α基因外显子4区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子4的第3305位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子4的第3305位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.28tagacacAcacctcc-与在野生型外显子4的第3305位碱基处包含点突变(C→T)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.29caaccggCgcaaaga-与HNF-1α基因外显子4区互补的探针，其中探针序列中间的C与野生型外显子4的第3332位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子4的第3332位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.30caaccggTgcaaaga-与在野生型外显子4的第3332位碱基处包含点突变(G→A)的靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.31cctgagaTgccggcg-与HNF-1α基因外显子9区互补的探针，其中探针序列中间的T与野生型外显子9的第5613位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子9的第5613位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.32cctgagaTtgccggc-与在野生型外显子9的第5613位碱基之后直接插入碱基A所得的突变靶核苷酸互补的探针。
SEQ ID No.33tggcgctGagccggt-与HNF-1α基因外显子9区互补的探针，其中探针序列中间的G与野生型外显子9的第5688位碱基配对，其侧翼的探针序列与外显子9的第5688位碱基的侧翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.34tggcgctGagagccg-与在野生型外显子9的第5688位碱基之后直接插入碱基T和C所得的突变的靶核苷酸互补的探针。
探针与靶核苷酸杂交反应之后的扫描结果在图1和图2中显示。图1是用作靶核苷酸的全长野生型基因HNF-1α的结果。图2是用作靶核苷酸的杂合子突变体的结果，该突变体是通过在HNF-1α基因外显子9的第5613位碱基之后直接插入核苷酸A得到的。
在图1和2中，对于各个相同探针在芯片上点6个斑点，最上面一排自左向右，将SEQ ID Nos.1，2，3和4探针固定为斑点。在下一排，SEQ IDNos.5，6，7和8探针以同样的方式固定。剩余的直到SEQ ID No.34的探针以同样的方式点在芯片上，这里，斑点的大小为170±5μm，斑点间隔调整为375μm。
在测定变异系数(CV)时，相同探针组中点与点之间的差异为8％，芯片与芯片之间的变异为10.6％。与常规具有25-30％的点对点变异系数的2D芯片相比，证实本发明应用的3D固定技术可有效降低探针间的误差。CV表示为偏离平均值的标准偏差百分比。
如图1所示，与突变探针(即SEQ ID Nos.2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32和34)的固定斑点相比，野生型探针的固定斑点(即SEQ ID Nos.1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31和33)显示强的荧光强度。因此，用作靶核苷酸的全长野生型基因HNF-1α与无突变体的野生型探针的碱基杂交。
如图2所示，野生型探针(即SEQ ID Nos.1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31和33)的固定斑点观察到的结果与图1相似。然而，SEQ ID No.32探针(其是一突变探针)的固定的斑点，与图1的结果不同，它显示强的荧光强度。可容易地鉴定在HNF-1α基因外显子9区的第5613位核苷酸之后直接插入核苷酸A的插入突变。
实施例6利用在支持物上直接形成的基质制备生物芯片根据本发明，基质可直接在支持物上形成也可在与支持物分离的容器中制备。
在碳酸盐缓冲液(0.25mM，pH9.5)中将寡核苷酸探针(5’-tgttctcttgtcttg-3’SEQ ID No.35)，实施例1中制备的具有环氧基的星状聚乙二烯衍生物，和实施2中制备的肼交联剂，以1∶8∶8的比例混合。调整寡核苷酸的浓度，使其不超过400μm。然后，将该混合溶液与等体积的DMSO混合，并通过点样应用到已经过处理而暴露出酰胺基的玻璃表面。点样后，将生物芯片放置于60℃温度，40％湿度的烘箱中保温1小时，接着用琥珀酸酐进行后处理。后处理用以阻止玻璃表面未反应的氨基，具有环氧基的星状PEG衍生物的环氧基和探针的氨基的非特异性反应。
在所得生物芯片上，进行探针与靶核苷酸间的杂交反应。扫描芯片表面的结果在图3中显示。这里，所用的寡核苷酸是与探针互补的人工寡核苷酸。图3中，“C”针对的是该实施例中制备的生物芯片。“B”针对的是实施例4中制备的生物芯片。“A”为通过仅在玻璃支持物上点样DNA溶液制备的生物芯片。如图3所显示的，生物芯片“C”显示比生物芯片“B”的荧光强度大5-7倍，生物芯片“A”显示比生物芯片“B”的荧光强度大2-3倍。
如上所述，根据本发明可制备具有下述结构的3D生物芯片，其中该结构自其表面向空间突出，芯片灵敏度大大增强。另外，本发明的生物芯片可以方便有效且低费用地使用水溶液制备。
序列表序列表<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.，Ltd.)<120>利用具有环氧基的星状聚乙二醇衍生物制备水凝胶生物芯片的方法<160>35<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因启动子区互补的探针，其中中间的“t”碱基与野生型启动子第432位的碱基配对<400>1tgaactttgg acttc 15<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因的启动子区互补的探针，所述启动子区中第432位的碱基带有点突变(A-C)<400>2tgaacttggg acttc15<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因启动子区互补的探针，其中中间的”g”碱基与野生型启动子第592位的碱基配对<400>3gttttggggg ggcag15<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因的启动子区互补的探针，所述启动子区中第592位碱基有点突变(C-G)<400>4gttttggcgg ggcag 15<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因外显子1区互补的探针，其中中间“g”碱基与野生型外显子1的第733位的碱基配对<400>5tgcagctggc tcagt 15<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第733位碱基点突变(C-T)的HNF-1α基因的外显子1区互补的探针<400>6tgcagctagc tcagt15<210>7<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因外显子1区互补的探针，其中中间“g”碱基与野生型外显子1的第806位碱基配对<400>7gcactgggtg agccg 15<210>8<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第806位碱基点突变(C-T)的HNF-1α基因的外显子1区互补的探针<400>8gcactggatg agccg 15<210>9<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因外显子1区互补的探针，其中中间的“g”碱基与野生型外显子1第856位碱基配对<400>9caagggggag tcctg 15<210>10<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第856位碱基点突变(C-T)的HNF-1α基因的外显子1区互补的探针<400>10caaggggaag tcctg 15<210>11<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因外显子1区互补的探针，其中中间的“g”碱基与野生型外显子1第875位碱基配对<400>11cggtcgaggg gagct 15<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第875-879位碱基缺失的HNF-1α基因的外显子1区互补的探针<400>12ggcggtcgag ctggc 15<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-α基因外显子2区互补的探针，其中中间的“t”碱基与野生型外显子2的第1778位碱基配对<400>13accatcttcg ccaca 15<210>14<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第1778位碱基具有点突变(A-G)的HNF-1α基因的外显子2区互补的探针<400>14accatctccg ccaca 15<210>15<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因的处显子2区互补的探针，其中中间的“t”碱基与野生型外显子2的第1812位碱基配对<400>15cacaacatcc cacag 15<210>16<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第1812位碱基具有点突变(A-T)的HNF-1α基因的外显子2互补的探针<400>16cacaacaacc cacag 15<210>17<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因互补的探针，其中中间的“g”碱基与野生型外显子2第1910位碱基配对<400>17gcgggccgcc ctgta 15<210>18<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第1910位碱基具有点突变(C-T)的HNF-1α基因的外显子2区互补的探针<400>18gcgggccacc ctgta 15<210>19<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因的外显子2区互补的探针，其中中间的“g”碱基与野生型外显子2第1940位碱基配对<400>19acctctcgct gcttg 15<210>20<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第1940位碱基具有点突变(C-T)的HNF-1α基因的外显子2区互补的探针<400>20acctctcact gcttg 15<210>21<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因的处显于3区互补的探针，其中中间的“g”碱基与野生型外显子3的第2659位碱基配对<400>21aaggggcgga ggaac 15<210>22<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第2659位碱基具有点突变(C-T)的HNF-1α基因外显子3区互补的探针<400>22aaggggcaga ggaac 15<210>23<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因的外显子3区互补的探针，其中中间的‘C’碱基与野生型外显子3的第2667位碱基配对<400>23gaggaaccgt ttcaa 15<210>24<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第2667位碱基具有点突变(G-A)的HNF-1α基因的外显子3区互补的探针<400>24gaggaactgt ttcaa 15<210>25<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因外显子4区互补的探针，其中中间的“g”碱基与野生型外显子4的第3297位碱基配对<400>25cacctccgtg acgag 15<210>26<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第3297位碱基具有点突变(C-T)的HNF-1α基因的外显子4区互补的探针<400>26cacct ccatg acgag 15<210>27<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因外显子4区互补的探针，其中中间的“g”碱基与野生型外显子4的第3305位碱基配对<400>27tagacacgca cctcc 15<210>28<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第3305位碱基具有点突变(C-T)的HNF-10基因的外显子4区互补的探针<400>28tagacacaca cctcc 15<210>29<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-α基因外显子4区互补的探针，其中中间的‘C’碱基与野生型外显子4的第3332位碱基配对<400>29caaccggcgc aaaga 15<210>30<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中第3332位碱基具有点突变(G-A)的HNF-1α基因的外显子4区互补的探针<400>30caaccggtgc aaaga 15<210>31<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因外显子9区互补的探针，其中中间的“t”碱基与野生型外显子9的5613位碱基配对<400>31cctgagatgc cggcg 15<210>32<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中在外显子9第5613位碱基后插入‘a’碱基的HNF-1α基因外显子9区互补的探针<400>32cctgagattg ccggc 15<210>33<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与HNF-1α基因的外显子9区互补的探针，其中中间的‘g’碱基与野生型9的第5688位碱基配对<400>33tggcgctgag ccggt 15<210>34<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>与其中在外显子9的第5688位碱基后插入‘tc’碱基的HNF-1α基因外显子9区互补的探针<400>34tggcgctgag agccg 15<210>35<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸探针<400>35tgttctcttg tcttg
权利要求
1.一种制备水凝胶生物芯片的方法，包括将在其末端具有环氧基团的星状聚乙二醇衍生物，亲水的聚合交联剂和探针在水溶液中混合以形成混合溶液；和将该混合溶液加到支持物上以形成水凝胶，使探针固定到支持物上。
2.权利要求1的方法，其中混合包括将在其末端具有环氧基团的星状聚乙二醇衍生物和亲水的聚合交联剂混合以形成基质溶液；和将探针添加到基质中以形成包含基质溶液和探针溶液的混合溶液。
3.权利要求1的方法，其中在支持物上加混合溶液的步骤在温度为约40-70℃且湿度约60-30％的条件下进行。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中亲水聚合交联剂的平均分子量约为60-100000，其是具有羟基，氨基或巯基的星状聚乙二醇衍生物。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中探针是脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，肽核酸(PNA)，蛋白质或寡肽。
6.权利要求1或4中所述的方法，其中进一步包括处理支持物表面以含有胺基基团。
7.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中形成支持物的材料选自玻璃，石英，硅，塑料，聚丙烯，聚碳酸酯和活化的丙烯酰胺。
8.权利要求1-4中任一项所述的方法制备的水凝胶生物芯片。
9.一种检测探针和靶物质之间的结合的分析方法，包括将包含要结合探针的靶物质的样品加到权利要求1-4中任一项所述的方法制备的水凝胶生物芯片上；和检测与探针特异结合的靶物质。
10.权利要求9的分析方法，其中靶物质是荧光标记的生物分子。
全文摘要
本发明提供一种制备生物芯片的方法和由该方法制备的生物芯片。在制备生物芯片的方法中，在其末端具有环氧基团的星状聚乙二醇衍生物与低分子量的亲水聚合物反应以形成基质，探针与该基质共价结合并被固定在固体支持物上。所述生物芯片具有三维结构，其自其表面向空间伸出，并改进了芯片灵敏度。此外，所述生物芯片可以使用水溶液方便有效地制备，成本较低。
文档编号G01N33/544GK1483083SQ02802541
公开日2004年3月17日 申请日期2002年8月30日 优先权日2001年9月1日
发明者楠 许, 许楠, 宋美贞, 朴钟勉, 朴佳永 申请人:三星电子株式会社
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