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专利名称：细胞分散方法、细胞分散剂及细胞测定方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞分散方法、细胞分散剂及细胞测定方法。具体来说是涉及一 种将细胞培养中产生的细胞块和从生物体采集的细胞块分散的细胞分散方法、细胞分散剂 及细胞测定方法。
背景技术：
从细胞培养物和宫颈部位采集的细胞会形成几个细胞凝集在一起的细胞块。因 此，上述细胞用于显微镜观察(比如细胞诊断)或用流式细胞仪进行测定时，必须进行前处 理，分散细胞块。比如，专利文献1中，分散细胞块的方法公开的是使用胰蛋白酶等蛋白质分解酶 的方法。然而，用蛋白质分解酶分散培养基中的细胞块时，会优先分解培养基中所含蛋白 质。因此，细胞分散效果不充分。而且用蛋白质分解酶分散保存(固定)在酒精溶液中的 细胞块时，细胞分散效果也不充分。另一方面，用蛋白质分解酶分散磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中的细胞块时，蛋白 质分解酶可以分散细胞块。但是，在长时间反应中，蛋白质分解酶会溶解细胞膜。分散像宫 颈细胞那种含粘液附着细胞的细胞块时，蛋白质分解酶优先分解粘液。因此，细胞分散效果 也不充分。这种分散不充分的细胞或受破坏的细胞可能对显微镜观察(如细胞诊断)或流式 细胞仪测定会有影响。在先技术文献专利文献专利文献1 国际公开第2005/038044号手册。

发明内容
本发明正是针对上述情况，其目的是提供一种可以在降低对细胞的破坏的同时分 散细胞块的细胞分散方法、细胞分散剂及用这些测定细胞的细胞测定方法。本发明提供的细胞分散方法是一种将数个细胞凝集而成的细胞块在液体培养基 中分离成单个细胞的分散方法，其特征在于，在液体培养基中混合细胞块和氟树脂粒子。本 发明还提供一种用于分散细胞块的、含有氟树脂粒子的细胞分散剂。同时，本发明还提供一 种细胞测定方法，其包括在液体培养基中将数个细胞凝聚而成的细胞块与氟树脂粒子混合 的混合步骤以及用流式细胞仪测定上述混合步骤获得的混合物的步骤。采用本发明的细胞分散方法、细胞分散剂及细胞测定方法，可以在降低对细胞的 破坏的同时，分散细胞块。因此，采用本发明的细胞分散方法、细胞分散剂可以制备出适于 显微镜观察(如细胞诊断)和流式细胞技术的测定试样。用这种细胞测定方法可以更好地 运用流式细胞技术进行细胞测定。


图1为运用流式细胞法的细胞分析装置的结构框图；图2为细胞分析装置内光学检测部件的结构图；图3为实施例1在有氟树脂粒子的情况下搅拌获得的试样中的细胞的显微镜照 片；图4为参考例中在没有氟树脂粒子的情况下搅拌后细胞悬浮液中的细胞的显微 镜照片；图5为比较例1中与胰蛋白酶一起培养1. 5小时后的细胞的显微镜照片；图6为比较例1中与胰蛋白酶一起培养3小时后的细胞的显微镜照片；图7为比较例1中与胰蛋白酶一起培养46小时后的细胞的显微镜照片；图8为比较例2中用杵搅拌后的细胞悬浮液中的细胞的显微镜照片；图9为比较例2中用杵搅拌后的细胞悬浮液中的细胞的显微镜照片；图10为比较例2中用杵搅拌后的细胞悬浮液中的细胞胞核的染色图的显微镜照 片；图11为实施例2中在有氟树脂粒子的情况下搅拌所得试样中的细胞显微镜照 片；图12为实施例3在有氟树脂粒子情况下搅拌所得试样中的细胞显微镜照片；图13为PTFE粒子浓度与单一细胞和细胞块各自的比例的关系图；图14为有无PTFE粒子与单一细胞和细胞块各自的比例的关系图。
具体实施例方式1.细胞分散方法本发明的细胞分散方法是一种在液体培养基中将数个细胞凝集成的细胞块分离 成单一细胞的分散方法，其特征在于将细胞块和氟树脂粒子在液体培养基中混合。本说明书中所说的“细胞块”指数个细胞凝集而成的物质。在本发明中，比如可将 轻蹭生物粘膜所采集的、因粘液凝集在一起的细胞作为细胞块使用。具体来说，细胞块包括 轻蹭宫颈部、鼻腔和咽喉所采集的、含有细胞的物质等。在本发明中，也可以将数个细胞凝 集而成的物质保存在酒精溶液中作为细胞块使用。还可以将从生物采集的细胞培养后所获 得的细胞培养物作为细胞块使用。在本说明书中，所谓“分散细胞块”指从细胞块分离出组成细胞块的细胞，比如使 这些细胞分散在溶液中。本发明中的分散目标细胞块指单一个体之间、聚合体之间或单一 个体和聚合体凝集的巨大结构体。上述细胞块有可能影响细胞诊断或流式细胞技术的测 定。而本发明中被分散的“分散后细胞”的状态以2 6个细胞凝集的聚合体的状态或单 一个体的状态为宜，最好为单一个体的状态。在本发明的细胞分散方法中，细胞块的分散是通过氟树脂粒子进入连在一起的细 胞的缝隙、即细胞间的间隙，润滑细胞间的界面(使细胞间产生切应力)来实现的。细胞间 界面的润滑程度与氟树脂粒子进入细胞间缝隙的比例成正比，随其增大而加大。即，最好增 大氟树脂粒子进入细胞间缝隙的比例。为此，氟树脂粒子的粒径越小越好。此外，可以如下 加大氟树脂粒子进入细胞间缝隙的比例混合细胞块和氟树脂粒子时，提高氟树脂粒子在细胞块和氟树脂粒子的混合物中的浓度以及/或促进氟树脂粒子扩散。因此，在本发明的 细胞分散方法中，可以采用这些条件来更高效地分散细胞块。在本发明的细胞分散方法中， 还搅拌含有细胞块和氟树脂粒子的混合物(搅拌步骤)，促进在上述混合物中氟树脂粒子 的扩散，由此，在细胞间缝隙中，随氟树脂粒子固有的表面化学活性而产生的内在切应力和 液体力学作用产生的外在切应力这二个切应力发挥作用，可增强使用氟树脂粒子的效果， 从而能够便捷地分散细胞块。在本说明书中，使细胞分散的液体培养基可以使用水溶液、水溶性有机溶剂以及 水溶液和水溶性有机溶剂的混合溶剂。最好是水溶液或水溶液和水溶性有机溶剂的混合溶 剂。构成氟树脂粒子的氟树脂可以列举出聚四氟乙烯(PTFE)、四氟乙烯-全氟烷 氧基乙烯基醚共聚物(PFA)、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)、乙烯-四氟乙烯共聚物 (ETFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、乙烯-三氟氯乙烯共聚物(ECTFE)等。在本发明的细胞分散方法中，上述混合物中的氟树脂粒子浓度以0. 003质量％以 上60质量％以下为宜，最好是0. 2质量％以上3质量％以下。如果上述氟树脂粒子浓度在0. 003质量％以上，则含酒精的细胞保存液所固定的 细胞也可以充分分散。当分散未清洗的培养基中的细胞块时，氟树脂粒子浓度最好在0. 2 质量％以上。如果氟树脂粒子浓度在60质量％以下，通过本发明的细胞分散方法分散的细 胞可以适用于显微镜观察和流式细胞技术。将含有本发明细胞分散方法所分散的细胞的待 检试样(测定试样)用于流式细胞技术测定时，为了减少对细胞测定的影响、更易于清洗流 路，上述待检试样中的氟树脂粒子浓度低一些为好。将含有本发明细胞分散方法所分散的 细胞的待检试样用于显微镜观察时，要想在不让待观察的细胞浮游的状态下观察，上述待 检试样中的氟树脂粒子浓度低一些为宜。因此，要想获得既使细胞充分分散又适于用流式 细胞技术或显微镜观察的细胞，上述氟树脂粒子的浓度最好在3质量％以下。氟树脂粒子的粒径可根据待分散细胞的大小和本发明的细胞分散方法所分散的 细胞的用途适当选择。要使细胞块分散，必须使氟树脂粒子进入各细胞之间，润滑细胞间的 界面。为此，氟树脂粒子的粒径最好小于细胞的大小。氟树脂粒子的粒径相对于细胞的大 小以1/10以下为宜，最好在1/100以下。一般而言，植物细胞的大小为200 μ m左右，动物细胞的大小为30 μ m左右。动物 细胞中，宫颈部位的细胞有的有60 μ m左右大。比如当分散含有200 μ m左右大小的植物细 胞的细胞块时，氟树脂粒子的粒径以小于200 μ m为宜，小于20 μ m更好，最好是小于2 μ m。 当分散含有60 μ m左右大小的宫颈细胞的细胞块时，氟树脂粒子的粒径以小于60 μ m为宜， 小于6 μ m更好，最好是小于0. 6 μ m。而从控制氟树脂粒子飞溅、易于掌握氟树脂粒子的观 点来看，氟树脂粒子的粒径最大于0. 1 μ m。在本发明的细胞分散方法中，上述氟树脂粒子最 好使用含粒径大于0. 1 μ m小于200 μ m的粒子的粒子混合物。当含本发明细胞分散方法分散的细胞的待检试样用于显微镜观察进行的细胞诊 断时，如果待观察细胞和氟树脂粒子差不多同样大小的话，氟树脂粒子可能会妨碍显微镜 观察。因此，氟树脂粒子的粒径相对于细胞大小以1/10以下为宜，最好在1/100以下。当含有本发明的细胞分散方法分散的细胞的待检试样用于流式细胞技术时，上述 待检试样中的氟树脂粒子的粒径对测定的影响很小。流式细胞技术一般是测定反映待测物质大小的散射光强度和反映待测物质内部信息的荧光强度。细胞被显像剂染色，发出荧光， 但氟树脂粒子不会被显像剂染色，自己也不会发荧光。因此，根据有无荧光就可以辨别所测 物质是细胞还是氟树脂粒子。当含有本发明的细胞分散方法分散的细胞的待检试样用于流 式细胞技术时，氟树脂粒子的粒径相对于待测细胞的大小以1/10以下为宜，最好在1/100 以下。用这种粒径的氟树脂粒子，可以根据从散射光强度获得的大小信息中辨别是细胞还 是氟树脂粒子。因此，可以省略测定荧光强度的装置和程序。另外，在流式细胞技术中，待 测粒子数越多，越有可能超过装置的测定粒子数极限，且分析越费时，因此，待测粒子数以 少为宜。因此，只要氟树脂粒子的粒径比细胞大小小很多，就不会妨碍细胞数的测定，从而 可以减少不必要的计数。这种氟树脂粒子的平均粒径从易于操作的观点出发，以大于0. Ιμπι为宜，最好大 于0. 2 μ m，从氟树脂粒子进入细胞之间润滑细胞间的界面的观点出发，以小于200 μ m为 宜，小于10 μ m更好，最好小于5 μ m。上述平均粒径意指用光散射法测定的个数平均径。在本发明的细胞分散方法中，上述细胞块也可以是粘接在细胞培养基板的细胞 块。使粘接在细胞培养基板的细胞块分散的传统方法已知有使用蛋白质分解酶的细胞分散 法。但是，用此方法使蛋白质分解酶与细胞块长时间反应，蛋白质分解酶有时会溶解该细胞 块中的细胞的细胞膜。而与此相对，本发明的细胞分散方法使用上述氟树脂粒子，其优点在 于可以在不破坏细胞块中所含细胞的情况下将细胞块从细胞培养基板上剥离，分散成单个 细胞。在本发明的细胞分散方法中，与氟树脂粒子混合前的细胞块也可以包含在培养基 中。在本发明中，培养基可以是固体培养基、半固体培养基和液体培养基中的任意一种。细 胞块既可以粘接在细胞培养基板上，也可以不粘接在细胞培养基板上。但是，当象过去那样 用蛋白质分解酶分散含在培养基中的细胞块时，蛋白质分解酶会优先分解培养基中的蛋白 质，因此分散细胞的效果不够充分，无法达到目的。与此相对，本发明的细胞分散方法用上 述氟树脂粒子，可以充分分散培养基中的细胞块，在这一点上是很好的。在本发明的细胞分散方法中，与氟树脂粒子混合前的细胞块也可以含在磷酸盐缓 冲生理盐水中。此时，细胞块既可以粘接着细胞培养基板，也可以未粘接着细胞培养基板。 如果象过去那样用蛋白质分解酶分散磷酸盐缓冲生理盐水中的细胞块，使蛋白质分解酶与 细胞块长时间反应，蛋白质分解酶有时会溶解该细胞块中的细胞的细胞膜。而与此相对，本 发明的细胞分散方法使用上述氟树脂粒子，可以在不破坏磷酸盐缓冲生理盐水中的细胞块 所含细胞的情况下使细胞块充分分散。根据本发明的细胞分散方法，细胞块也可以包含宫颈细胞。当像过去那样用蛋白 质分解酶分散含有如宫颈细胞那种粘液附着细胞的细胞块时，蛋白质分解酶会优先分解粘 液，分散细胞的效果不充分，难以达到目的。而且，使蛋白质分解酶与细胞块长时间反应，蛋 白质分解酶有时会溶解该细胞块中的细胞的细胞膜。与此相对，本发明的细胞分散方法使 用上述氟树脂粒子，可以在不破坏宫颈细胞的情况下充分分散细胞块。在本发明的细胞分散方法中，与氟树脂粒子混合前的细胞块也可以固定化。固定 化的细胞块比如有从宫颈采集、保存在甲醇溶液中的细胞块等。当用蛋白质分解酶分散这 种固定化的细胞块时，如果反应条件与分散未固定化的细胞块同样的话，细胞块仍保持凝 集状态，细胞块分散不充分。而如果为了分散固定化的细胞块而使蛋白质分解酶与细胞块长时间反应的话，蛋白质分解酶有时会溶解构成该细胞块的细胞的细胞膜。与此相对，本发 明的细胞分散方法使用上述氟树脂粒子，可以在不破坏构成固定化的细胞块的细胞的情况 下充分分散细胞块。本发明的细胞分散方法还可以包含添加使细胞可视化的显像剂的步骤，即让细胞 块与能使细胞可视化的显像剂接触的步骤(以下称“可视化步骤”)。该可视化步骤可以和 上述细胞块与氟树脂粒子的混合同时进行，也可以在上述细胞块与氟树脂粒子混合之后进 行。在本发明中，也可以向上述细胞块与氟树脂粒子混合之前的细胞块或氟树脂粒子中添 加显像剂。在本说明书中，所谓“显像剂”指使在显微镜下观察不到或难以观察的细胞能够观 察到或易于观察的试剂，以及使用流式细胞仪检测不出的细胞能够检测到的试剂。显像剂 比如有染色细胞的细胞膜、细胞质和细胞核或细胞器官的染色剂等。具体而言，显像剂比如 有选择性地染色细胞核的碘化丙啶、染色整个细胞的台盼蓝等。这些显像剂不染色氟树脂 粒子。因此，即使实施流式细胞术或进行细胞诊断的试样中含有显像剂和氟树脂粒子，也可 以实施流式细胞术或进行细胞诊断。本发明的细胞分散方法还可以包含促进步骤，即在上述细胞块和氟树脂粒子的混 合物中加大氟树脂粒子进入细胞块所含细胞间缝隙的比例的步骤。通过这种促进步骤，可 以加大细胞间界面的润滑程度，更高效地分散细胞块。上述促进步骤只要能够加大氟树脂 粒子进入细胞块所含细胞间缝隙的比例，增大细胞间的切应力即可，比如搅拌上述细胞块 和氟树脂粒子的混合物一定时间(称“搅拌步骤”)、在含有细胞块的试样中添加氟树脂粒 子时给氟树脂粒子施加外力(如注入力等)等。上述搅拌步骤如可以通过对混合物施以旋 转力搅拌(如用杵和搅拌棒等搅拌等)、振动搅拌等。当上述促进步骤为搅拌步骤时，搅拌 时间无特别限定，只要本发明的细胞分散方法分散的细胞不会因切应力过度而受损即可。如过去那样用搅拌器等进行搅拌，产生的巨大剪切力分散细胞块时细胞有可能受 到破坏。如果以不破坏细胞的剪切力作用于细胞的话，细胞分散效果又不充分。对此，本发 明的细胞分散方法几乎不用剪切力就可以使细胞块分散。用本发明的细胞分散方法，即使 通过杵的搅拌施加一定程度的剪切力，也由于氟树脂粒子的润滑作用对细胞的破坏减小。 因此，采用本发明的细胞分散方法可以在保持单个细胞的形状的状态下分散细胞。因此本 发明的细胞分散方法分散的细胞最适于用作测定单个细胞形状的流式细胞技术和显微镜 观察的细胞试样。在本说明书中，所谓“破坏”比如指细胞破裂、断裂及细胞内的物质跑到细胞外等。2.细胞分散剂 本发明的细胞分散剂含有氟树脂粒子。本发明的细胞分散剂可以用于上述细胞分 散方法。用本发明的细胞分散剂，由于其含有氟树脂粒子，可以润滑细胞块所含细胞间的界 面，从而可以在抑制对细胞造成的破坏的同时，有效地分散细胞。本发明的细胞分散剂可以 是氟树脂粒子本身，也可以是将氟树脂粒子分散于溶剂(如上述液体等)的分散物。构成用于本发明细胞分散剂的氟树脂粒子的氟树脂和氟树脂粒子的粒径与上述 细胞分散方法一样。本发明的细胞分散剂最好还包含使细胞可视化的显像剂。用这种细胞分散剂分散 的细胞在流式细胞技术和显微镜观察中可以看得见，能检测出来或观察到，因此，适合作流式细胞技术和显微镜观察的待检试样。用于本发明细胞分散剂的显像剂与上述细胞分散方 法相同。当细胞分散剂含有氟树脂粒子和显像剂时，显像剂在细胞分散剂中的含量可以根 据待分散细胞的数量和细胞分散剂的用途等适当设定。3.细胞测定方法本发明的细胞测定方法包括在液体培养基中混合数个细胞凝集的细胞块与氟树 脂粒子的混合步骤及用流式细胞仪测定上述混合步骤所得混合物中的细胞的测定步骤。上 述混合步骤所得的分散细胞，由于细胞受损小、且被分散成单个细胞，适于作流式细胞技术 测定细胞的测定试样。上述混合步骤与上述细胞分散方法中的细胞块和氟树脂粒子的混合步骤同样进 行。在本发明的细胞测定方法中，在测定步骤之前还可以包括添加使细胞可视的显像剂的 步骤，即使细胞块与使细胞可视的显像剂接触的可视化步骤。在本发明的细胞测定方法中， 在上述测定步骤之前，还可以包含将上述混合步骤获得的混合物搅拌一定时间的搅拌步 骤。上述可视化步骤和搅拌步骤可以分别采取与上述细胞分散方法中的可视化步骤和搅拌 步骤同样的操作。下面，举例说明运用了流式细胞技术的细胞分析装置如何测定含有用氟树脂粒子 分散细胞块而获得的分散细胞的待检试样。图1为运用了流式细胞法的细胞分析装置的整体结构。细胞分析装置1的装置主 机2包括从测定试样检测细胞及其细胞核的大小等信息的光学检测部件3、信号处理电路 (信号处理部件)4、测定控制部件6、马达、螺线管(Actuator)和阀等的驱动部件7以及各 种传感器8。测定控制部件6 —边处理传感器8的信号，一边控制驱动部件7的动作，以此 来吸移和测定测定试样。此细胞分析装置1可以用于判断宫颈细胞是否含有癌细胞。细胞块的分散可以如下进行。将采自宫颈的细胞放入含酒精溶液(比如55质量％ 甲醇水溶液)的细胞保存液中并固定化，获得细胞悬浮液。细胞分散剂使用的是在水溶液 中加入60质量％氟树脂粒子和1质量％以下的显像剂碘化丙啶(PI)而得的细胞分散剂。 先在细胞悬浮液中加入细胞分散剂，使氟树脂粒子浓度为0. 003质量％以上60质量％以 下，制作混合物。然后，搅拌所得混合物，使细胞块分散，获得测定试样。PI有选择地染色细 胞核的显像剂，所以在分散后的细胞中可检出来自细胞核的荧光。所得测定试样放入试管，置于装置主机2的吸移管(无图示)下方，该吸移管吸移 试样，供给流动室。图2为光学检测部件3的结构图。透镜系统(光学系统)52将光源一半导体激光 器53射出的激光聚光于流经流动室51的测定试样。聚光镜M将测定试样中的宫颈细胞和 氟树脂粒子的前向散射光聚光于散射光检测器一光电二极管阳。聚光镜56将上述细胞或 细胞核的侧向散射光和侧向荧光聚光于分色镜57。分色镜57将侧向散射光反射到散射光 检测器一光电倍增管58，让侧向荧光透过，射向荧光检测器光电倍增管59。光电二极管55、 光电倍增管58和光电倍增管59将检测出的光转换为电信号，分别输出前向散射光信号、侧 向散射光信号和侧向荧光信号。这些输出的信号由无图示的前置放大器放大后，提供到上 述信号处理电路4 (参照图1)。
从检测出的宫颈细胞的前向散射光的信号获取反映细胞大小的值。从检测出的 宫颈细胞的侧向荧光的信号获取反映细胞核大小的值。宫颈细胞的大小约为60 μ m，细胞 核的大小为5 7μπι。如果这个细胞癌变，则细胞分裂频率异常增多，细胞核增大到10 15μπι。由此，N/C比(细胞核的大小/细胞的大小)比正常细胞增大。因此，检测细胞大 小和细胞核大小可以判断宫颈细胞是正常细胞还是癌细胞。另一方面，从检测出的氟树脂粒子的前向散射光的信号可以获得反映氟树脂粒子 大小的值。然而，氟树脂粒子不会被PI显像剂染色，故实际上不产生侧向荧光。因此，氟树 脂粒子的N/C比基本为0，比正常细胞和癌细胞的N/C比都小。S卩，从N/C比可以区分氟树 脂粒子、正常细胞和癌细胞。因此，即使测定试样中含有氟树脂粒子，也可以判断出宫颈细 胞中是否含有癌细胞。如上所述，用氟树脂粒子分散的细胞可以用于流式细胞术。实施例下面基于实施例详细说明本发明，但本发明不受这些实施例所限。实施例1 (在宫颈细胞诊断用样本中使用氟树脂粒子分散细胞的效果)将从宫颈部位采集的细胞用含酒精的细胞保存液[豪洛捷有限公司(Hologic Inc.)制，商品名freservCyt (注册商标)]固定，得到细胞试样。将此细胞试样以190Xg 在室温下离心分离5分钟，回收细胞。从回收的细胞中用吸移管取相当于150 μ L的量，作 为细胞悬浮液。另一方面，在3yL氟树脂粒子[聚四氟乙烯粒子(以下称“PTFE粒子”)]的水分 散液[旭硝子(株)公司制，商品名=Fluon (注册商标)PTFE分散(dispersion) AD911L, PTFE粒子的平均粒径(用光散射法测定)0. 25 μ m，PTFE粒子含量60质量％，液体密度 1.52]中加入60 μ L显像剂-0.5质量％台盼蓝染色液(Nacalai tesque (株)公司制)和 87 μ L水，得待检试样。台盼蓝是一种可使整个细胞(包括细胞膜和细胞核)显像的染料。用上述待检试样通过以下操作进行细胞分散处理。首先，在150μ L上述细胞悬浮 液中加入待检试样，使PTFE粒子浓度为0. 6质量％，显像剂一台盼蓝的浓度为0. 1质量％， 获得混合物。然后，以4000rpm用杵搅拌所得混合物3分钟，获得实施例1的试样。同时， 作为参考还使用了细胞分散处理前的细胞悬浮液。分别用显微镜观察实施例1的试样和作为对照的细胞悬浮液。实施例1中在有氟 树脂粒子的情况下进行搅拌所获得的试样中的细胞的显微镜照片见图3。作为参考，细胞悬 浮液中的细胞的显微镜照片见图4。从图4所示结果得知，未加氟树脂粒子的细胞悬浮液中宫颈细胞凝集成细胞块。 与此相反，从图3所示结果可以看出，使用氟树脂粒子进行细胞分散处理后，试样中的宫颈 细胞保持了细胞形态，同时又分散为单个细胞。从这些结果得知，含有氟树脂粒子的待检试样具有一种优秀品质能表现出细胞 分散效果，且可以在保持细胞形态的状态下使细胞块分散，对细胞的破坏很小。因此得知， 将含有氟树脂粒子的待检试样作为细胞分散剂是很好的。还可以知道，应用了氟树脂粒子 的细胞分散方法可以使细胞悬浮液中的细胞分离，使其分散成单个细胞。由此结果得知，实 施例1的细胞分散方法给细胞造成的伤害很小。比较例1 :[使用了蛋白质分解酶(胰蛋白酶)的细胞分散方法]在与实施例1同样的细胞悬浮液150 μ L中加入胰蛋白酶PBS溶液，使胰蛋白酶的最终浓度达到0. 01质量％，在37°C培养一定时间(1. 5小时、3小时、46小时)。在显微镜 下观察培养后的各细胞。在比较例1培养1. 5小时后的细胞在显微镜下观察的结果见图5， 在比较例1培养3小时后的细胞在显微镜下观察的结果见图6，在比较例1培养46小时后 的细胞在显微镜下观察的结果见图7。从图5、图6和图7所示结果可以看出，当与胰蛋白酶一起培养时，与实施例1相 比，从细胞块分离出来、分散的单个细胞数量少。且如图7的细胞1所示，观察到了膨胀成 水泡状的异常细胞。此结果可以认为是因为细胞与胰蛋白酶长时间一起培养，细胞膜受到 损伤，渗透压的平衡被打乱。由此结果得知，使用了胰蛋白酶的比较例1的细胞分散方法不能充分分离含带酒 精的细胞保存液固定的宫颈细胞的细胞悬浮液中的细胞块，不能充分使其分散成单个细 胞。并且得知，比较例1的细胞分散方法对细胞有损害。比较例2 (使用了物理力量的细胞分散方法)将与实施例1同样的细胞悬浮液150 μ L采入塑料管中。再将上述细胞悬浮液用 杵以4000rpm搅拌3分钟。在显微镜下观察搅拌后的细胞悬浮液中的细胞。在上述搅拌后 的细胞悬浮液150 μ L中添加碘化丙啶溶液，使其最终浓度达到10μ g/mL，进行细胞的细胞 核染色，在显微镜下观察染色后所得细胞悬浮液中的细胞的细胞核。在比较例2用杵搅拌 后的细胞悬浮液中的细胞显微镜照片如图8和图9所示。在比较例2用杵搅拌后的细胞悬 浮液中的细胞的细胞核染色图像的显微镜照片如图10所示。从图8 10所示各结果可以看出，在没有氟树脂粒子的情况下，仅用杵搅拌的物 理力量分散细胞块只会使细胞块拉伸(参照图8箭头)、分散的细胞破裂(参照图9箭头)， 甚至会出现细胞核飞出细胞膜外游离(脱核)(参照图10箭头)的情况。从这些结果得知，仅凭物理力量的比较例2的细胞分散方法会给细胞造成损伤。 这种对细胞的伤害有可能影响细胞诊断或流式细胞术的测定。而与此相反，在有氟树脂粒 子的情况下进行搅拌的实施例1的细胞分散方法可以凭借氟树脂粒子的润滑作用降低物 理力量对细胞的伤害。如上所述，使用了蛋白质分解酶的比较例1的细胞分散方法和仅靠物理力量的比 较例2的细胞分散方法中细胞分散效果都不充分，也不能保持细胞的形态。与此相对，采用 实施例1的细胞分散方法，细胞被充分分散，对细胞造成的伤害也很小。因此，由此结果说 明，使用含有氟树脂粒子(PIPE粒子)的细胞分散剂和用此分散剂的细胞分散方法可以制 备适于细胞诊断和流式细胞术测定的测定试样。而且，使用了含氟树脂粒子的细胞分散剂 的细胞分散方法适于用作观察单个细胞的细胞诊断和测定单个细胞的流式细胞术中的前 处理。实施例2 (氟树脂粒子浓度的探讨)从与实施例1同样的细胞悬浮液中取约相当于10 μ L的细胞，添加与实施例1同 样的氟树脂粒子水分散液60 μ L，制备混合物。此混合物中的氟树脂粒子(PTFE粒子)浓 度为M质量％。用杵以4000rpm搅拌所得混合物3分钟。以搅拌后的混合物作为实施例 2的试样。然后，在显微镜下观察实施例2的试样。实施例2中在有氟树脂粒子的状态下搅 拌所得试样中的细胞的显微镜照片见图11。
从图11所示结果可以看出，用上述细胞分散剂，并将PTFE粒子的浓度定为上述 浓度时，也与实施例1 一样，能够在保持细胞形态的状态下分离细胞块，使其分散成单个细 胞，对细胞的破坏很小。实施例3 (固定的培养细胞中的细胞分散效果)将培养细胞悬浮于培养基，在特 氟龙(Teflon 注册商标)培养皿中培养，在培养基中形成被称为扁球体(spheroid)的细 胞球状集合体。将此含扁球体的培养基以190Xg进行5分钟室温离心分离，回收含有细胞 块的细胞群。在所得细胞群中添加与上述实施例1同样的细胞保存液，固定该细胞，得细 胞悬浮液。然后，在150 μ L含有固定的培养细胞的细胞悬浮液中加入台盼蓝，使其最终浓 度达到0. 1质量％，对细胞染色。在染色后的细胞悬浮液中添加与上述实施例1中的细胞 分散剂同样的细胞分散剂，使PTFE粒子的最终浓度达到0. 6质量％，得混合物。再用杵以 4000rpm搅拌所得混合物3分钟。以搅拌后的混合物作为实施例3的试样。在显微镜下观察实施例3的试样。实施例3在有细胞分散剂条件下搅拌所得试样 中的细胞的显微镜照片如图12所示。从图12所示结果得知，即使是对固定了的细胞，也可以在保持细胞形态的状态下 分解细胞块，使其分散成单个细胞，对细胞的破坏也很小。关于在前面所述实施例1 3、比较例1和2的细胞分散方法中细胞分散的效果和 对细胞的伤害，归纳为表1。[表 1]
细胞分散效果对细胞的伤害实施例1大小实施例2大小实施例3大小比较例1小大比较例2小大如表1所示，使用了蛋白质分解酶的比较例1的细胞分散方法和仅凭物理力量的 比较例2的细胞分散方法分散细胞块很不充分，且对细胞的伤害也大。与此相比，采用实施 例1、实施例2和实施例3的各细胞分散方法(本发明的细胞分散方法)，细胞块分散为单 个细胞，且对细胞的伤害也小。试验例1 :(探讨氟树脂粒子浓度对细胞分散效果的影响)用与实施例1同样的氟树脂粒子的水分散液和细胞悬浮液，如下探讨了氟树脂粒 子浓度对细胞分散效果的影响。在细胞悬浮液中加入氟树脂粒子水分散液，使氟树脂粒子-PTFE粒子的最终浓度 达到0. 003质量％，同时，加入台盼蓝调至最终浓度为0. 1质量％，得混合物。将所得混合 物用搅拌棒以4000rpm搅拌3分钟(实施例4)。搅拌后的混合物作为实施例4的试样。
获取实施例5 9的试样时除将PTFE粒子的最终浓度调至0. 03质量％ (实施 例5)、0. 06质量％ (实施例6)、0. 3质量％ (实施例7)、3质量％ (实施例8)或60质量％ (实施例9)外，其他操作均与实施例4相同。在显微镜下观察各试样中的细胞，调查了各试样中“单一细胞”、“2 5个细胞凝 集的细胞块”及“6个以上细胞凝集的细胞块”的比例。为了比较，还调查了未加PTFE粒子 的细胞悬浮液中单一细胞及细胞块的比例(比较例幻。各PTFE粒子的浓度与单一细胞及 细胞块的比例关系的示图见图13。图13中，条1表示比较例3，条2为实施例4，条3为实 施例5，条4为实施例6，条5为实施例7，条6为实施例8，条7为实施例9。从图13所示结果可以看出，如实施例4 9那样PTFE粒子浓度为0. 003质量％、 0. 03质量％、0. 06质量％、0. 3质量％、3质量％及60质量％中的任何一种，试样中的“2 5个细胞凝集的细胞块”和“6个以上细胞凝集的细胞块”的比例都比不添加PTFE粒子的细 胞悬浮液(比较例幻低，“单一细胞”的比例均上升至超过70%。由此说明，在使用了氟树 脂粒子的实施例4 9的细胞分散方法中，将氟树脂粒子的浓度调至0. 003质量％这一低 浓度到60质量％这一高浓度之间的范围内，均可显示出细胞分散效果。试验例2 探讨有无氟树脂粒子对细胞分散效果的影响用来源于宫颈的细胞调查有无氟树脂粒子对细胞分散效果的影响。在与实施例1同样的细胞悬浮液中加入与实施例1同样的氟树脂粒子水分散液， 使PTFE粒子的最终浓度达到0. 003质量％，同时，加入台盼蓝调至浓度为5质量％。将所 得混合物用搅拌棒以4000rpm搅拌3分钟(实施例10)。将搅拌后的混合物作为实施例10 的试样。除搅拌时间变为9分钟外，其他均以与实施例10同样操作，制备实施例11的试样。在显微镜下观察各试样中的细胞，调查了在细胞悬浮液中“单一细胞”、“2 5个 细胞凝集的细胞块”及“6个以上细胞凝集的细胞块”的比例。为了比较，还就未添加PTFE 粒子的细胞悬浮液(比较例4)、未添加细胞分散剂搅拌细胞悬浮液3分钟(比较例幻或9 分钟(比较例6)所获得的比较例5和6的试样，与上述同样调查了其中的单一细胞及细胞 块的比例。有无PTFE粒子与单一细胞及细胞块的比例关系的示图见图14。图14中，条1 表示比较例4，条2为比较例5，条3为比较例6，条4为实施例10，条5为实施例11。从图14所示结果可以看出，未添加PTFE粒子搅拌细胞悬浮液时(比较例5和6)， 不管搅拌时间多长，“单一细胞”的比例都没有上升，与未添加PTFE粒子的细胞悬浮液(比 较例4)的“单一细胞”比例基本相同。而在有PTFE粒子的情况下搅拌时(实施例10和 11)，与未实施细胞分散处理的细胞悬浮液中的“单一细胞”比例相比，“2 5个细胞凝集的 细胞块”和“6个以上细胞凝集的细胞块”的比例有所下降，“单一细胞”的比例均上升至超 过 70%。由此得知，加入PTFE粒子进行搅拌比不用PTFE粒子只搅拌时，细胞分散效果更 好。与在实施例10的“单一细胞”比例为70%相比，在实施例11的“单一细胞”比例为 94%。由此结果可以知道，在加入PTFE粒子进行搅拌的条件下，搅拌时间越长，“2 5个 细胞凝集的细胞块”和“6个以上细胞凝集的细胞块”的比例下降越明显，“单一细胞”比例 升高。这说明，即使PTFE粒子浓度低时，只要适当设定搅拌时间也可以获得较好的分散效果。
权利要求
1.一种细胞分散方法，所述方法是将数个细胞凝集而成的细胞块在液体培养基中进行 分散，分离成单个细胞，其特征在于在液体培养基中混合细胞块和氟树脂粒子。
2.根据权利要求1所述细胞分散方法，其特征在于所述氟树脂粒子至少由选自以 下物质群中的一种所构成聚四氟乙烯、四氟乙烯-全氟烷氧基乙烯基醚共聚物、四氟乙 烯-六氟丙烯共聚物、乙烯-四氟乙烯共聚物、聚偏氟乙烯、聚三氟氯乙烯及乙烯-三氟氯 乙烯共聚物。
3.根据权利要求1所述细胞分散方法，其特征在于与氟树脂粒子混合前的细胞块粘 连在细胞培养基板上。
4.根据权利要求1或3所述细胞分散方法，其特征在于与氟树脂粒子混合前的细胞 块包含在培养基中。
5.根据权利要求1或3所述细胞分散方法，其特征在于与氟树脂粒子混合前的细胞 块包含在磷酸盐缓冲生理盐水中。
6.根据权利要求1所述细胞分散方法，其特征在于所述细胞块包括因生物体中的粘 液而凝集的细胞。
7.根据权利要求6所述细胞分散方法，其特征在于所述细胞块包括宫颈细胞。
8.根据权利要求1所述细胞分散方法，其特征在于与氟树脂粒子混合前的细胞块被 固定。
9.根据权利要求1所述细胞分散方法，其特征在于还包括接触步骤，即让细胞块与能 使细胞可视化的显像剂接触的步骤。
10.根据权利要求1所述细胞分散方法，其特征在于还包括促进步骤，即在所述细胞 块和氟树脂粒子的混合物中加大氟树脂粒子进入细胞块所含细胞间缝隙的比例的步骤。
11.根据权利要求10所述细胞分散方法，其特征在于所述促进步骤是搅拌所述混合 物一定时间的搅拌步骤。
12.根据权利要求1所述细胞分散方法，其特征在于所述混合物中的氟树脂粒子浓度 在0. 003质量％以上60质量％以下。
13.根据权利要求1所述细胞分散方法，其特征在于使用包含粒径在0.1 μ m以上 200 μ m以下的粒子的粒子混合物作为所述氟树脂粒子。
14.一种细胞分散剂，含有氟树脂粒子，用于使细胞块分散。
15.根据权利要求14所述细胞分散剂，其特征在于还含有使细胞可视化的显像剂。
16.一种细胞测定方法，包括混合步骤，将数个细胞凝集而成的细胞块和氟树脂粒子在液体培养基中混合；及测定步骤，用流式细胞仪测定在所述混合步骤获得的混合物。
全文摘要
本发明提供一种能够在减小对细胞伤害的状态下分散细胞块的细胞分散方法、细胞分散剂及细胞测定方法。分散细胞块时使用氟树脂粒子。在溶剂中混合由数个细胞凝结而成的细胞块和氟树脂粒子，将该细胞块分离成单一细胞，使其分散。用流式细胞术测定分散的细胞来进行细胞测定。
文档编号G01N33/48GK102089427SQ20098012697
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月10日 优先权日2008年7月10日
发明者加畑博幸 申请人:希森美康株式会社