亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：分泌粒蛋白和vgf肽生物标记及它们的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于重性抑郁障碍的肽生物标记。生物标记和使用它们的方 法可用于协助诊断或用于评估重性抑郁障碍的发作和M。 ^^发明还涉M 物标记在重性抑郁障碍领域的临床筛查、预后评估、治疗评价及药物筛查和 药物开发中的用途。
背景技术：
在英国联合王国和美国，由美国精神病学学会(American Psychiatric Association)(华盛顿特区)在1994年出版的精神障碍诊断与统计学手册 第四版(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition) (DSM IV)被证明是絲专家用于分类及诊断心理錄问题的城 的参考手册。它描述了心理他泉障碍包括重性抑郁障碍的诊断标准、亚型、 相关特4^鉴别诊断标准。
根据DSM-IV，患有重性抑郁障碍的人必须有连续至少两周的情绪低落 或对于日常活动失去兴趣或乐趣。这种情绪必定f^LA正常情绪的变化； 社交、工作、教育或其他重要功能也必定受到这种情绪变化的负面影响。由 物质(例如药物、乙醇或药物治疗)引起的情绪低落不被认为是重性抑郁障 碍，由一般医学病症(general medical condition)引起的那种也不是重 性抑郁障碍。如果一个人具有,、轻症躁狂或混^^发作(例如双相型障碍)
的历史，或者如果情绪低落可被更好地解释为情感分裂性精神障碍且不与精 神分裂症、妄想性障碍或精神障碍重叠，那么无法诊断为重性抑郁障碍。而 且，所述症状^J^释为哀伤会更好，即这些症状在失去所爱之后持续两个月 之上或具有特征显著的功能^^员(marked functional impairment )、具有
没有价值感的病态偏见、有自杀念头、精神病症状或精神运动性抑制 (Psychomotor retardation),
重性抑郁障碍的特征在于存在以下主要症状基本上每天都整天情绪低200780030373. 1
说明书第2/21页
落，这可通iii观报告(例如感到悲伤或空虚)或者通过^A的XC察(例如 出现流泪)而表明。在儿童和青少年中，它可以以易激怒情绪为特征。 上每天都整天对于所有或几乎所有的活动都明显失去兴趣或乐趣；不节食而 体重显著减轻或体重增加(例如一个月体重变化超过5% )，或者几乎每天的 ^"欲降低或增加；几乎每天失眠或睡眠过度；几乎每天精神运动性皿或精 神运动性抑制；几乎每天疲惫或精力减退；几乎每天没有价值感或者过度的 或不适当的犯罪感；几乎每天思考能力或注意力集中能力减弱，或优柔寡断； 反复想到死亡(不仅只惧怕死亡)、反复有自杀念头而无具体计划或者有自 杀企图或实施自杀的具体计划。
研究正常个体和这些具有重性抑郁障碍个体之间的生物化学差异可提 供对这种障碍的病因和/或效应的深入理解。在某些情况中，这些差异可以 构成指示该障碍的存在和状态的生物标记。
分泌粒蛋白n是在内分泌、神经内分泌及神经iti且织的致密核心大嚢泡 中出现的酸性分泌性蛋白。它是被命名为嗜铬粒蛋白的蛋白类别的一个成
员。分泌粒蛋白n是神经肽分泌神经素(SN)的前体，所述分泌神经素是一种
33个M酸的肽，在大鼠中对应于分泌粒蛋白n的154-186位M酸。分泌 神经素诱导大鼠脑故状体中的多巴J^故。所述分泌神经素的33个M酸神 经肽在哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物和鱼类之间是高度保守的。它特 异'l!i^内分泌、神经内分泌及神经元组织中表达。在脑中，SN表达的模式 是广^OL独特的，与已确定的神经递质有着部分重合。
VGF基因编码的神经肽前体在中枢神经系统和周围神经系统的神经元亚型 中表达，并JL^在于腺垂体、肾上腺自、胃肠#^中的特定内分泌细 胞群中表达。VGF在应^经元中的表达由神经营养因子上调。VGF是一种已 被识别的神经生长因子，在能量稳态调节中发挥重要功能。人VGF蛋白的长为 615个絲酸；小鼠和大鼠中的VGF蛋白的长为617个絲酸。人VGF蛋白和 大鼠VGF蛋白之间有约85%的同源性。所述VGF神经肽前体含有22个M酸 的分泌引导("信号")序列，该序列^ii其至内质网中的易位。在所述VGF 神经肽前体^S^U亥前体切得的成熟的全长VGF肽中，有大量的短^ 性#^酸 残基，它们;！WH7割从而生成更短VGF肽的潜在耙位点。已经^A和大鼠中 鉴定了 VGF肽；Stark "a/,义C力ro鹏^^ra/ Ar属754， 357—367， 2001 ^无已知障碍的受^T获得的人脑脊液(CSF)中鉴定了三种VGF的N-末端 片段(23-62、 26-62 (N-端截短的肽23-62)和23-59位絲酸(C-端截短的肽23-62 ))。
VGF肽生物标记已经被与慢性痴呆疾病相关联。W002/082075描述了用于 检测慢性痴呆疾病特别是阿尔茨海默病的方法，涉及包括VGF 23-62及VGF 26-62的多种源自VGF的肽的检测。记。
W02006/085121 (在本案优先权日4l^公开)公开了用于精神分裂症和双 相型障碍的生物#^己。

发明内容
本发明涉及用于重性抑郁障碍的肽生物标记。
本发明提供了一种经分离并纯化的分泌粒蛋白n肽，由显示于SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其片段组成。该肽对应于人分泌粒蛋白n的氨基酸 529-566,已被发现其在患有重性抑郁障碍的受试者中的水平比其在正常受试 者中的水平低，它因此可用作重性抑郁障碍或其素因(predisposition)的 生物标记。从而，本发明提供了一种分泌粒蛋白n肽(优选由显示于SEQID NO: 1的M酸序列或其片段组成)作为重性抑郁障碍或其素因的生物标记
的用途。所述术语分泌粒蛋白n肽标记包括对应于人分泌粒蛋白n的
529-566位絲酸的J!LSJ斤ii分泌丰立蛋白n 529-566肽的片段。
本发明还提供了用于重性抑郁障碍或其章因的分泌粒蛋白n肽生物标
记，优选由显示于SEQ ID NO: 1的^J^酸序列或其片段组成。
本发明提供了 VGF肽(优选由显示于SEQ ID NO: 4的M酸序列或其 片段组成)作为重性抑郁障碍或其素因的生物标记的用途。
本发明还提供了用于重性抑郁障碍或其素因的VGF肽生物标记，优选由 显示于SEQ ID NO: 4的M酸序列或其片段组成。
在又一方面，本发明提供了 一种诊断或监测重性抑郁障碍或其素因的方 法，包含检测并/或定量存在于来自试验受试者的生物样品中的选自SEQ ID NO: l的M断列或其片段、SEQ ID NO: 4的M断列或其片段的一种 或多种肽生物标记。
本发明的又一方面提供了能特异性结合SEQ ID NO: 1的分泌粒蛋白n肽 生物标记或其片段的配体，或者结合SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标记或其片段的St体，所述配体例如天然存在的化合物或化学合成的化合物。本发明 的配体可包括能特异性结合SEQ ID NO: 1的分泌粒蛋白n肽生物标ieJl其片 段、或者结合SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标i試其片段的肽、抗体或其片段 或者适体(aptamer)或寡核苷酸。所述M可以是能特异性结合SEQ ID NO: 1的分泌粒蛋白n肽生物标iE^其片段、或者结合SEQ ID NO: 4的VGF肽生 物标记或其片段的单克隆抗体或其片段。本发明的配体可用诸如如发光标记 物、荧光标记物或iyt性标记物的可^"测才朽己物标记；此外或另外，本发明的 配体可用诸如生物素、亲和素、抗生蛋白链菌素或his (如六-his)标记物的 亲和标记物标记。
本发明的生物传感器可以包括一个或多个这样的配体，即该配体如本文 描述能特异性结合SEQ ID NO: 1的分泌粒蛋白n肽生物标ie^其片段；或者 结合SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标记或其片段。这种生物传感器在检测及/
或定量本发明的肽中是有用的。
本发明的生物传感器可以包括SEQ ID NO: 1的分泌粒蛋白n肽生物标记 或其片段以及/或者SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标记或其片段；或者它们的这
样的结构/形状模拟物，即该模拟物能特异性结^4t对分泌粒蛋白n肽生物标
ieJL其片段的抗体，或者能特异性结^4f对VGF肽生物标i^其片段的*。 还提供了这样的阵列，即该阵列包含本文描述的能特异性结合SEQ ID NO:
1的分泌粒蛋白n肽生物标记或其片段的配体，以及/或者本文描述的能特异
性结合SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标ieJL其片段的B&体；或者这样的阵列， 即该阵列包含SEQ ID NO: 1的分泌粒蛋白n肽生物标ie^其片段或它们的结 构/形状模拟物，以及/或者SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标记或其片段或它们 的结构/形，以物。
提供了用于实施本发明的方法的诊断或监测试剂盒。这种试剂盒将适当 地包含一种或多种本发明的配体(用于检测并/或定量选自以下的一种或多 种肽生物标记SEQ ID NO: 1的分泌粒蛋白n肽生物标i&^其片段、SEQ ID NO: 4的VGF肽生物才封e^其片段)；以及/或者生物传感器；以及/或者如本文描 述的阵列，^4连同该试剂盒的^^i兌明书。
本发明还提供的是如本文描绘的一种或多种B&体(这些配体可以是天然 出现的或化学合成的并且为合适的肽、抗体或其片段、适体或寡核苷酸)的 用途；或者本发明的生物传感器、本发明的阵列或本发明的试剂盒用于检测 并/或定量选自以下的一种或多种肽的用途SEQ ID NO: l的分泌粒蛋白n肽生物标^^其片段；SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标ie^L其片段。在这些用途 中，所述^"测及/或定量可以在选自诸如CSF、全血、血清、血浆、尿、唾液、 ^fe体液、呼出气如凝结的呼出气、以上样品的4C^物或纯化物，或者它们的 稀释物的生物样品上iMi行。
重性抑郁障碍的生物标记是用于发现延迟或停止该障碍t艮的新型靶 标和药物分子的重要^f示。由于所述肽生物标记的水平是障碍和药物反应的 指示物，所述生物标记对于在体外和/或体内测定中鉴定新型治疗化合物是 有用的。本发明的生物标记可应用于筛选这样的化合物方法中，即该^^ 调制4^发明的分J^^立蛋白n或VGF肽生物标i己的活性；或者M SEQ ID NO: 1 的分泌粒蛋白n肽生物标记的产生或抑制SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标记的产生。
因此，在本发明的又一方面中，提供了如所述的配体(这些配体可以为 本发明的肽、抗体或其片段或者适体或寡核苷酸)的用途；或者本发明的生
物传感器、本发明的阵列或本发明的试剂盒用于识别能^it分泌粒蛋白n肽生
物标记产生和/或抑制VGF肽生物标记产生的物质的用途。
还提供了一种识别負fe^ii分泌粒蛋白n肽生物标记(优选由SEQ ID NO: 1 的J^酸序列或其片段组成)在受试者中产生的物质的方法，包^^J"动物受试 者给予一种^^物质，并皿测并/或定量存在于来自所述受试者的试^^样品
中的分泌粒蛋白n肽生物标记的水平。
还提供了一种鉴定能抑制VGF肽生物标记(优选由SEQ ID NO: 4的M 酸序列或其片段组成)在受试者中产生的物质的方法，包含对动物受M给予 一种试验物质，并且检测并/或定量存在于来自所述受试者的试验样品中的 VGF肽生物标记的水平。
序列表说明
SEQ ID NO: 1 ^A^分泌粒蛋白n 529-566肽生物标记。
SEQ ID NO: 2是全长的人分泌粒蛋白n蛋白。
SEQ ID NO: 3是编码全长的人分泌粒蛋白n蛋白的核斷列。
SEQ ID NO: 4;1人VGF 23-62肽生物标记。
SEQ ID NO: 5^^人VGF前体蛋白。
SEQ ID NO: 6;^人VGF 26—62肽絲齡列。
具体实施例方式
术语"VGF肽生物才朽己"包括成熟的全^A VGF肽，它通it^AVGF神 经肽前体切下信号序列产生。M的VGF肽生物标记是这样的肽，即它的N-末端是通过蛋白水解切去VGF的推定分泌引导("信号")序列而产生的。特别 优选的VGF肽生物标记(SEQ ID NO: 4 )源自人VGF蛋白，所述生物标记由 VGF的23-62位#^酸构成。该生物标^#^酸序列紧接在人VGF蛋白中推定 信号肽的^&端后(图4 )。如SEQ ID NO: 4所示的肽生物#^己在重性抑郁障 碍的个体中水平升高，因此它湖作诊断并监测重性抑郁障碍或其素因的标记 物。
术语"生物标记"是指过程、事件或状况特有的生物指示剂或源自生物的 指示剂。肽生物标记可用#断法(例如临床筛查)和预后评估中，以及用于 监测治疗效果、识别最可^^"M的治疗法应答的患者、药物筛查和开发。生 物标记及使用它们对于鉴定新药物疗法以M于发现药物疗法的新乾标是有 价值的。
术语"重性抑郁障碍"是指一些类型的抑郁。重性抑郁障碍的诊断分类出
现在美国精神病学学会的精神障碍诊断与统计学手册中。该术语"^不在使 用ICD"IO体系的国家使用，在ICD-10体系中的等价术语是"抑郁发作 (depressive episode)，，。
重性抑郁一一或者更确切地为重性抑郁障碍(MDD)—-的特征在于持 续至少2周的严重抑郁情绪。重性抑郁障碍可分为"单:^作(a single 印isode)"或"复发(recurrent)";在受试者的生命中，抑郁期可以表现为 离散事件，或者表现为复发事件。重性抑郁的发作还可以分成轻度型、重性型 或严重型。在患者已经发作it^i症或显著高涨的心境的情况下，通�？烧锒� 为XJ^目型障碍(^L称为^目情感障碍)而不是MDD;不经过情感高涨或J^i 症的抑郁因jtb^时候指的是单相抑郁症，这是因为他们的心境##在一个祝存、 上。这项诊断通常还排除了症状是正常的哀伤结果的情况。
诊断医生认可有多种可能的重性抑郁障碍亚型。ICD-10不是指一种'Ml5 症亚型，而是辨别有无精神病。
具有紧张症特征的抑郁 该亚型除可适用于躁狂'liiL作外，还可适用于 重性抑郁发作，但它较为罕见，并JL^^i症中更为罕见。紧张症的特征在于 表现为僵M木僵的^t^停滞。该MDD亚型还可以表现出ii^的、非^的运动活动(静坐不能)、极端违拗症或缄默症，以及动作怪痔，包括刻板的动作
(stereotypical movement),夸张的勤目和夸张的扮Jl^。还可以显示为模 仿语言或模仿动作。该亚型很少^t^，可能不是有用的分类。
具有忧郁症特征的抑郁 忧郁症的特征在于对大部分或所有活动失去 愉悦感(兴趣缺失)、对愉悦的刺激失去反应性、情感低落的程度显著大于悲 伤或丧失的程度、在清晨症状加重、凌晨早醒、精神运动性抑制、食欲缺乏 (体重^±>1减轻，别与神经性厌食混淆)或过度内疚。
具有非典型性特征的忧郁 非典型性的特征在于情绪反应性(似是而非 的兴趣缺失)和积极性、显著的体重增加或升高的食欲、iiJL睡眠或嗜睡(睡 眠过度)、沉重性瘫痪(leaden paralysis)或者由于对所受他人拒绝it^敏 感导致的显著的社交伤害(social impairment )。具有该亚型的>^可能对某些 事情产生兴趣或愉l这不同于大多数的抑郁个体。
具有精神病特征的抑郁 某些具有重性抑郁或躁狂性发作的人可能具 有精神病特征。他们可出现心境协调的(与抑郁方式一致的含义)或者非心境 协调的(与抑郁方式不一致的含义)的幻觉或妄想。在临床上，出现作为抑郁 附属特征的^体系无论在视觉上还是在听觉上都比出现幻觉更常见。
不在术语重性抑郁障碍范围内的^f^郁分类包括
心境恶劣， 一种持续至少两年的长期的轻JL抑郁。必须连续至少两年连续 iiMW情绪^f氐落。4艮椐定义，这些症状不如重性抑郁严重，但那些具有心境恶 劣的患者易于并发重性抑郁。该障碍经常在青春期开始，并持续终生。被沴断 为重性抑郁发作和心境恶劣障碍的入^被诊断为双重抑郁。最初出现心境恶劣障 碍，然后出现一种或多种重性抑郁的发作。
X5Uf目I型障碍是一种阶段性疾�。�其中情绪可以在躁狂和抑郁之间循 环。在美国，XM目型障碍以前叫做躁狂抑郁。然而，虽然抑郁在该障碍中起 到更大作用(按照失能和可能自杀的观点)，但是该术语不再受医学领域的 欢迎。"躁狂抑郁"现在仍被应用于非医学领域。
双相n型障碍是一种阶段性疾�。�主要通过抑郁但显现轻躁狂发作而定义。
产后抑郁(Postpartum Depression或Post-Natal Depression)是一种 在^免两年内出现的临床抑郁，主要是由于身体的、精神的及情感的枯竭， 连同睡眠剥夺。
月经前抑郁是一种与月经周期相关联的复发性抑郁症状的模式。脑中
105-鞋色胺功能在月经前降低与伴随的自测主要情绪症状(self-rated cardinal mood symptom)恶化强相关。
再者，术语"重性抑郁障碍"不涵盖精神分裂性障碍、^目障碍及相关 的精神障碍，例如可与精神病症状或其他精神分裂症样症状共存的神经精神 障碍(精神病性抑郁症及其他精神病发作)和神经发育障碍(尤其是自闭症 谱系障碍(Autistic spectrum disorder))。
本发明的监测方法可用于监测起始、H稳定、改良和/或緩解。
在本发明的诊断或监测方法中，在来自试验受试者的生物样品中检测并 /或定量所述一种或多种肽生物标记可以在两个或多个时机^U^行。可以在两 个或多个时机所取样品中进行所述一种或多种生物#^己水平的比较。可以在两 个或多个时机所取样品中对所述一种或多种肽生物标记水平的任何变化进行 评估。所i4R生物标记水平的调制可用作重性抑郁障碍或其素因的状态的指 示物。分泌粒蛋白n肽生物标记(优逸由SEQ ID NO: 1的M酸序列或其片 ^!且成)水平随时间的降低表明有发作或先艮，即该障碍变恶化；而该肽生物 标记水平的升高表明该障碍的改良或緩解。
VGF肽生物标记(优选由SEQ ID NO: 4的M酸序列或其片段组成)水 平随时间的升高表明有发作或;OL即该障碍变恶化；而该肽生物标记水平的 !^f氐表明该障碍的改良或缓解。本发明的诊断或监测方法可包含在来自#受试者的#生物样品中定 量分泌粒蛋白n肽生物标记(优选由SEQ ID NO: 1的^睃亭列或其片賴i且 成)，并且/或者定量VGF肽生物标记(M由SEQ ID NO: 4的M酸序列或 其片殺i且成)，并且与一个或多个对照比^^斤述^^样品中存在的肽的水平。
本发明的方法中使用的对照可以是选自以下的一个或多个对照出现于来 自正常受试者的正常对照样品中的生物标记JIMC平，即正常生物4朽己JIMC平；
正常生物标记肽范围；来自患有的重性抑郁障碍或已被确诊其素因的受试者 的样品中的水平；重性抑郁障碍生物标记肽7]c平或重性抑郁障碍生物标记肽 范围。
一种优选的诊断重性抑郁障碍或其素因的方法，包含 (a )在试验生物样品中定量分泌粒蛋白n肽生物标记(优选由SEQ ID NO:
l的a酸序列或其片殺ia成)的量，并且/或者
(b)在试验生物样品中定量VGF肽生物标记(优选由SEQ ID NO: 4的 M酸序列或其片賴i且成)的量，并且(c)比较所述^r样品中的所皿的量与存在于来自正常受^的正常 对照样品中的量。
相对于所述正常对照中的水平，所述试验样品中较低水平的分泌粒蛋白 n肽生物标记表明存在重性抑郁障碍或其素因；相对于所述正常对照中的水 平，所述试验样品中相等或较高水平的肽表明无重性抑郁障碍以及/或者无 其素因。
相对于所述正常对照中的水平，所述试验样品中较高水平的VGF肽生物 才^己表明存在重性抑郁障碍或其素因；相对于所述正常对照中的水平，所述 试验样品中相等或较低水平的肽表明无重性抑郁障碍以及/或者无其素因。
本文使用的术语"诊断"涵盖识别、确认以及/或者表征重性抑郁障碍 或其素因。素因是指受试者现在没有出现障碍，M—段时间内易于患上此 障碍。本发明的监测和诊断方法可用于确认障碍或其素因的存在；通过评 估发作和t艮而监测该障碍的发生，或者评估该障碍的改良或緩解。监测和 诊断方法"这样的方法中是有用的，即该方法用于评估临床筛查、预后、 治疗的选择、治疗效果的评价一一即用于药物筛查及药物开发。
有效的诊断和检测方法通过作出正确的诊断，使得可以iS^确定最合 适的治疗方案(由此减少没有必要遭受的有害药物副作用)，减少"等待时 间(downtime)"和降低复发率，由此提供可能改善预后的十分有效的"患 者治疗方案"。
还提供了一种在患有重性抑郁障碍、4�似患有该障碍或被' ^具有其素 因的受试者中监测治疗该障碍的有效性的方法，包#测并/或定量存在于来 自所述受试者的生物样品中的分泌粒蛋白n肽(优选由SEQ ID NO: 1的M 酸序列或其片段组成)，以及/或者包*测并/或定量存在于来自所述受"^ 的生物样品中的VGF肽(M由SEQ ID NO: 4的^酸序列或其片賴i且成)。 在监测方法中，试验样品可取自两个或多个时机。所述方法还可以包括将存在 于所述^^样品中的一种或多种生物标记水平与一个或多个对照相比较，以及 /或者与先前(如治疗开始前)从同一受M获得的一种或多种前期^^样品 相比较，以及/或者与治疗早期从同一受^获得的一个或多个前期测试样品 相比较。所述方法可以包*测取自不同时机的试验样品中 一种或多种生物标 记水平的变化。
本发明提供了用于监测在受试者中治疗重性抑郁障碍的效果的方法，包
含
12(a )在取自所述受试者的试验生物样品中定量分泌粒蛋白n肽生物标
记(优选由SEQ ID NO: 1的^J^^列或其片^i且成)的量，并且/或者
(b) 在取自所述受试者的试验生物样品中定量VGF肽生物标记(优选 由SEQ ID NO: 4的M酸序列或其片段组成)的量，并且
(c) 比较所述肽在所述"^r样品中的量与存在于一种或多种对照以及/ 或者在前期取自所述同 一，受试者的一种或多种前期^^样品中的量。
相对于先前取自同一试验受试者的前期试验样品中的水平，在所述#
样品中分泌粒蛋白n肽生物标记水平升高则表明，所述治疗对于所述障碍、疑
似障碍或其素因有着有益效果(例如稳定或改良)。
相对于先前取自同一试验受试者的前试验样品中的水平，在所述"^^样 品中VGF肽生物标记水平降低则表明，所述治疗对于所述障碍、疑似障碍或其 素因有着有益效果(例如稳定或改良)。
用于监测治疗效果的方法可用于监测已有治疗或新的治疗在人受试者 中和在非人动物(例如在动物模型)中的治疗效果。这些监测方法可整合至 用于新药物物质及物质结合物的筛查中。
适当地，>^#:诊断或监测的受试者取洋的时间间隔为3天、5天、 一周、 两周、 一个月、2个月、3个月、6或12个月。样品可以取自抗抑郁治疗之 前和/或之中和/或之后。可以在受试者余生的全部时间或部分时间内间隔取 样。
本文使用的术语"检测，，是指在所述样品中确认所述肽生物标记的存在。 定量存在于样品中的生物标记的量可包括，确定存在于所述样品中的肽生物标 记的浓度。检测和/或定量可以直接在所述样品上或者间接地在来自其的提取 物上或在其^#物上^|^^ 亍。
在本发明的另 一方面中，通过检测并/或定量能特异性结合生物标记的 抗体或其片段评估所述肽生物标记的存在，所述抗体或其片段由所述受试者 M对所述肽应答而产生，因此存在于来自患有重性抑郁障碍或具有其素因
的受试者的生物样品中。
检测及/或定量可以通过任何适宜于识别具体蛋白在来自患者的生物样
品或者生物样品的纯化物或提取物或其稀释物中的存在和/或量的方法来进
行。在本发明的方法中，定量可以通过测量所述肽生物标ie^所述一个或多
个样品中的浓;lilUi行。可#^发明的方法测试的生物样品包括脑脊液(CSF )、 全血、血清、血浆、尿、唾液、^体液(大便、泪液、滑液、痰)、呼出气
13如凝结的呼出气、以上样品的提:^物或纯化物，或者它们的稀释物。生物样品
还包括来自活受^r或尸体的组织匀浆、组织切片及活组织检查标本。可制备 所述样品，例如在合适时可将其稀释或棘，并以通常的方^^##。
对分泌粒蛋白n或vgf肽生物标记的检测和/或定量可以通过检测所述肽 生物标记或其片段(例如截短c末端或n末端的片段)iMi行。合适的片段
长度大于4个絲酸，优选5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20个a酸。
可以通过例如SELDI或MALDI-TOF直接检测所述生物才朽己。或者，可以 通过与一个或多个配体的相互作用直接或间接J4^测所述生物标记，所述配体 例如为能特异性结合所i^物才朽己的:^^或其结合生物标记的片段,或者， 的肽、配体(例如适体)或寡核苷酸。所述配体可具有可;^测标记物，例如发 ;Jbf示记物、荧光才朽己物或放射性标记物，及/或亲和标记物。
例如，检测及/或定量可以通过一种或多种选自以下的方法来进行 SELDI (-TOF) 、MALDI (-TOF)、基于一维^^分析、基于二维^^分析、质谢MS )、 反相(RP) LC、粒度渗透(size permeation)(皿过滤)、离子交换、亲和
(affinity )、 HPLC、 UPLC及^f&基于LC或LC MS的技术。合适的LC MS技 术包括ICAT ( A卯lied Biosystems, CA， USA)或iTRAQ⑧(A卯lied Biosystems, CA， USA )。还可以佳月液相色谱(例如高压^目色语(HPLC)或低压斜目色谱
(LPLC))、薄层色谱、NMR (核磁共振)色镨。
本发明的诊断a测方法可包含，通过SELDI T0F或MALDI T0F分析脑脊 液(CSF)样品，以检测SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 4的肽生物标记的存 在或水平。这些方法iiit合于临床筛查、预后、监测治疗效果、鉴定最可食树 胁治疗处理应答的患者;用于药物筛查及开发，以及识别药物治疗的新把点。 检测并/或定量所述肽生物标记可以使用免疫学方法进行，所述免疫学 方法涉及能特异性结合所述分泌粒蛋白n肽生物标记(例如结合由显示于SEQ IDN0: 1的M酸序列或其片段组成的肽)的抗体或其片段；或者能特异性 结合所述VGF肽生物标记(例如结合由显示于SEQ ID NO: 4的M酸序列或 其片^gi且成的肽)的抗体或其片段。合适的免疫方法包括夹心免疫测定，例 如使用识别肽生物标记上的不同表位的两种抗体来进行肽生物标记检测的 夹心ELISA;放射免疫测定(RIA)、直接、间接或竟争性酶联免疫吸附测定
(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和^^T基于颗粒的免 疫测定(如偵月金、4^胶乳颗粒；磁性颗粒；或Q-dot)。免疫方法可以用例如^t量滴定;tl或^"^jM^f亍。
本发明的免疫学方法可以基于例如伶河以下的方法。
免疫沉淀是最简单的免疫测定方法；该方法测量了沉淀物的量，所i^i咒淀 物是在所述试剂抗体与所述样品孵育并与存在其中的M原(在本例中，所述 ^^、是SEQ ID NO: 1的肽生物才朽&iL其片段、或者SEQ ID NO: 4的肽生物 标iiil其片段)反应以形成不溶解的聚集物后形成的。免疫沉^^应可以;1^ 性的或定量的。
在颗粒免疫测定中，多种抗体与颗粒连接，并且所述颗粒能同时结合多 种抗原分子。这大大加快了这种可见的反应的速度。这使得可快速并敏感地 检测所述生物标记。
在免疫浊度法中，抗体和所述生物标记上的乾抗原的相互作用可形成太 小而不会沉淀的免疫复合物。然而，这些复合物#^:射投射光，并且可以使 用比浊计测量这种散射的投射光。可以在所述反应的数分钟内确定所述抗原 (即生物标记)浓度。
放射免疫测定(RIA)方法应用^t射性同位素例如1125标记抗原或抗体。 所使用的同位素发射Y射线，通常在除去未结合(游离)的放射标记物后测 量该射线。与其他免疫测定相比，RIA的主务阮点是较高的敏感性，易于信 号检测，并且狄熟的、快速测定。主絲点是^J^絲所面临的m和妙 风险，以及与维护许可的辐射^4^Ht理程序相关的时间和费用。由于这个原 因，RIA在常规临床实验室实践中已经^i4^上被酶免疫测定代替。
酶免疫测定(EIA)作为放射免疫测定(RIA)的替代方法被开发。这种 方法使用酶来标记抗体或耙抗原。EIA的潮:感性接近RIA，但没有iyt性同位 素面临的危险。 一种最广泛应用的用于检测的EIA方法是酶^Jt疫吸附测定 (ELISA)。 ELISA方法可使用两种抗体，其中的一种对 ^原是特异的，而另 一种与S^f禹联，添加所i^的底物形威/f匕学^ib信号或荧光信号。
荧光免疫测定(FIA)是指应用与底物作用以形成焚光产物的荧光标记 物或酶标记物的免疫测定。荧光测量本质上较比色度(分光光度)测量更敏 感。因此，FIA方法具有比应用吸光度(光密度)测量的EIA方法更大的分析 敏感性。
化学^jt免疫测定利用的是在用化学能激发时产生光的化学iUb^i己物； ^测器测 发射光。
本发明的免疫方法因此可^^已知的方法来进行。^T直接(例如4M传
15感器芯片)或间接过程可用于检测本发明的肽生物标记。
生物素-亲和素或生物素-抗生蛋白链菌素体系为适用于本发明的免疫 方法中的一般性标记体系。
一种结合配偶体(半抗原、抗原、配体、适体、 抗体、酶等)经生物素标记，另一种配偶体(表面例如孔、珠、传感器等)
经亲和素或抗生蛋白链菌素标记。这是用于免疫测定、基因探针测定和(生 物)传感器的常规技术，但为间接而非直接的免疫固定途径。例如，对本发 明的肽生物标记特异的生物素化的配体(例如抗体或适体)可以固定在亲和 素或抗生蛋白链菌素表面上，然后可以将所述固定的配体暴露于包含或疑似 包含所述肽生物#^的样品，以检测并/或定量本发明的肽生物标记。然后， 所述固定抗原的检测及/或定量可以通it^文描述的免疫方法来进行。
本文使用的术语"抗体"包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、双 特异性抗体、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和F (ab。2片段、Fab 表达库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体以及上述任一种抗体的表位结 合片段。本文使用的术语"抗体"还指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的 免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合的抗原结合位点的分子。本发明的 免疫球蛋白分子可以是任何类别的免疫球蛋白分子(如IgG、 IgE、 IgM、 IgD 和IgA)或亚类的免疫球蛋白分子。
疾病特异性的关键生物标记的识别对于诊断过程和治疗方案發沐而言十 分重要。佳月预测性生物标记可以开发合适的诊断工具例如生物传感器，因此，
在本发明的方法和用途中，枱溯^:量可以使用生物传感器、微量分析体系、
工程体系、#^分离体系、免疫色"^系或^it宜的分析装置iMi行。 生物传感器可以引AJ^于检测一种或多种生物标记的免疫学方法、电学技术、 热学技术、磁学技术、光学技术(例如全息图)或声学技术。^J^这类生物传 感器可以检测生物样品中存在的预期浓度的一种或多种耙标生物才M己。
可以使用引入了基于"smart"全息图或高频声学系统的技术的生物传 感器检测本发明的一种或多种生物标记，这种系统特别适用于"条形码(bar code)"或阵列的构型。
在smart全息图传感器(Smart Holograms Ltd, Cambridge, UK)中， 全息图像储存于薄聚合物膜中，该膜 1敏以特异性地与生物标记反应。当 接触时，生物标记就与聚合物^^应导致全息图显示的图^象发生改变。读出的 测试结果可在光强度、图像、色彩和/或图像位置上发生变化。对于定性分 析和半定量分析，传感器全息图可用肉目艮读出，因此不需^^吏用检测设备。当需要定量测量时可以使用简单的色彩传感器读出信号。样品的不透明度或 颜色不H扰传感器的工作。传感器的形式使得可同时对几种物质进行多重 检测。可以设计可逆和不可逆的传感器以满足不同的需要，并可以持续监测 某种特定的目标生物标记。适当地，用于检测本发明的生物标记的生物传感器可以以合适的方式 与生物分子识别相结合，以便将检测到的样品中生物标记的存在或数量转化为信号。可以调整生物传感器以适用于"替代场所(alternate site)"诊 断检验，例如在病房、门诊病人的公寓、诊所、家中、场地和工作地点进行 诊断检验。用于检测本发明的生物标记的生物传感器包括声学传感器、等离子体 振子共振传感器、全息传感器和微米工程(microengineered)传感器。可 以在传感器中使用印迹识别元件、薄膜晶体管技术、磁声共振装置以及其 他新的声电系统，以用于本发明的一种或多种生物标记的检测。涉;W本发明的生物标记Ji^行检测并/或定量的方法可以在台式装置上进行，或者可结合一次性的诊断或监测平台进行，所述平台可以在例如 医生诊室或患者病床边等非实验室环境中使用。实行本发明方法的合适的生 物传感器包括带有光学或声学解读仪的"信用"卡。可以配置生物传感器以 使得将采集到的数据通过电子仪器传#医生以侵解析，这样就可形成"电 子神经医学(e-neuromedicine)"的^ftl;。在本发明的方法、用途和生物传感器中，测量来自试验受试者的试^r样 品中的SEQ ID NO: 1的分泌粒蛋白n生物标记肽或其片段的含量，若检测 到试验样品中生物标记肽的水平比来自正常个体的正常对照样品中的水平 低，就表明试验受试者患有重性抑郁障碍或存在其素因。例如，在来自患有 重性抑郁障碍或存在其素因的试验受试者的样品中，检测到的SEQIDNO: 1 的肽的水平通常会比正常对照样品中该肽的存在量低40%。若用比值表示， 当试验样品中SEQ IDN0: 1的肽与正常对照的量的比值为0. 75:1以下，低 水平的SEQ ID NO: 1的肽錄明具有重性抑郁障碍或其素因。在本发明的方法、用途和传感器中，测量来自试验受试者的试验样品中 的SEQ ID NO: 4的VGF生物标记肽的含量或其片段，若检测到试验样品中 生物标记肽的7jc平比来自正常个体的正常对照样品中的水平高，g明试验 受试者患有重性抑郁障碍或存在其素因。例如，在来自患有重性抑郁障碍或存在其素因的试验受试者的样品中，17检测到的SEQ ID NO: 4的肽的水平通常会比正常对照样品中该肽的存在量 高l. 3倍以上，例如高1.5倍。若用比^示，当试I^样品中SEQ ID N0: 4的肽与正常对照的量的比值大于1. 3倍以上(但低于2. 5倍以上)，例如 约1. 5:1，高水平的SEQ ID NO: 4的肽a明具有重性抑郁障碍或其素因。在精神分裂^M目关精神病初次发作的未用药的患者中已发现，SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标记具有非常高的7JC平。在这些受试者中检测到的SEQ ID NO: 4的VGF J3;MC平比出现于正常对照样品中的量高大约2. 5倍。通过评估存在于 "^^样品中的SEQ ID NO: 4的VGF Jl;b!lc平，检测并区分MDD和##分裂斜目 关精神病初:^JL作是可能的。任何合适的动物都可用作除人外的受试动物，例如除人外的灵长动物、 马，牛，猪，山羊，绵羊，狗，猫，鱼，啮齿动物例如豚鼠、大鼠或小鼠； 昆虫(例如果錄("iY^o/7力/7a)),两栖类(例如非洲蟾蜂(Z朋o/w;y)) 或线虫(61 e/柳/zs)。试验物质可为已知的化学物质或药物学物质，例如包括但不限于抗抑郁 障碍的治疗剂；或者，物质可为新合成的或天然的化学实体，或者为前述 两种或多种物质的组合。还提供了识别能够促进受试者的分泌粒蛋白n肽生物标记生成的物质 的方法，所述分泌粒蛋白n肽生物标记优选地由SEQ ID NO: 1的M^ 列或其片段组成，所述方法包括将试验细J!^露于，物质，并监测所述试 验细胞内的或由所述试验细胞分泌的分泌粒蛋白n肽生物标记的水平。还"^供了识别能够抑制受试者的VGF生物标记肽生成的物质的方法，所 述VGF肽生物标记优选地由SEQ ID NO: 4的^酸序列或其片段组成，所 述方法包括将试验细il^露于试验物质，并监测所述试验细胞内的或由所述 试验细胞分泌的VGF肽生物标记的水平。在基于细胞的测试方法中，试验细胞可为原核细胞，但是优选使用真核 细胞。合适地，真核细胞可为酵母细胞、昆虫细胞、果蝇细胞、两栖动物细 胞(例如来自非洲蟾蜍的细胞)、线虫细胞；或来源于人、除人外的灵长类、 马、牛、猪、山羊、绵羊、狗、猫、鱼、啮齿类或鼠类的细胞。在识别具有潜在治疗用途的物质的方法中，可以使用能够表达下列一 种或多种多肽的除人外的动物或细胞，所述多肽选自人分泌粒蛋白n多肽和 蛋白水解酶类，优选地为能切割人分泌粒蛋白n多肽的人蛋白水解酶类；以 及人VGF多肽和蛋白7jc解酶类，优选地为能切割人VGF多肽的人蛋白水解酶类。如果使用除"卜的动物或除"卜的动物细胞，那么方法和用途可涉;5i检 测所述动物与人分泌粒蛋白n或vgf肽生物标记等价的分泌粒蛋白n或VGF肽生物标记，即SEQIDN0: 1的人分泌粒蛋白肽n的动物同源物或SEQ id no: 4的人vgf肽的动物同源物。筛选方法还包括识别能与本发明的分泌粒蛋白n或VGF肽生物标记结 合的配体的方法，所述方法包括在存在生物标记肽以及适于结合的条件下孵 育试验物质，并且检测并/或定量所述肽与所述试验物质的结合。在分泌粒蛋白n肽生物标己是由SEQIDNO: 1所示序列(人分泌粒蛋白 n的529-566位氨基酸)或其片段组成的肽的情况下，如果试验物质结合所 述分泌粒蛋白n肽生物标记(人分泌粒蛋白n的529-566位M酸或其片段)，但不结合全长的分泌粒蛋白n 、分泌神经素(sg n 154-186 )或分泌粒蛋白n衍生的肽(Sgn 187-252 ),就表明有特异性结合。哺乳动物的分泌粒蛋白n (sg n )具有ytjft碱性残基，已知在成对的二4^^序列处出现蛋白酶水解性裂解，il^明SGn蛋白可以,工成多于10种的肽。它们中的两种，即分泌神经素(sgn 154-186 )和分泌粒蛋白n衍生肽(Sgn 187-252 )已经被证实在人中作为神经肽。在VGF生物标记肽是由SEQ ID NO: 4所示序列(人VGF的23至62位 氨基酸)或其片段组成的肽的情况下，如果试验物质不结合成熟全^AVGF 蛋白或由人vgf的26至62位JL^酸组成的蛋白(n端的三肽被截短的序列)， 就表明有特异性结合。基于本发明的生物标记、用途和方法的高通量筛选技术，例如以阵列形 式构型的技术，适于监测用于鉴定能结合所述生物标记的可能有用的治疗化 合物的生物标记信号，所述化合物例如配体例如天然化合物、化学合成化合 物(例如来自组合文库)、肽、单克隆抗体或多克隆抗体或其片段。>^发明的方法可以阵列形式来进行，例如在芯片上或以多孔阵列的形 式来进行。所述方法可适用于进4亍单次测试或多次相同测试或多次不同测试 的平台，并且可以以高通量形式来进行。本发明的方法可以包括进行一次或 多次另外的不同的测试，以确认诊断或排l^珍断，和/或进一步表征某种病 症。本发明还提供了通过本发明的识别或筛选方法或用途识别或能识别的物质，例如酉5体。这类物质能够直接或间接地促进分泌粒蛋白n肽生物标记 的活性，或者能增加分泌粒蛋白n肽生物标记的生成。这类物质能直接或间19接地抑制VGF生物标记肽的活性，或者能抑制VGF生物标记肽的生成。术语 "物质"包括不直接结合所述肽生物标记也不直接调制其功能，但是间接调 制所述肽生物标记功能的物质。配体也包括在物质这一术语中；本发明的配 体(例如天然的或化学合成的化合物、肽、适体、寡核苷酸、抗体或抗体片 段)能结合(优选特异性结合)分泌粒蛋白n肽，mSEQ ID NO: 1的分泌 粒蛋白nM其片段；或者能结合(优选特异性结合)VGF肽生物标记，优 选SEQ ID NO: 4的VGF肽生物标记或其片段。本发明还提供了本发明的物质用于治疗重性抑郁障碍或其素因的用途。还提供了本发明的物质用作药物的用途。还进一步提供了本发明的物质用于制备治疗重性抑郁障碍或其素因的 药物中的用途。还提供了用于诊断或监测重性抑郁障碍或其素因的试剂盒。适当地，本 发明的试剂盒可包括选自下列的一种或多种组成部分特异性针对分泌粒蛋白n肽生物标记的配体、分泌粒蛋白n肽生物标记或分泌粒蛋白n肽生物标记的结构/形状模拟物；特异性针对VGF肽生物标记的Si体、VGF肽生物标 记或VGF肽生物标记的结构/形状模拟物； 一个或多个对照物、 一种或多种 反应试剂以及一种或多种消耗试剂；任选to含有试剂盒的使用说明书。本发明还进一步提供了由SEQ ID NO: 1的M酸序列或其具有至少4个 ^J^酸的片WSL成的经分离并纯化的肽。还提供的是，编码SEQ ID NO: l的 M酸序列或其具有至少4个氨基酸的片段的经分离并纯化的核酸，以及能与 其特异性杂交、M与其互补的经分离并纯化的核酸序列。能特异性杂交的核^1在中严格度或高严格度条件下能与耙核酸杂交 的核酸。杂^^应的严格度可由本领域普通技术人员容易地确定，并""^l: 依据序列长度、洗涤温度及盐浓度的经验计算值。4而言，较长的序列适 当退火需要更高的温度，而较短序列需更低的温度。当互补的链存在于低于 它们的解链温度的环境中时，杂交一^t依赖于变性核酸的再退火能力。序列 之间的互补程M高，则可以使用的相对温JL^高。其结果是，其遵循这样 的规律，即较高的相对温度将倾向于佳^JlM更严格，而较低的温度则没 那么严格。另外的详细叙iiA对杂交反应严格度的说明见Ausubel Wa/.， Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience Publishers, (1995)。20本文使用的"高严格度"*是这样的务降(1)施用^^氐的离子强JL及 较高温度进行洗涤，例如在50C下的0. 015 M氯化钠/0, 0015 M杼檬酸钠/0.1% 十二^J^酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂如甲酰胺，例如，在421C下 的50。yi(v/v)曱餘与0.1%牛血清白蛋白/0. l%Ficoll/0.1%聚乙烯他咯酮/50 mM pH 6. 5的磷酸钠緩冲液与750 mM氯化纳、75 mM柠檬酸钠；或者(3)在 42匸下施用50%甲,、5xSSC (0.75 M NaCl、 0. 075 M柠檬酸钠)、50慮 磷酸钠(pH 6.8)、 0.1%焦磷酸钠、5xDenhardt溶液、超声处理的絲DM(50 mg/ml )、 0.1% SDS和10。緘酸葡^t，在421C下于0. 2 x SSC (氯化钠/ 杼檬酸钠)中洗涤，在55匸下于50%曱酰胺中洗涤，然后在55t:下用含EDTA 的0.1 x SSC组成的高严格度洗液洗涤。"中严格度"条件可以按Sambrook ef a/.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989的描述识 别，包括使用低于上述严格度的洗液和杂交务降(例如温度、离子强度及％ SDS)。 一个中严;^度条降的实例为，在37X:下于包含以下組分的溶液中孵育 过夜20%曱驗、5xSSC (150niMNaCl、 15mM柠檬酸三钠)、50 mM磷酸钠(pH 7.6)、 5xDenhardt溶液、10。诚酸葡，和20 mg/ml经变'I^JL剪切的 DNA,然后在约371C至50X:于1 x SSC中洗涤过滤物。本领域技术人员将 知道如何调整温度、离子强座_等，这些是适应诸如序列长度等因素所必需。对重性抑郁障碍的生物标记的识别使得可以将诊断过程和治疗方案进 行#。目前在确定有效的疗法时会有明显的延误，而M今为止还不能够 对药物反应作出迅速的评估。对于既定的治疗方法，通常许多抗抑郁治疗都 需要长达几周至几个月的治疗"j^"。对本发明的肽生物标记的检测可用于在 进行临床试验前筛选受试者。所述生物标记4I:供了指示下列指标的手段治 疗反应、无反应、不良副作用情况、药物顺应性程度以M得足够的血清药 物水平。所述生物标记可以用于提供不良药物>^应的警示。由于对反应的评 估可用于剂量^t调、尽量减少处方药物的数量、减少获得有效治疗的^4误时 间和避免不良的药物反应，因此生物标记可用于开发个性化的脑部疗法。因 此，通过监测本发明的生物标记，可以精确地订制患者的护理方案，以满足 由该患者的障碍和药物基因组学特征决定的需求，因此，可使用生物标记来 逐步调整到最佳剂量、预测阳性治疗反应以及识别处于严重副作用的高风险 的患者。基于生物标记的检测提供对于"新"患者的一线评估，并且提供了用于正确和快速诊断的^:观量度，这种客观量度的速度和准确性是使用目前的 主观量度无法达到的。此外，诊断性生物标记测试可用于识别处于尤艮为重性抑郁障碍的高 风险的家庭成员或患者。这使得可以启用合适的治疗方法，或者启动预防性 措施例如控制危险因素。这些手段被认为可以改善治疗效果并且可能防止明 显地出现所述障碍。生物标记监测方法、生物传感器和试剂盒作为患者监测工具也同样重 要，可以使医生确定疾病的复iLA由于障碍的恶化、患者顺应性不良还是药 物滥用。如果药物学治疗被评估为不足，那么就要重新进行或加强治疗；如 果合适可以改变治疗。由于生物标"^^于障碍的状态十分敏感，因此它提供 了药物疗法或药物滥用的影响的指示。将通过以下的实施例解释本发明。实施例 材料CSF样品取自年龄相当的M个体(n=40 )和抑郁(MDD)患者(n=16 )、 0CD患者(n=5 )及阿尔茨海默病患者(n=10)。所有化学试剂均获自Sigma。 蛋白质芯片和阵列获自Ciphergen公司(Guildford, UK)。 用于SELDI分析的CSF样品的制备将5plCSF的等^样用强阴离子交换(Q10)芯片按照厂商的说明书 (Ciphergen Biosystems )进4亍处理。简而言之，4吏用结^^緩沖液(100 mM Tris-HC1， pH 9. 0)在室温下于振荡器(频率为5Hz)上将阵列点预激活两次， 每次10分钟。然后将50Ml结合緩冲^至每个蛋白质点上，然后每个点加 入5 ji 1的CSF样品。M白质芯片在振荡器上室温孵育30分绅。将芯片用结 合緩冲液洗涤两次，再用HPLC级H20洗、^—次，然后在空气中晾干。然后将 芯片连续用1 Ji 1的溶于50%乙腈和0. 5W的三氟乙酸的饱^p度为100%的芥子酸 (3，5-二曱氧基-4-羟基肉桂酸)处理两次。用Ciphergen ProteinChip Reader (PBSII型)分析芯片。每个样品分析两次，以确保识别差异表达的蛋 白质的可重复性。Ciphergen ProteinChip"的SELDI-T0F—MS分析。Ciphergen Proteinchip Reader (PBSII型)^^斤阵列。^^、^ 强 度为230-280任意^的平均65次激光沖击产生蛋白质的质谱。为获取低分22子量蛋白质的数据，检测的大小范围为3至20kDa之间，最大大小为25kDa。 、M聚焦于10kDa。检测器灵Jtli殳置为8，激光强麽^L置为190。对于高分 子量的蛋白质，检测大小范围为20至150kDa之间，最大大小为250kDa。激 光聚焦于85kDa。检测器灵^t^i殳置为9,激光强;^i殳置为260 (对于1: 4的 稀释度)和280。阵列表面捕获的每种蛋白质的质荷比(迈/z)根据下i^卜部 校准标准物(CiphergenBiosystems)测定牛胰岛素(5733. 6 Da)、 AJt素 (8564. 8 Da )、牛细胞色素c( 12230. 9 Da )、牛超氧化物^t化酶(15591. 4 Da )、 牛oc-乳球蛋白A( 18363. 3 Da )、辣才Mt^化物酶(43240 Da )、 BSA( 66410 Da) 和 耕清蛋白(77490 Da)。 CSF肽的LC-MS-MS分析。
使用具有10kDa标称分子量(nominal molecular weight)截留值的 Nanos印"(Pa11 Corporation)离心超滤装置从50p 1的CSF样品中除去 蛋白质。在C18 ZipTip (Waters)上通过固相微提取使滤液的等分试样
(5 ji 1)脱盐，并用0.1%曱酸/50%水化乙腈(1 ji 1)将所述肽直接洗脱至 纳米喷射头(Protana Engineering)。将纳米喷射头插入至与四极杆飞行 时间质谱仪(quadupole-time-of-f light mass spectrometer) (Qstar Pulsar i， Applied Biosystems-MDS Sciex)相连接的纳米电喷雾离子源
(Protana Engineering ),然后在350-1500原子质量单位的m/z范围内 用5至10分钟获取全扫描TOF谱。在50-1700原子质量单位的m/z范围内 获取MS/MS谱，直到获得足够的信噪比为止。在数据采集过程中优化了碰 撞能量，以《更得到最宽的片段离子的范围。
人工解析MS/MS的数据以便提取"序列标签"，使用该标签和BioAnalyst 软件(Applied Biosystems)可以检索NCBI NRDB数据库。检索结^ii狄 MS/MS数据的进一步AX解析来证实。 统计学分析
^j l PROTEINCHIpM^t据分析^:件3. 0 (Ciphergen Biosystems )来 分析数据。对于^-"次比较，#^^被比较的组中所有曲线的总离子电;树原 始的强度数据进##准化。对于低分子量范围，#%强度标准化为m/z在3000 至25000 Da的范围内的总离子电流；对于高分子量范围，#%强^1标准化为 m/z在4000至250000 Da的范围内的总离子电流。使用Biomarker Wizard application (非^4t计算；Ciphergen Biosystems) ;jM^译所有的诿，并自 动检测已定量的质量峰。使用质量窗的0. 2%进行二次峰筛选(second-pass
23peak selection)来完财峰的标记，妙入了估计的峰。对各组曲线(正常 受M和患有障碍的受^")进行了样品统计。计算了各组间的蛋白质差异(倍 数改变)。
更糾地，在pH9 (50mMTris-HCl)下，Q10阴离子交换蛋白芯片 以SELDI-MS分析了来自16名抑郁患者的5 ju 1 CSF样品中的CSF蛋白质谱， 连同40名M志愿受絲的CSF蛋白质镨。Ciphergen Express软件处 理该谱，输出S/N >5的峰^HM SIMCA (Umetrics， Sweden)进一步分析。 分值曲线显示了对照和抑郁患者之间部分的分离。加栽的曲线显示出， VGF23-62和分泌粒蛋白n ( 529-566 )肽是关键的蛋白/肽峰，对所iii且次分 离贡^^大。
一个3. 96 kDa (或来自ESI~MS/MS谱的3. 95 kDa)的肽 _位至天然VGF 蛋白的23至62位氨基酸(SEQ ID NO: 4)，这紧接预测的分-i^号肽(^^ InterProScan: European Bioinformatics Institute:
爾.ebi. ac. uk/cgibin/iprscan )。该3. 96 kDa肽具有显示于SEQ ID NO: 4 中的#^酸亭列。
进行了所述3. 96 kDa肽与所述3. 69 kDa肽的序列对比。使用ES/MS-MS 重新测序显示出，CSF中的该3. 69 kDa肽是短3个g酸(在N末端)形式 的3. 96 kDa肽(SEQ ID NO: 6 )，它在来自#^志愿受试者和抑郁患者的CSF 中的表ii^有差异(p=0. 87)。
对来自抑郁患者、OCD患者和阿尔茨海默病患者的CSF样品的分析
来自患有抑郁的受试者的CSF样品的最突出的特征在于分泌粒蛋白n
(529-566 )肽的明显减少。在对照和OCD患者之间没有出现差异。另夕卜，在 对照和阿尔茨海默病CSF样品之间没有出现显著性差异。来自患有抑郁的受 试者的CSF显示出VGF23-62 #达的增加；该JlMc平显示出比在来自正常健 ^照的CSF中的水平高大约50t已经识别出，该JiME初^JL作的未用药的 ,分裂症患者中祐i著iikJi调；在该组中，VGF肽的水平显著地高于抑郁患 者中的水平。
权利要求
1. 一种或多种以下的肽作为重性抑郁障碍或其素因的生物标记的用途，所述肽选自SEQ ID NO1或其片段，以及SEQ ID NO4或其片段。
2. —种诊断或监测重性抑郁障碍或其素因的方法，包含在来自一个"^受 试者的样品中检测并/或定量如权利要求l中限定的一种或多种肽。
3. —种监测患有、疑似患有或易于感染重性抑郁障碍的受试者中的治疗^ 的方法，包含在来自所述受试者的样品中检测并/或定量如权利要求l中 限定的一种或多种肽。
4. ^H权利要求2或3的方法，所述方法在两个或多个时^一个:^受试者取得的样品上来进行。
5. a权利要求2-4中任一项的方法，还包含比较存在于两个或多个时;Wt 得的样品中的一种或多种肽生物标记的水平。
6. 4歸权利要求2-5中务一项的方法，包含比较存在于所述^^样品中的一 种或种肽的量与存在于在治疗开始之前取自所述受试者的一个或多个样 品中的量及/或在早期治疗阶段取自所述受试者的一个或多个样品中的 量。
7. 才艮据权利要求2-6中任一项的方法，还包#测所述一种或多种#取自两个或多个时机的样品中量的变化。
8. 根据权利要求2-7中任一项的方法，包含将存在于所述^^样品中的所述一种或多种肽生物标记的量与一个或多个对照相比较。
9. 才MI权利要求8的方法，包含比^;斤述一种或多种^Ma—个^^样品中的量与存在于来自 一个正常受试者的样品中的量。
10. ，权利要求2-9中任一项的方法，其中样品取自^ 郁治疗之前及/或 之中/或^。
11. 4 权利要求2-10中任一项的方法，其中样品在一个受財的余生或其 部分间隔取得。
12. 根据权利要求2-11中^-项的方法，其中定量通过测量所述一种或多种 肽生物#^￡^所述一个或多个样品中的浓度iMi行。
13. ^权利要求2-12中任，一项的方法，其中枱r测及/或定量通iti^自以下的一种或多种方法i!Ui行SELDI (-T0F) 、 MALDI (-T0F)、基于一维MM分析、 基于二维^^分析、质谱(MS)、反相(RP) LC、粒度渗透(皿i^虑)、离子交换、亲和、HPLC、 UPLC及^fe基于LC或LC MS的技术。
14. 才緣权利要求2-13中^-项的方法，其中检测及/或定量^^I一种免疫学 方法来进行。
15. 根据权利要求2-14中任一项的方法，其中检测和定量佳月生物传感器、 微量分冲斤体系、#^工程体系、M分离体系或免疫色^系i)U^f亍。
16. 才緣权利要求2-14中4—项的方法，其中所处物样品狄脊液、全血、 血清、血浆、尿、唾液、，体液、呼出气、凝结的呼出气、以上样品的 ^^物或纯化物，或者它们的稀释物。
17. —种生物传感器，所述传感器包括一种对由SEQ ID NO: 1的M酸序列 或其片^i且成的肽特异的抗体；^^ii^i包括一种对由SEQ ID NO: 4 的M酸序列或其片段组成的肽特异的抗体，所述生物传感器还包^^将所 itil每种生物标记的存在或量的抬測转化为信号的手段。
18. 根据权利要求17的生物传感器，其中所述或每种抗体是单克隆抗体。
19. 根据权利要求17或18的生物传感器，其中所述或每种抗体用一种可检 测的标i己物来才示H
20. 根据权利要求19的生物传感器，其中所述或每种可检测的标记物狄光标记物、荧光标记物或^L射性标记物，或者亲和标记物。
21. 根据权利要求17-20任一项中的生物传感器用于检测并/或定量如权利 要求1中限定的肽的生物标记的用途。
22. 才艮据权利要求21的用途，其中所述检测及/或定量在如权利要求16中限 定的生物样品上来ii行。
23. —种识别能^iiSEQ ID N0: 1的分泌粒蛋白n肽生物标记在一个受^ 中产生的物质的方法，包含将一种 细胞暴露于一种试验物质，并监^其片段的水平。一'
24. —种识别能结合SEQ ID N0: 1的分泌粒蛋白n肽生物标^i^其片段的配 体的方法，包含在适宜结合的务降下和存在肽生物标记的情况下孵育一种 ^Ci^物质，并JL^测并/或定量所皿生物标记与所述^^物质的结合。
25. —种识别能傻违SEQ ID N0: 1的分泌粒蛋白n肽生物标记在一个受^ 中产生的物质的方法，包含将一种试验物质给予一个动物受试者，并且 检测并/或定量存在于所述受试者中的所述分泌粒蛋白n肽生物标记或 其片段的水平。
全文摘要
分泌粒蛋白II和VGF肽是重性抑郁障碍的生物标记。它们可用于诊断方法、监测方法和筛查方法中。
文档编号G01N33/68GK101506658SQ200780030373
公开日2009年8月12日 申请日期2007年8月15日 优先权日2006年8月16日
发明者J·T·黄, S·巴恩 申请人:剑桥企业有限公司