专利名称：一种水溶性葡甘露聚糖的检测方法
技术领域：
本发明涉及医药检测领域，特别提供了一种水溶性葡甘露聚糖的检测方法。
背景技术：
多糖是一类由单糖单元组成、具有丰富结构多样性的特殊生物高分子，在生物体内，多糖以贮能高分子存在，或通过不同方式的超分子作用，形成组织结构大分子；此外，多糖作为某些生物转化识别(如活性和选择性)过程中的关键物质，已越来越深入地被人们所认识。众多有机体如植物、动物、真菌、海藻和微生物，可通过生物途径大量合成多糖。天然来源的多糖具有较好的生物相容性和可降解性，通过化学改性，可以获得功能更为广泛的多糖衍生物，在现代食品、化妆品、医药用品、工业用材料等方面应用广泛，代表性的如淀粉、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋葡甘聚糖、阿拉伯胶和西黄芪胶等及其化学改性衍生品。葡甘露聚糖是一种常见的天然黏性多糖，其主链为D-甘露糖和D-葡萄糖组成，一般通过β 1-4位糖苷键，并常有部分支链结构和乙酰基修饰。该类多糖分布较为广泛，主要在植物中发现，如魔芋多糖(konjac gel)、白及多糖(来自白及Bletilla striata)等，在微生物中也有发现。该类多糖常作为优良的天然食品增稠剂使用，同时在医药原料、药用载体和生物医学材料中的应用也有报道。多糖类成分由于分子量大、结构复杂，即使均一多糖也具有微观非均一性，对多糖的定性定量检测存在一定难度。多糖分子量分布范围的表征和测定方法很多，主要有渗透压法、黏度法、光散射法和凝胶过滤法等，各种方法均需要具有相应设备，测得的分子量数据不尽相同。近年采用高效液相一凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖分子量分布范围的方法和技术已很成熟，并被收载为药典标准方法之一。现有技术中，还常采用完全酸水解法分析多糖中的单糖组成，一般采用气相色谱法检测，但样品需经衍生化处理。尽管多糖的国内外对多糖的检测方法较多，但对葡甘露聚糖的综合检测方法报道较少。现有文献多仅限于葡甘露聚糖的鉴定工作，不能直接应用于产品定性定量分析中。 有报道采用光散射法和黏度法定性分析魔芋多糖的分子量，采用紫外法测定白及多糖的总含量。在文献“高效液相色谱法测定魔芋葡甘露聚糖”(华东理工大学学报，2002, ) 406-409)中报道了用高效液相色谱法和示差折光检测器，采用氨丙基改性硅胶色谱柱对魔芋葡甘露聚糖进行含量测定的方法，但该方法并没有把甘露糖和葡萄糖分离开。文献“高取代度水溶性高分子魔芋葡甘聚糖醋酸酯制备工艺的研究”(食品研究与开发，2006，(5) 49-51)曾报道了采用盐酸羟胺法测定魔芋葡甘聚糖乙酸酯的乙酰取代度。但测定葡甘露聚糖的纯度未见报道，采用HPLC法定量分析葡甘露聚糖的单糖组成和含量的方法未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种水溶性葡甘露聚糖的检测方法。本发明是针对现有葡甘露聚糖产品缺乏全面评价的质量控制方法的现状而展开研究的。已报道的葡甘露聚糖检测方法较为简单、难以确定该多糖的纯度和单糖组成。通过对葡甘露聚糖结构特征和检测方法的系统研究，我们建立了实际可行的葡甘露聚糖质量分析方法，适用于检测葡甘露聚糖产品特性。本发明提供了一种水溶性葡甘露聚糖的组合检测方法，所述葡甘露聚糖的检测由下述的方法步骤组成(1)采用高效凝胶渗透色谱法法对葡甘露聚糖同时进行分子量定性分析和纯度分析色谱条件与系统适用性试验采用高效液相系统，凝胶色谱柱，含水流动相，流速 0. 4-1. OmL/min,柱温20-40°C，示差或蒸发光散射检测器；对照品溶液的配制精密称取多糖系列对照品，用水配制成0. 5-5. Omg/mL的系列对照品溶液；样品溶液的配制精密称取待测样品，用水配制成0. 5-5. Omg/mL的待测样品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5_20μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。(2)采用高效液相色谱法对葡甘露聚糖完全酸水解产物进行单糖组成和定量分析色谱条件与系统适用性试验采用高效液相系统，改性硅胶基质色谱柱，流动相为乙腈-水，流速0. 8-1. OmL/min,柱温20-40°C °C，示差或蒸发光散射检测器；对照品溶液的制备精密称取甘露糖和葡萄糖对照品，用水配制成0. 05-2. Omg/ mL的系列对照品溶液；供试品溶液的制备精密称取葡甘露聚糖样品0. 2g于25ml量瓶中，以水溶解并定容。精密量取上述溶液0. 50ml于样品瓶中，加入三氟乙酸溶液至终浓度2mol/L，在120°C 下水解反应池。反应结束后除去溶剂，残渣用水配制成0. 1-1. Omg/mL的样品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5_20μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明所述白及多糖的检测方法(1)中所用检测器优选蒸发光检测器；所用流动相优选低浓度可挥发性盐溶液或纯水溶液，更优选纯水溶液；所用对照品优选葡甘露聚糖类对照品。本发明所述白及多糖的组合检测方法O)中所用色谱柱填料优选氨丙基改性的硅胶基质色谱柱，流动相优选乙腈含量为75-85% ；所用检测器优选蒸发光检测器。本发明所述葡甘露聚糖的检测还包括采用盐酸羟胺显色紫外法测定葡甘露聚糖中乙酰化度；所用对照品优选单糖乙酸酯类对照品，更优选五乙酰基葡萄糖对照品。本发明所述葡甘露聚糖的检测还包括测定葡甘露聚糖特性黏数。本发明的突出特点是该检测方法可对葡甘露聚糖进行分子量及其分布范围、纯度分析、单糖组成和多糖含量测定、乙酰化度测定、特性黏数测定等理化性质进行系统测定， 能定性和定量地综合表征葡甘露聚糖的产品特性，具有结果准确、可操作性强等优点，适用于天然来源水溶性葡甘露聚糖(如魔芋多糖，白及多糖，微生物来源葡甘露聚糖等)的产品质量控制。本发明要求保护的重点内容，是在对葡甘露聚糖的结构特征和检测方法进行系统研究基础上完成的。本发明的主要技术特征为如下研究内容。
(1)、葡甘露聚糖的分子量及其纯度分析方法研究多糖的分子量及其分布范围的表征是多糖的重要理化参数。采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定已是现有技术中的成熟方法。但由于多糖仅有末端吸收，常用的示差检测器灵敏度也较低。近年发展成熟的蒸发光散射检测器(ELSD)为质量型通用检测器，适用于多糖成分分析。不同结构类别的多糖，在HPGPC谱图上的流出体积可能有差别，本发明通过研究发现，采用同一结构类型的葡甘露聚糖对照品，所测定的标准曲线与测试样品分子量相吻合。此外，一般分析方法中均采用电解质盐为流动相，本发明实验中发现葡甘露聚糖试样以纯水为流动相的色谱保留行为与乙酸胺缓冲盐溶液的相一致。在此基础上，本发明首次建立了 HPGPC-ELSD法测定葡甘露聚糖的分子量及其分布范围的方法。(2)、葡甘露聚糖的单糖组成及其含量测定方法研究多糖的含量测定方法主要有化学法(比色法、滴定法等)、色谱法(气相色谱法、 高效液相色谱法)等。一般的化学方法只能测定多糖的总量，不能测定多糖的组成。气相色谱法虽可测定多糖的组成，但须对糖进行衍生化才可检测。使用高效液相色谱法测糖，由于糖本身在紫外区无吸收，可采用柱前衍生化紫外或荧光检测法进行，也可选用通用性检测器直接分析，如示差折光检测、蒸发光检测、电雾式检测、脉冲安培检测、质谱检测等。其中，蒸发光散射检测器是一种通用型质量检测器，具有可测定无紫外吸收的化合物、可进行梯度洗脱，稳定性好，灵敏度高，无溶剂峰干扰等特点，弥补了紫外检测器和示差折光检测器的不足，近年来在糖类分析领域应用广泛。糖类化合物由于极性强、异构体复杂多变、理化性质相似，其成分分离较为困难。 亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography，HILIC)，是一种采用极性固定相(如硅胶或键合硅胶)，以含高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的色谱模式。 HILIC非常适于对极性化合物的分离，近年来在糖类成分分析中发展较快。本发明采用氨丙基改性的硅胶基质色谱柱，首次建立了亲水作用色谱——蒸发光散射检测(HILIC-ELSD)定量分析葡甘露聚糖的单糖含量及其组成的方法。(3)、葡甘露聚糖的乙酰基取代度测定方法研究葡甘露聚糖中�：猩倭恳阴；〈阴；〈仁潜碚髌细事毒厶堑奶卣鞑问�。测定多糖乙酰基取代度的常用方法是皂化法和羟胺比色法。皂化法是经典方法， 但所需样品量大、耗时长，对低取代度多糖的测定值相对误差较大。羟胺比色法较为简便快捷、灵敏度高，但容易受显色方法和时间、样品纯度和其它酯化基团等干扰。本发明通过研究，选用容易获得的同类单糖乙酸酯类对照品，即五乙酰基葡萄糖，建立了羟胺比色法测定葡甘露聚糖乙酰基取代度的方法。测定β-D-五乙酰葡萄糖中乙酰基含量在15. 4 92. dygmr1的范围内具有良好的线性关系(r = 0.9996)，检测限为11. 1 μ g ·ιΛ_1，平均回收率为101.6% (n = 9)，方法精密度实验RSD = 0. 08%。测得魔芋多糖样品中乙酰基取代度为0. 0358，结果表明本法快速准确，重现性好，简便易行，适用于多糖中乙酰取代度的分析测定。(4)、葡甘露聚糖的特性黏数测定方法研究对某一确定类型的高分子材料，其分子量大小与其特定的黏度(如特性黏数)具有定量关系。根据这一原理，通过监测控制反应过程中产物的黏度，可制备出所需黏度规格的产品，对应于相应分子量规格的葡甘露聚糖。本发明研究建立了白及多糖样品的相对黏度和特性黏数与其分子量的对应关系，适用于表征该试样的特性黏数。
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明图1为白及多糖试样的HPGPC-ELSD色谱图；图2为甘露糖和葡萄糖混合对照品的HPLC-ELSD色谱图(1为甘露糖；2为葡萄糖)；图3为白及多糖完全酸水解样品的HPLC-ELSD色谱图(1为甘露糖；2为葡萄糖)。
具体实施例方式本发明所述的葡甘露聚糖组合检测方法，以白及多糖和魔芋多糖为例，是按如下实施例所表示的方法制造或发现的，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。实施例1本实施例所述HPGPC-ELSD法测定白及多糖的分子量及其分布范围色谱条件取各规格白及多糖样品约10mg，用适量水溶解配制成1. Omg/mL的浓度，采用TSK PW4000型色谱柱，GPC-ELSD分析(Alltech公司)系统，以水为流动相，流速 0. 6mL/min，色谱柱柱温为室温进行分析；以系列规格白及多糖为对照品制定标准曲线，待测样品用GPC软件计算结果。对照品BT01-07的绝对分子量采用MALLS法测定。取BT01-07的溶液，经0. 22 μ m 微孔滤器过滤后，采用HPGPC-ELSD高效凝胶渗透色谱系统和所选的色谱条件，照分子排阻色谱法(中华人民共和国药典2010版或2005版附录V H)进样分析。记录各标准品色谱峰的保留时间tK(min)，结果参见表2。以各自IgMw对、作线性回归，得到回归方程为y =-0. 2244X+4. 5749，R2 = 0. 9855，说明在所使用的高效凝胶渗透色谱系统中，白及多糖在 24 178kDa的分子量范围里IgMw对tK呈较好的线性。表1对照品BTO1-07的HPGPC-ELSD分析结果
\ 标准品BTOlBT02BT03BT04BT05BT06BT07Mw(kDa) /R(min)178.0 10.552113.9 11.076110.2 11.35369.90 12.21356.05 12.32741.29 13.18424.17 14.338实施例2本实施例所述HPGPC-ELSD法测定白及多糖的纯度色谱条件同实施例1;线性范围取白及多糖对照品BT40的系列标准溶液，经0. 22 μ m微孔滤器过滤后， 进样分析，记录溶液GPC谱图中色谱峰的峰面积A。以InA对Inm进行线性回归，得到白及多糖对照品BT40的回归方程为lnA = 1. 49241nm+l. 7227, R2 = 0. 9984，表明白及多糖在0. 5 5mg/mL的浓度范围内InA对Inm呈良好的线性。按信噪比S/N 二 3和10计算， HPGPC-ELSD法分析白及多糖的检测限为2. 33 μ g，定量限为5. 48 μ g。样品测定取待测BT40-1样品进行测定，测得其含量为96. 63%。方法学验证实验如下(1)线性范围取含量测定用白及多糖对照品BT40S系列标准溶液，经0. 22 μ m微孔滤器过滤后， 进样分析，记录各溶液GPC谱图中色谱峰的峰面积A。以IgA对Igm进行线性回归，回归方程为y = 1. 4924x+0. 7482，R2为0. 9984。表明白及多糖在0. 5 5mg/mL的浓度范围内 IgA对Igm呈良好的线性。(2)准确度取ang/mL的同一份BT40-1供试品溶液9份，各2mL，分别置于5mL容量瓶中。每3 份一组，分别向1、2、3组中精密加入5mg/mL的BT40S标准液0. 2,1. 2,2. 2mL，加纯水定容， 摇匀，制成l、2、3mg/mL的混合溶液，浓度分别为分析浓度Omg/mL)的50%、100%、150%。 经0. 22 μ m微孔滤器过滤后，进样分析，记录色谱峰峰面积，计算得到低、中、高3种加入量的回收率、RSD(%)及平均回收率，数据见表2。结果符合方法学要求。表2回收率实验结果
权利要求
1.一种水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法为(1)采用高效凝胶渗透色谱法法对葡甘露聚糖同时进行分子量定性分析和纯度分析；色谱条件与系统适用性试验采用高效液相系统，凝胶色谱柱，含水流动相，流速 0. 4-1. OmL/min，柱温20-40°C，示差或蒸发光散射检测器；对照品溶液的配制精密称取多糖系列对照品，用水配制成0. 5-5. Omg/mL的系列对照品溶液；样品溶液的配制精密称取待测样品，用水配制成0. 5-5. Omg/mL的待测样品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得；(2)采用高效液相色谱法对葡甘露聚糖完全酸水解产物进行单糖组成和定量分析；色谱条件与系统适用性试验采用高效液相系统，改性硅胶基质色谱柱，流动相为乙腈-水， 流速0. 8-1. OmL/min，柱温20_40°C °C，示差或蒸发光散射检测器；对照品溶液的制备精密称取甘露糖和葡萄糖对照品，用水配制成0. 05-2. Omg/mL的系列对照品溶液；(3)供试品溶液的制备精密称取葡甘露聚糖样品0.2g于25ml量瓶中，以水溶解并定容。精密量取上述溶液0. 50ml于样品瓶中，加入三氟乙酸溶液至终浓度2mol/L，在120°C 下水解反应池。反应结束后除去溶剂，残渣用水配制成0. 1-1. Omg/mL的样品溶液；(4)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.按照权利要求1所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述方法(1)中所用检测器优选蒸发光检测器。
3.按照权利要求1所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述方法(1)中所用流动相优选低浓度可挥发性盐溶液或纯水溶液，更优选纯水溶液。
4.按照权利要求1所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述方法(1)中所用对照品优选葡甘露聚糖类对照品。
5.按照权利要求1所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述方法O)中所用色谱柱填料优选氨丙基改性的硅胶基质色谱柱，流动相优选乙腈含量为75-85%。
6.按照权利要求1所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述方法O)中所用检测器优选蒸发光检测器。
7.按照权利要求1所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述葡甘露聚糖的检测还包括采用盐酸羟胺显色紫外法测定葡甘露聚糖中乙酰化度；所用对照品优选单糖乙酸酯类对照品，更优选五乙酰基葡萄糖对照品。
8.按照权利要求1所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述葡甘露聚糖的检测还包括测定葡甘露聚糖特性黏数。
9.按照权利要求1所述葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述葡甘露聚糖的检测方法可以用在葡甘露聚糖产品质量控制中。
10.按照权利要求1所述水溶性葡甘露聚糖的检测方法，其特征在于所述葡甘露聚糖的检测方法可以用在魔芋多糖和白及多糖产品质量控制中。
全文摘要
本发明公开了一种水溶性葡甘露聚糖的检测方法；所述方法包括采用高效凝胶渗透色谱法对葡甘露聚糖同时进行分子量定性分析和纯度分析；采用高效液相色谱法对葡甘露聚糖完全酸水解产物进行单糖组成和含量定量分析；本发明所述检测方法可对葡甘露聚糖进行分子量及其分布范围、纯度分析、单糖组成和多糖含量测定、乙酰化度测定、特性黏数测定等理化性质进行系统测定，能定性和定量地综合表征葡甘露聚糖的产品特性，具有结果准确、可操作性强等优点，适用于天然来源水溶性葡甘露聚糖(如魔芋多糖，白及多糖等)的产品质量控制。
文档编号G01N30/02GK102243215SQ20101016668
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者刘江云, 张燕, 彭芳, 杨世林, 殷殷, 蔡培烈, 薛百忠 申请人:辽宁诺康医药有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
