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专利名称：沙门氏菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测沙门氏菌的方法。以及用于该方法的沙门氏菌金标快速 诊断试剂盒和其制备方法。
背景技术：
沙门氏菌是沙门氏菌病的病原体。属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的 近一千种菌株中。按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基因菌组。其中与人体疾病有 关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆 菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一。其病原沙门氏菌属 肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致肠胃炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除感染人外， 还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人、畜感染沙门氏菌后可呈 无症状带菌状态，或表现为有临床症状的致病性疾病，它可能加重病态或死亡率，或降低动 物的繁殖生产力。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介。感染程度主要取决于沙门氏 菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老人及，免疫缺陷个体。根据国际 惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，使大多数食物不含沙门氏菌，从而有 效预防沙门氏菌病。为此，人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中，做出了不懈努力。自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原菌以来。检测方法都是建 立在采集被感染病人的粪便或血液作为临床检测样本。在此后的60年间，用于从食品中分 离沙门氏菌的方法实质上与那些用于检测临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素 限制了用于临床病料的检测方法应用于食品分析的检测中。第一，通常情况下，被污染食品 中的沙门氏菌的含量比被感染病人的病料中的含量低很多；第二，食品本身的性质会干扰 病原的检测例如，某些食品中固有菌种可能处在一个很高的水平，从而影响特定细菌的选 择性分离和鉴定；第三，与临床病料不同的是，经加工的食品，由于加热、干燥、高含盐量、酸 和冷冻等因素的影响，其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”。这就形成了一 个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品 分析家来说有很大影响，因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死 亡和试验失败而告终。为克服上述困难，人们建立了一种简单的微生物增殖方法，专门针对 以食品为传播载体的病原菌。虽然这些方法本身已被证明是可靠的，但却很耗时，整个实验 过程需要4 7天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常 不被采用。随着DNA和抗体技术的发展，近10 15年间发展了无数改进的方法，其中可以 在48h内检出沙门氏菌，这些方法通称为快速检测。沙门氏菌感染具有发病急，特异性强等特点。同时该菌的自然来源非常广泛。目 前对其致病机制尚不很清楚。虽然近年来相关快速检测技术取得了很大的进展，但是仍然 存在一些缺陷。所以，进一步研究该菌的快速、准确、灵敏的检测方法对食源性致病菌感染
3的控制、疾病的诊断和流行病学调查非常关键。本发明采用沙门氏菌免疫家兔或羊制备多表位抗体，免疫BALB/c小鼠制备单克 隆抗体，研制一种适用于现场操作的金标快速诊断试剂盒。本试剂盒可快速(5-20分钟出 结果)特异性的检测沙门氏菌，亦用于发病现场快速诊断。本发明的公开本发明的第一目的是提供一种沙门氏菌的检测方法。该方法为一步法检测，该 方法检测迅速、灵敏度高、特异性强、操作简便，且无需专门设备。适用于临床检测、流行病 学调查和场地检疫等多种场合。本发明的第二目的是提供一种沙门氏菌金标快速诊断试剂盒。该试剂盒针对沙 门氏菌检测，提供一种简便而且直接的一步法检测试剂盒，利用该试剂盒检测沙门氏菌检 测迅速、灵敏度高、特异性强，操作简便，无需专门设施。本发明的第三目的是提供一种沙门氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法。该方 法简稳定性好、重复性好。本发明的第一目的可通过如下措施来实现一种沙门氏菌检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗沙门氏菌抗体包括 多抗或单抗载于玻璃纤维或无纺布载体上，然后与胶体金标记的抗体载体相连。检测载体 上包被抗沙门氏菌抗体包括多抗或单克隆抗体形成的检测线和由羊、兔抗鼠抗体形成的控 制线；( 取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述样品稀释液含有沙门氏菌， 则在检测载体上形成紫红色的检测线和控制线；如果出现两条紫红色的线，则检测结果判 定为阳性，若仅有一条紫红色的控制线，则结果判定为阴性。本发明的第二目的的课通过如下措施来实现一种沙门氏菌金标快速诊断试剂盒内设沙门氏菌金标检测卡组成。检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。所述的沙门氏菌金标 检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层 之间设有金标抗沙门氏菌抗体层，在检测层上包被有由抗沙门氏菌多抗或单抗组成的检测 线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。本发明的第三目的可通过如下措施来实现一种沙门氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层和检测 层的控制线和检测线的包被，然后在衬板上组合沙门氏菌金标测试条和检测卡。所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为 0. 005-0. 012%的氯金酸中加入溶液体积的1. 2-2%、浓度为g/ml的柠檬酸三钠，煮 沸10-20分钟，可得到15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗沙门氏菌抗体在胶体金 溶液中用0. 2M碳酸钾溶液，调pH7. 8-8. 8，加入l-6mg/100ml沙门氏菌抗体，搅拌后，再在溶 液中加入0. 1-0. 6g/100ml动物血清蛋白，4°C静置2_4小时；iii将上述胶体金溶液经2000 转/分钟离心10-15分钟，弃沉淀物，收集上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60-80 分钟离心得沉淀物；ν将沉淀物溶于4-10ml/100ml，0. 02M、pH7. 4Tris-HCI缓冲液得胶体 金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6%的动物血清蛋白和0. 01-0. 06%叠氮钠；vi将胶体金溶液 浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37°C干燥过夜形成金标抗体层。所述的检测 层的制备是在硝酸纤维素膜上设有沙门氏菌抗体构成的检测线和有羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。其制备方法是在浓度为l_2mg/ml的多抗或单克隆抗体溶液中加入 的固定剂，再利用喷膜机将抗体喷在硝酸纤维素膜上，喷膜后37°C下封闭30分钟，0. Olml, pH7. 0的10%小牛血清的PBS，在37°C下封闭30分钟，0. 01ml, pH7. 0的PBS漂洗，37°C干
O所述的固定剂选用甲醛、丙酮中的一种。与现在的检测技术相比本发明具有如下优点1、本发明检测、诊断沙门氏菌的方法为一步法，具有较高的特异性和灵敏性，且操 作简便，无需专门设施。2、本发明的诊断试剂盒检测沙门氏菌时，具有较高的特异性和灵敏性，检测过程 操作迅速、快捷、方便，适用于临床检验、流行病学调查和场地检疫等多种场合。3、本发明的诊断试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好。图面说明

图1是发明检测板的外观结构示意图1-检测板 2-加样孔 3-检视窗图2是本发明检测板的内部结构示意图4-加样端吸水层 5-金标抗体层 6-控制线7-检测线8-检测层 9-吸水端吸水层 10-衬板本发明的实施方式本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一一种沙门氏菌检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗沙门氏菌抗体载于 玻璃纤维或无纺布载体上。在胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被沙门氏菌抗体形 成的检测线和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；( 取样品稀释液滴于胶体金标记抗 体的载体上，如上述稀释液含有沙门氏菌则在检测载体上形成检测线、控制线双线，显双线 结果被判定为阳性，仅控制线显色结果判定为阴性。参照图1，一种沙门氏菌金标快速诊断试剂盒内设沙门氏菌金标检测卡1。参照图2，所述的沙门氏菌金标检测卡1是在衬板10上设有加样端吸水层4、检测 层8和吸水端吸水层9，在检测层和吸水端吸水层9之间设有金标沙门氏菌抗体层5，在检 测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4和吸水端吸水层9由多层滤纸 制成；检测层8为纤维素膜，该纤维素膜为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜；金标抗体层为玻 璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。一种沙门氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层(5)， 检测层(8)的控制线(6)，以及检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合沙门氏菌抗原金 标测试条和检测卡(1)。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水纸层4和吸水端吸水层 9 ；在检测条中段粘贴包被检测线和控制线的纤维素膜层8，在加样端吸水纸层4与纤维素 膜层8的交接部位，夹贴含金标抗体5的玻璃纤维。玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸 层4中间，1/5部分在纤维素膜层8上。然后按4毫米宽、8厘米长规格切条，在组装于塑料 盒内。盒盖上加样孔正对测试条的加样端吸水纸层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。
所述的金标抗体层5的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备取IOOmg氯金 酸溶于IOOOml三蒸水中，加入15ml、浓度为的柠檬酸三钠，煮沸15分钟，冷却后得到 15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记沙门氏菌抗体取IOOml胶体金溶液，用0. 2M碳 酸钾溶液调PH8. 4，加入2mg沙门氏菌抗体，搅拌20分钟，再加入MOmg牛血清白蛋白，继 续搅拌5分钟，4°C静置2-4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10分钟，弃 沉淀物，收集上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟，收集沉淀物；ν将沉淀物 按lOml/lOOml的体积比溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI缓冲液得胶体金溶液。该缓冲液中含 0. 25%的牛血清白蛋白和0. 02%叠氮钠；vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体 渗出为止。在37°C，干燥2小时而形成金标抗体层5。如上述金标抗体为羊、兔抗沙门氏菌 抗体。所述的检测层8是在硝酸纤维素膜上设有沙门氏菌抗体构成的检测线7和由羊 或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线6。其制备方法是取出抗沙门氏菌抗体，调浓度至Img/ ml，加入2%的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7 ；再取羊或兔抗鼠IgG调浓度 为2mg/ml，加入2 %的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0. 5cm处，喷控制线6，按 20ul/10cm设置喷膜量，喷膜。37°C干燥，2小时，再用0. 01ml, pH7. O含10%小牛血清的 PBS，在37 °C下封闭30分钟，0. 01mlpH7. O的PBS漂洗，37 °C干燥。实施例二沙门氏菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒与例一同。该试剂盒的制备方法除制备胶体金标记的抗体为抗沙门氏菌单克隆抗体外，其他 条件与例一同。
权利要求
1.一种沙门氏菌检测方法，其特征在于(1)将胶体金标记的沙门氏菌抗体(多抗和单 抗)在于玻璃纤维或无纺布载体上，与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗沙门 氏菌抗体(多抗或单抗)形成的检测线和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取检测 样本稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述样品稀释液含有沙门氏菌，则在检测载 体上会形成紫红色的检测线和控制线两条线，则检测结果判定为阳性；若仅有控制线显色， 则结果判定为阴性。
2.一种沙门氏菌金标记快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒内设沙门氏菌金标检测 卡，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。
3.如权利要求2所述的沙门氏菌金标快速诊断试剂卡，其特征在于所述的沙门氏菌 抗原金标检测卡(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层G)、检测层(8)和吸水端吸水层 (9)，在检测层(8)和加样端吸水层(4)之间设有金标沙门氏菌抗体层(5)，在检测层(8)上 包被有检测线(7)和控制线(6)。
4.如权利要求2所述的沙门氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于制备金 标抗体层( 和检测层(8)的控制线(6)、检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合沙门 氏菌金标测试条和检测卡(1)。
5.如权利要求4所述的沙门氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的 金标抗体层(5)的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为0. 004 0. 012%的 氯金酸中加入其体积的1. 2 2%、浓度为1 3%的柠檬酸三钠，煮沸10 20分钟，可得 到15 50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗沙门氏菌单克隆抗体，在胶体金溶液中用 0. an碳酸钾溶液调pH7. 8 8. 8，按1 6mg/100ml加入抗沙门氏菌单克隆抗体，搅拌后，再 在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4°C静置2_4小时；iii将上述胶体金溶 液经2000转/分钟离心10 15分钟，弃沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟 离心60 80分钟离心得沉淀物；ν将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris_HCI 缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6%的动物血清蛋白和0. 01-0. 06%叠氮钠；vi 将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37°C干燥过滤形成金标抗 体层。
6.如权利要求4或5所述的沙门氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所 述胶体金标记抗体为羊或兔抗沙门氏菌抗体或沙门氏菌单克隆抗体。
7.如权利要求4所述的沙门氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的 检测层(8)是在纤维素膜上设有羊或兔沙门氏菌抗体或沙门氏菌单克隆抗体构成的检测 线⑵和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线(6)。
8.如权利要求7所述的沙门氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的 固定剂为甲醛或丙酮。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测沙门氏菌的方法，以及用于该方法的金标快速诊断试剂盒和其制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的抗沙门氏菌抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗沙门氏菌抗体形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有沙门氏菌，则在检测载体上形成检测线和控制线双线，结果判定为阳性；仅控制线显色，结果判定为阴性。该试剂盒由检测卡组成，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内，检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标沙门氏菌抗体层，在检测层上包被有由抗沙门氏菌单抗形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。
文档编号G01N33/531GK102135539SQ20101027288
公开日2011年7月27日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者周海飞, 张远兴, 李克生, 李志远, 杜惠芬, 郑悦, 马国荣 申请人:李克生