专利名称：氯离子含量测定方法及氯离子诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及样品中氯离子含量的测定方法，以及测定氯离子含量的诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
体液中氯元素以离子形式存在，几乎与钠离子平衡增减，测定氯离子的含量在临床和分析领域有着非常重要的意义。
现有技术中，测定氯离子含量的方法主要有化学测定法——硝酸汞滴定法、硫氰酸汞比色法，电量分析法和离子选择电极法。销酸汞滴定法需要熟练操作，判断滴定终点比较困难，因不同样本的蛋白质含量不等，其终点的深浅和强度变化不定，且受胆红素、血红蛋白和血脂的干扰，因而这种方法的精密度明显不佳，而且工作效率低。硫氰酸汞比色法在测定时血清等样品中的其它元素，如F、Br和I，也可以起反应，只是因其量少于1mmol/l忽略不计而已，但涉及某些药物和胆红素时影响较大。这种比色法消除了人的主观因素的影响，并可在自动生化分析仪进行批量测定，因而是临床上常用的一种方法。
电量分析法属于物理学方法，其原理是在恒定的电流下，以银电极置于标本中，从电极释放的Ag+与Cl-反应，开始阶段生成不解离的AgCl沉淀，当Cl-全部与Ag+作用完毕，游离的Ag+出现，其溶液电导明显增加，设计传感器和计时器，使溶液电导增加时立即切断电流，根据滴定所用时间和电流强度，计算样品中Cl-含量。该法简便、快速，在控制好电流的条件下是种较好的测定方法，标本中Br-和I-对测定结果有一定干扰，因量很少，可忽略不计。
离子选择电极法是目前测定氯离子含量的最好方法。因为测定氯离子的电极均与K+、Na+电极配套，仅需100μl全血即可测出标本中K+、Na+和Cl-的含量。该方法快速、准确，操作简便，是目前广为临床使用的方法。但氯离子电极寿命较短，一般有效期仅4～6个月，而且不同型号的仪器测定结果有一定误差。
近年来，酶法检测技术得到长足发展。该方法以其特异性高、稳定性好、检测速度快、结果准确可靠等优点而受到普遍欢迎。与检测其它物质类似，酶法检测血清、血浆等各种样品中氯离子含量的技术，已经成为人们研究的一个方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法测定氯离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的氯离子诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪进行氯离子含量测定，而且测定速度快、准确度高，为在医学检测领域推广酶法检测氯离子含量技术、取代现有氯离子检测方法提供技术支撑。
为实现本发明的目的之一，一种测定氯离子含量的方法，采用以下步骤进行首先，将需要测定的样品与含有“失活的α-淀粉酶”、“众聚葡萄糖——(葡萄糖)n”、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶以及还原型色原体组合的试剂混匀，使之发生以下反应①样品中的氯离子激活“失活的α-淀粉酶”，②“得活的α-淀粉酶”水解“众聚葡萄糖——(葡萄糖)n”生成多个“寡聚葡萄糖——(葡萄糖)m”，③“寡聚葡萄糖——(葡萄糖)m”在葡萄糖苷酶作用下水解成葡萄糖，④葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下氧化成葡糖酸内酯和过氧化氢，⑤过氧化氢与过氧化物酶、还原型色原体组合发生反应，生成吲嗒胺色原或醌亚胺色原和水，
上述反应过程用原理性反应式表示即为
其中，m为1、2或3{m等1时，(葡萄糖)m不参与上述第③步反应}，n为大于或等于4的自然数；然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长400～600nm的吸光度的上升速度，进而测算出样品中氯离子的含量。
上述测定氯离子含量的方法中，所述“还原型色原体组合”是由还原型色原体A与另外一种组分B构成。具体为还原型色原体A为“3-甲基-2-苯噻唑酮腙”(英文简称MBTH，全称是3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone)或者“4-氨基抗砒呍”(英文全称是4-aminoantipyrine)；另外一种组分B为以下15种物质之一①石碳酸(phenol)，②N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine，简称ESPAS)，③N，N-双乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)，④2，4-双氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)，⑤2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid，简称TBHB)，⑥3，5-双氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)，⑦3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid，简称DHBS)，⑧N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium，简称TOOS)，⑨仨溴羟基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)，⑩双甲基苯胺(Dimethylaniline，简称DMA)，(11)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(简称EHSPT，全称为N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine)，(12)2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2，2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，简称ABTS)，(13)2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)，英文名称为2，2′-azino-bis-(3-ethylbenztbiozoline-6-sulfonic acid)，(14)4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoicacid)，简称HMB)，(15)3-甲基-乙基-羟基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline，简称MEHA)。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在500～700nm以上。
实现本发明另外一个目的——氯离子诊断试剂盒，可以是由以下成分组成的单剂缓冲液 40～200mmol/l，(葡萄糖)n 1～30mmol/l，失活的α-淀粉酶500～50000U/l，
葡萄糖苷酶 500～50000U/l，葡萄糖氧化酶 500～50000U/l，过氧化物酶 500～50000U/l，还原型色原体组合 0.1～20mmol/l，稳定剂/试剂总体积10～80％。
其中“还原型色原体组合”的含义如前所述，两种组分A和B的浓度均为0.1～20mmol/l。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源葡萄糖污染，比如 其中，还原型色原体组合(一)可以是3-甲基-2-苯噻唑酮腙或者4-氨基抗砒呍；还原型色原体组合(二)可以是前述15种物质之一。
双剂的配方不仅仅限于上述配方，还原型色原体组合(一)和(二)可以互换位置，而且，试剂I中的成分——失活的α-淀粉酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶等，可以放在试剂II，试剂II中的成分——(葡萄糖)n也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不一一列举。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源葡萄糖污染，还有利于试剂更稳定。比如 与双剂类似，三剂中还原型色原体组合(一)可以是3-甲基-2-苯噻唑酮腙或者4-氨基抗砒呍，组合(二)可以是前述15种物质之一。
三剂的配方也不仅仅限于上述配方，还原型色原体组合(一)和(二)可以分开来放在试剂I、II或III的任何位置，试剂II中的成分——失活的α-淀粉酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶等，可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的成分——(葡萄糖)n，也可以放在试剂I或者试剂II当中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
本发明测定氯离子含量的诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“磷酸氢二钠～柠檬酸缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”或者“磷酸(Phosphate)缓冲液”中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受这些列举所限制。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇或者丁二酸盐中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液 80～120mmol/l，(葡萄糖)n 10～20mmol/l，失活的α-淀粉酶10000～40000U/l，葡萄糖苷酶 5000～10000U/l，葡萄糖氧化酶 20000～30000U/l，过氧化物酶 20000～40000U/l，还原型色原体组合 0.1～10mmol/l，稳定剂/试剂总体积 20～50％。
本发明利用氯离子激活已经失去活性的α-淀粉酶，使之重获活性之后将众聚葡萄糖水解成寡聚葡萄糖，寡聚葡萄糖在葡萄糖苷酶的作用下进一步水解成葡萄糖单糖，再偶联葡萄糖氧化酶反应生成葡糖酸内酯和过氧化氢，过氧化氢与过氧化物酶再发生酶偶联反应的同时，将无色的还原型色原体(Chromogen)组合系统氧化成有颜色的醌亚胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料。由于不同染料在400～600nm范围内的吸收波长不同，染料含量与吸光度之间有很好的定量对应关系，因此，测量反应期间的吸光度变化，便能很好地反映出被测样品中氯离子的含量。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原或者吲嗒胺色原染料，定量反映出被测样品中氯离子的含量，测试结果准确；(2)参与酶偶联反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于推广应用，可望在临床和化学分析中取代其它方法成为常规分析方法；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中氯离子的含量；(6)本发明提供的液态氯离子含量诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种酶的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制氯离子诊断试剂盒双甘氨肽缓冲液80mmol/l，(葡萄糖)n 10mmol/l，失活的α-淀粉酶 10000U/l，葡萄糖苷酶5000U/l，葡萄糖氧化酶 20000U/l，过氧化物酶20000U/l，4-氨基抗砒呍 2mmol/l，石碳酸10mmol/l，乙二醇50％(占试剂总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长495～505nm、测试副波长600nm以上，被测氯离子样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(吸光度上升，下同)。
加入样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录495～505nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中氯离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制氯离子诊断试剂盒试剂I——柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液 100mmol/l，失活的α-淀粉酶 25000U/l，
葡萄糖苷酶 7500U/l，葡萄糖氧化酶25000U/l，过氧化物酶 30000U/l，4-氨基抗砒呍1mmol/l，甘油50％(占试剂I总体积)；试剂II——柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液 100mmol/l，(葡萄糖)n 15mmol/l，2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 1mmol/l，乙二醇 20mmol/l。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长546nm、测试副波长630nm以上，被测氯离子样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录546nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中氯离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制氯离子诊断试剂盒试剂I——甘氨酸～氢氧化钠缓冲液 120mmol/l，失活的α-淀粉酶 40000U/l，3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2mmol/l，丙二醇 50％(占试剂I总体积)；试剂II——
甘氨酸～氢氧化钠缓冲液 120mmol/l，葡萄糖苷酶 10000U/l，葡萄糖氧化酶30000U/l，过氧化物酶 40000U/l，丙二醇 50％(占试剂II总体积)；试剂III——甘氨酸～氢氧化钠缓冲液 120mmol/l，(葡萄糖)n 20mmol/l，双甲基苯胺 2mmol/l，乙二醇 20mmol/l。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长578nm、测试副波长700nm以上，被测样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为正反应。
先加入样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录578nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中氯离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例四(双剂优选例)按以下成分和用量配制氯离子诊断试剂盒试剂I——磷酸氢二钠～柠檬酸缓冲液 100mmol/l，葡萄糖苷酶 10000U/I，葡萄糖氧化酶 20000U/l，过氧化物酶 20000U/l，
4-氨基抗砒呍1mmol/l，甘油50％(占试剂I总体积)；试剂II——磷酸氢二钠～柠檬酸缓冲液100mmol/l，失活的α-淀粉酶 20000U/l，(葡萄糖)n 10mmol/l，双甲基苯胺 2mmol/l，甘油50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度30℃、反应时间10分钟、测试主波长578nm、测试副波长700nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应
检测、记录578nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中氯离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
本发明的显著特色是可以消除内、外源葡萄糖的污染。消除内、外源葡萄糖的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间内受污染的内、外源葡萄糖已经被消耗殆�。蟀攵问奔洳馐月壤胱雍克枰钠咸烟嵌际窃醋匝分新壤胱拥淖饔谩�
总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出血浆、血清等各种样品中的氯离子含量，检测速度快、灵敏度高、精确性好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的氯离子诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中氯离子的含量。
权利要求
1.一种测定氯离子含量的方法，包括以下步骤(1)将待测样品与含有“失活的α-淀粉酶”、“众聚葡萄糖——(葡萄糖)n”、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶以及还原型色原体组合的试剂混匀，使之发生以下反应①样品中的氯离子激活“失活的α-淀粉酶”，②“得活的α-淀粉酶”水解“众聚葡萄糖——(葡萄糖)n”生成多个“寡聚葡萄糖——(葡萄糖)m”，③“寡聚葡萄糖——(葡萄糖)m”在葡萄糖苷酶作用下水解成葡萄糖，④葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下氧化成葡糖酸内酯和过氧化氢，⑤过氧化氢与过氧化物酶、还原型色原体组合发生反应，生成吲嗒胺色原或醌亚胺色原和水，上述反应过程用原理性反应式表示即为其中，m为1、2或3，n为大于或等于4的自然数；(2)将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长400～600nm的吸光度的上升速度，测算出样品中氯离子的含量。
2.根据权利要求1所述的测定氯离子含量的方法，其特征在于所述“还原型色原体组合”是由还原型色原体A与另外一种组分B构成，还原型色原体A为“3-甲基-2-苯噻唑酮腙”或者“4-氨基抗砒呍”，另外一种组分B为以下15种物质之一石碳酸，N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺，N，N-双乙基-m-甲苯胺，2，4-双氯石碳酸，2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸，3，5-双氯石碳酸磺酸，3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸，N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐，仨溴羟基苯甲酸，双甲基苯胺，N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺，2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，3-甲基-乙基-羟基苯胺。
3.根据权利要求1或2所述的测定氯离子含量的方法，其特征在于待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。
4.根据权利要求1或2所述的测定氯离子含量的方法，其特征在于反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在500～700nm以上。
5.一种氯离子诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 40～200mmol/l，(葡萄糖)n 1～30mmol/l，失活的α-淀粉酶 500～50000U/l，葡萄糖苷酶 500～50000U/l，葡萄糖氧化酶500～50000U/l，过氧化物酶 500～50000U/l，还原型色原体组合0.1～20mmol/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
6.根据权利要求5所述的氯离子诊断试剂盒，其特征在于所述“还原型色原体组合”是由还原型色原体A与另外一种组分B构成，A和B的浓度均为0.1～20mmol/l还原型色原体A为“3-甲基-2-苯噻唑酮腙”或者“4-氨基抗砒呍”；另外一种组分B为以下15种物质之一石碳酸，N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺，N，N-双乙基-m-甲苯胺，2，4-双氯石碳酸，2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸，3，5-双氯石碳酸磺酸，3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸，N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐，仨溴羟基苯甲酸，双甲基苯胺，N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺，2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)，4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，3-甲基-乙基-羟基苯胺。
7.根据权利要求5或6所述的氯离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。
8.根据权利要求7所述的氯离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液是“磷酸氢二钠～柠檬酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”或者“磷酸缓冲液”中的至少一种。
9.根据权利要求5或6所述的氯离子诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇或者丁二酸盐中的至少一种。
10.权利要求5～9中任意一种氯离子诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
全文摘要
本发明涉及氯离子含量的测定方法及其诊断试剂盒。利用氯离子激活已经失活的α－淀粉酶将众聚葡萄糖水解成寡聚葡萄糖，再偶联葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化物酶反应，将无色的还原型色原体组合系统氧化成有颜色的醌亚胺色原或吲嗒胺色原染料，通过检测反应期间主波长400～600nm吸光度的变化，定量反映出样品中氯离子的含量。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于推广应用。
文档编号G01N21/31GK1786693SQ20041006618
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司
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