专利名称：Dna的定量或检测方法
技术领域：
本发明涉及样本中所含的具有目标DNA区域的DNA的定量或检测方法等。
背景技术：
作为样本中所含的具有目标DNA区域的DNA的定量或检测方法，例如，已知抽提出样本中所含的生物来源的基因组DNA后，通过利用DNA聚合酶的DNA合成的链式反应 (Polymerase Chain Reaction ；以下有时也记作PCR)对DNA进行扩增而进行检测的方法； 使荧光标记的寡核苷酸与生物来源样本中的DNA所具有的目标DNA区域杂交而进行检测的方法等(例如，参见 J. Cataract. Refract. Surg.，2007 ；33 (4) :635_641、Environ. Mol. Mutagen.，1991 ； 18 (4) :259_262)。
发明内容
本发明的目的在于，提供简便地对样本中所含的具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的方法。
本发明提供以下的发明。
[发明1] 一种DNA的定量或检测方法(以下，有时记作本发明的方法)，所述DNA为样本中所含的具有目标DNA区域的DNA，其特征在于，包括如下步骤 (1)第一步骤，制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有目标DNA 区域的DNA ； (2)第二步骤，将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸和与该被测寡核苷酸互补结合且具有多种识别功能的检测寡核苷酸混合，形成含有该被测寡核苷酸与该检测寡核苷酸的检测复合物，并使该检测复合物固定在支撑体上；和 (3)第三步骤，利用检测寡核苷酸的识别功能对第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
[发明2] 如发明1所述的方法，其中，具有多种识别功能的检测寡核苷酸是由多个寡核苷酸互补结合而成的复合检测寡核苷酸、或含有具有多个甲基化位点的甲基化寡核苷酸的复合检测寡核苷酸。
[发明3] 如发明2所述的方法，其中，复合检测寡核苷酸含有具有甲基化DNA的寡核苷酸。
[发明4] 如发明2或3所述的方法，其中，复合检测寡核苷酸的识别功能为所结合的甲基化 DNA抗体的识别功能。
[发明5] 如发明3或4所述的方法，其中，甲基化DNA为5_甲基胞嘧啶。
[发明6] 如发明4或5所述的方法，其中，甲基化DNA抗体为甲基胞嘧啶抗体。
[发明7] 如发明1 6中任一项所述的方法，其中，样本为下述任何一种生物来源样本 (a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液或组织裂解液、 (b)从由哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液和组织裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的DNA、 (c)以从由哺乳动物来源的组织、细胞、组织裂解液和细胞裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的RNA为模板制作的DNA、 (d)从细菌、真菌或病毒中抽提的DNA、或 (e)以从细菌、真菌或病毒中抽提的RNA为模板制作的DNA。
[发明8] 一种样本的标记方法，其中，使用发明2 7中任一项所述的方法中所用的复合检测寡核苷酸。
[发明9] 一种样本的标记方法，其中，使用发明2 7中任一项所述的方法中所用的复合检测寡核苷酸和能够标记该复合检测寡核苷酸的试剂。
[发明10] 如发明8或9所述的方法，其中，标记对象为DNA或蛋白质。
[发明11] 如发明1 10中任一项所述的方法，其中，第二步骤中，通过不妨碍被测寡核苷酸与检测寡核苷酸的结合且能够与该被测寡核苷酸互补结合的特定寡核苷酸，使检测复合物与支撑体结合。
[发明12] 如发明1 11中任一项所述的方法，其中，具有目标DNA区域的DNA为下述任意一种具有目标DNA区域的DNA (a)预先用不以目标DNA区域作为识别切割位点的限制性内切酶进行消化处理后得到的DNA、 (b)预先进行纯化后得到的具有目标DNA区域的DNA、 (c)血液中的具有目标DNA区域的游离DNA、 (d)微生物基因组来源的具有目标DNA区域的DNA、或 (e)利用逆转录酶从RNA生成的具有目标DNA区域的DNA。
[发明13] 一种DNA的定量或检测方法，所述DNA为样本中所含的具有目标DNA区域的DNA， 其特征在于，包括如下步骤 (1)第一步骤，制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有目标DNA 区域的DNA ； (2)第二步骤，将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸和与该被测寡核苷酸互补结合且含有甲基化寡核苷酸的检测寡核苷酸混合，形成含有该被测寡核苷酸与该检测寡核苷酸的检测复合物，并使该检测复合物固定在支撑体上；和 (3)第三步骤，利用检测寡核苷酸的识别功能对第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
[发明 14] 如发明13所述的方法，其特征在于，识别功能使用甲基化DNA抗体、甲基胞嘧啶抗体。
图1是表示实施例1中实施对照1处理(使用5’末端FITC化寡核苷酸)、对照2 处理(使用3’末端FLC化寡核苷酸)、X处理(使用甲基化寡核苷酸Ml)和Y处理(使用甲基化寡核苷酸M12)，对被测寡核苷酸进行检测的实验的实施结果的图。图中，B表示对被测寡核苷酸浓度为0. 001pmol/10 μ L TE缓冲液的溶液测定吸光度所得到的值。C表示对被测寡核苷酸浓度为0. Olpmol DNA/10 μ L TE缓冲液的溶液测定吸光度所得到的值。
图2是表示实施例2中实施X处理(使用甲基化寡核苷酸Ml)和Y处理(使用甲基化寡核苷酸M12)，对被测寡核苷酸进行检测的实验的实施结果的图。图中，B表示对被测寡核苷酸浓度为0. 0001pmol/10 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C表示对被测寡核苷酸浓度为0. 001pmol/10 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D表示对被测寡核苷酸浓度为0. Olpmol/lO μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。
图3是表示实施例3中实施处理法1 (仅使用第1寡核苷酸)、处理法2 (使用第 1寡核苷酸和第2寡核苷酸)和处理法3 (使用第1寡核苷酸、第2寡核苷酸和第3寡核苷酸)，对被测寡核苷酸进行检测的实验的实施结果的图。图中，B表示对被测寡核苷酸浓度为0. 003pmol/10 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C表示对被测寡核苷酸浓度为O.Olpmol/lOyL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D表示对被测寡核苷酸浓度为0. 03pmol/10 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。
图4是表示实施例4中实施处理法1 (使用第1寡核苷酸和第2、1寡核苷酸)、处理法2 (使用第1寡核苷酸和第2、2寡核苷酸)和处理法3 (使用第1寡核苷酸、第2、1寡核苷酸和第2、2寡核苷酸)，对被测寡核苷酸进行检测的实验的实施结果的图。图中，B表示对被测寡核苷酸浓度为0.003pmol/10yL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C 表示对被测寡核苷酸浓度为0. ΟΙρπιοΙ/ΙΟμ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D 表示对被测寡核苷酸浓度为0. 03pmol/10 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。
图5是表示实施例5中实施处理法1 (使用第1寡核苷酸)和处理法2 (使用第1 寡核苷酸和第2寡核苷酸)，对被测寡核苷酸进行检测的实验的实施结果的图。图中，B表示对被测寡核苷酸浓度为0.003pmol/10yL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C 表示对被测寡核苷酸浓度为0. ΟΙρπιοΙ/ΙΟμ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D 表示对被测寡核苷酸浓度为0. 03pmol/10 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细说明。
本发明方法的第一步骤的“制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有目标DNA区域的DNA”，是指制备具有目标DNA区域的DNA作为DNA试样。
作为本发明方法中的“样本”，可以列举例如食品、河流、土壤、一般市售制品的表面附着物等，这样的样本中可能含有真菌、细菌、病毒等的混入微生物或核酸。
食品中有无食物中毒菌的检查和病原菌的确定是很重要的，通常使用利用微生物表面抗原的免疫法。但是，免疫法中为制作抗原需要大量的劳动，而且需要确定病原菌。即， 微生物检查时的免疫法利用的是微生物种类的特异性，因此难以通过一次检查将多种菌种总括在一起检查其有无，而且，对于免疫法无法成立的微生物，要使用PCR法等，因而检查中需要大量的劳动。本发明的方法能够提供一种检查方法，首先，即使在难以用免疫法进行检查的情况下，利用基因也能够使检查方法成立，其次，能够同时检测多种微生物。即，本发明方法能够用于非生物来源样本中存在的真菌类、微生物类、病毒等的检查。另外，通过使用本发明，能够检测例如食品中的混入微生物或病毒，从而可望用于感染症的检查或食品污染检查等。
作为样本，还可以列举(a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液或组织裂解液；(b)从由哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液和组织裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的DNA ； (c)以从由哺乳动物来源的组织、细胞、 组织裂解液和细胞裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的RNA为模板制作的DNA ； (d) 从细菌、真菌或病毒中抽提的DNA ； (e)以从细菌、真菌或病毒中抽提的RNA为模板制作的 DNA ；等。另外，所述组织表示包括血液、淋巴结等在内的广义的含义，作为所述体液可以列举血浆、血清、淋巴液等，作为所述体分泌物可以列举尿、乳汁等。
作为样本中所含的DNA，可以列举从所述生物试样或所述混入微生物中抽提得到的基因组DNA、来自基因组DNA的DNA片段或RNA等。另外，在哺乳动物来源的样本为人的血液、体液或体分泌物等的情况下，可以利用人的定期体检的临床检查等中采集的样本。在使用血液作为样本的情况下，根据通常的方法由血液制备血浆或血清，以制得的血浆或血清为样本，分析其中所含的游离DNA (含有胃癌细胞等癌细胞来源的DNA)时，能够避开血细胞来源的DNA而对胃癌细胞等癌细胞来源的DNA进行分析，从而能够提高胃癌细胞等癌细胞以及含有癌细胞的组织等的检测灵敏度。
从哺乳动物来源的样本中获得基因组DNA时，使用例如市售的DNA抽提用试剂盒等即可。另外，从RNA获得DNA时，使用市售的cDNA制作试剂盒等利用逆转录酶从RNA合成DNA的试剂盒即可。另外，本发明的方法中，作为样本，也可以是人工合成的DNA。
本发明方法中的“哺乳动物”是指分类为动物界-脊索动物门-脊椎动物亚门哺乳纲(Mammalia)的动物，具体而言，可以列举人、猿、狨猴、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、山羊、狗、 猫等。
本发明中的“体液”是指构成个体的细胞间存在的液体，可以列举血浆和间质液， 多数情况下，发挥维持个体的稳态的功能。更具体而言，可以列举淋巴液、组织液(组织间液、细胞间液、间质液)、体腔液、浆膜腔液、胸水、腹水、心包液、脑脊液(脊髓液)、关节液 (滑液)、眼房水(房水)、脑脊液等。
本发明中的“体分泌液”是指由外分泌腺分泌的分泌液。具体而言，可以列举唾液、胃液、胆汁、胰液、肠液、汗液、泪液、鼻涕、精液、阴道液、羊水、乳汁等。
本发明中的“细胞裂解液”是指通过将例如在细胞培养用的IOcm培养皿等中培养的细胞、即细胞株、原代培养细胞、血细胞等破坏而得到的含有细胞内液的裂解液。作为破坏细胞膜的方法，可以列举使用超声波的方法、使用表面活性剂的方法、使用碱性溶液的方法等。另外，将细胞裂解时，也可以使用各种试剂盒等。例如具体而言，在IOcm培养皿中将细胞培养至铺满后，弃去培养液，在IOcm培养皿中加入0. 6mL的RIPA缓冲液(lx TBS, 1% 诺纳德P-40,0. 5%脱氧胆酸钠，0. 1% SDS,0. 004%叠氮化钠)。在4°C将培养皿缓慢振摇 15分钟后，用细胞刮等将IOcm培养皿上的贴壁细胞剥落下来，并将培养皿上的裂解液转移到微量离心管中。添加裂解液的1/10容量的lOmg/mL PMSF后，在冰上放置30 60分钟。 在4°C以IOOOOXg离心10分钟，取上清作为细胞裂解液。
本发明中的“组织裂解液”是指通过将采自哺乳动物等动物的组织中的细胞破坏而取得的含有细胞内液的裂解液。
更具体而言，将取自动物的组织测定重量后，使用剃须刀片等将组织裁切为小片。 将冷冻组织切片时，需要切成更小的小片。裁切后，以每Ig组织为3mL的比率添加冰冷却的RIPA缓冲液(可以添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等，例如可以添加RIPA缓冲液的 1/10容量的lOmg/mLPMSF)，并在4°C下勻浆化。勻浆化使用超声波仪或加压型细胞破碎装置。勻浆化的作业中，溶液恒定维持于4°C，以抑制发热。将勻浆液转移到微量离心管中，在 40C以10000 X g离心10分钟，取上清作为组织裂解液。
第一步骤是制备含有被测寡核苷酸的样本的步骤，所述被测寡核苷酸为具有目标 DNA区域的DNA。
本发明方法中的“被测寡核苷酸”是指包含目标DNA区域的寡核苷酸。另外，被测寡核苷酸可以是包含目标区域的DNA，也可以是包含目标区域的RNA。具体而言，可以列举基因组DNA中的目标DNA区域、目标RNA(可以是一部分)或以RNA为模板制作的DNA(可以是一部分)、或者含有它们的DNA片段、RNA片段。另外，本发明方法中的被测寡核苷酸可以是人工合成的寡核苷酸。
本发明中，例如，在被测寡核苷酸为从细菌、真菌或病毒中抽提的DNA、从细菌、真菌或病毒中抽提的RNA或以RNA为模板而制作的DNA、以及具有上述DNA、RNA的部分序列的寡核苷酸的情况下，被测寡核苷酸的检测是对能够推测导致食品中的微生物污染或感染症的微生物或病毒的有无及其种类的指标进行定量或检测。另外，例如，在被测寡核苷酸表示血液中的游离DNA及具有其部分序列的寡核苷酸的情况下，被测寡核苷酸的检测是通过血液中的游离DNA的定量对能够推测癌症的进展程度的指标进行定量或检测。另外，在被测寡核苷酸表示从组织、组织裂解液、细胞裂解液或组织裂解液中抽提的DNA或RNA、或者以该RNA为模板而制作的DNA、以及具有上述DNA或RNA的部分序列的寡核苷酸的情况下，被测寡核苷酸的检测是对在细胞中起作用的RNA的量进行定量，从而对能够推测与RNA的功能相关的细胞的功能或性质、状态的指标进行定量或检测。例如，如果从组织裂解液中检测到微生物或病毒来源的RNA或DNA，则能够推测组织受到微生物或病毒的感染。例如，对于癌症而言，已知血液中的来自基因组DNA的游离DNA会增加，通过定量或检测血中游离DNA， 可以作为能够推测癌症的进展情况(程度)的指标。此时，作为被测寡核苷酸，优选血液中的来自基因组DNA的游离DNA或该游离DNA中所含的含有目标DNA区域的寡核苷酸、以及具有上述两者的部分序列的寡核苷酸的任意一种。
第一步骤中的“制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有目标DNA区域的DNA”，也包括获取含有要检测的目标DNA区域的DNA试样作为被测寡核苷酸的情况。 例如，在要检测RNA上的碱基序列的情况下，获取以该RNA为模板利用逆转录酶而合成的 DNA,作为含有该RNA上的要检测的碱基序列的互补碱基序列作为目标DNA区域的被测寡核苷酸。另外，在要检测RNA的情况下，“从样本中获取作为具有目标区域的RNA的被测寡核苷酸”是指，获取含有要检测的目标RNA区域的RNA试样作为被测寡核苷酸。
在第一步骤中获得的被测寡核苷酸为DNA的情况下，可以预先用不以该被测寡核苷酸所具有的目标区域作为识别切割位点的限制性内切酶进行消化处理，或者也可以包含在预先纯化得到的DNA试样中。另外，作为第一步骤中获得的DNA，可以列举血液中的游离 DNA、微生物基因组来源的DNA、利用逆转录酶从样本中的RNA制作的DNA等。另外，“具有目标DNA区域的DNA”也可以是合成的DNA。另外，第一步骤中获得的被测寡核苷酸，作为 RNA，可以列举组织裂解液、细胞裂解液的游离RNA、纯化的RNA、从微生物获得的RNA等。
第一步骤中，获取包含目标区域的碱基序列的基因组DNA时，在样本为哺乳动物来源的情况下，使用例如市售的DNA抽提用试剂盒(Genfind v2试剂盒(Beckman Coulter 公司制)、FastPure DNA试剂盒(Takara bio公司制))等抽提DNA即可。或者，在样本为真菌等微生物的情况下，使用如Methods in Yeast Genetics (酵母遗传学方法实验指南) (冷泉港实验室出版社)中记载的、一般的酵母基因组的制备方法等即可，在样本为大肠菌等原核生物的情况下，使用如Molecular Cloning-Α Laboratory Manual-(分子克隆实验指南)(冷泉港实验室出版社)中记载的一般的微生物基因组制备方法等即可。
另外，在要从哺乳类来源的组织或细胞株等样本中获取RNA的情况下，可以使用市售的 RNA 抽提用试剂盒(IS0GEN(311-02501) (NIPPON GENE 公司制)、或者 FastRNA Pro Green试剂盒(Funakoshi 公司制)、FastRNA Pro Blue 试剂盒(Funakoshi 公司制)、FastRNA Pro Red试剂盒(Funakoshi公司制)等)从组织、细胞株等中抽提RNA。以RNA为模板合成 DNA时，使用逆转录酶即可，可以使用市售的试剂盒(Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒、Roche Diagnostics公司制)。另外，也可以抽提病毒粒子后再抽提病毒的DNA。另外， 也可以使用市售的试剂盒(QuickGene RNA组织试剂盒S II、富士胶片公司制)等抽提病毒基因组。或者，可以从病毒感染的组织中抽提RNA后利用逆转录酶获取病毒来源的DNA，也可以从病毒感染的组织中获取DNA。
另外，在样本为食品的情况下，可以从食品中分离出微生物等后获取DNA，也可以同时获取食品中所含的微生物以外的例如病毒等的基因组DNA与微生物来源的基因组 DNA。
另外，在样本为哺乳动物来源的组织、目标DNA区域为病毒来源的DNA的情况下，可以使用市售的RNA抽提用试剂盒(IS0GEN(311-02501)NIPPON GENE公司制)、或者 FastRNA Pro Green 试剂盒(Funakoshi 公司制)、FastRNA Pro Blue 试剂盒(Funakoshi 公司制)、FastRNAPro Red试剂盒(Funakoshi公司制)等从组织中抽提RNA，再利用逆转录酶获取DNA。另外，在样本为哺乳动物来源的样本的情况下，可以抽提病毒粒子后抽提病毒的DNA，或者也可以抽提病毒粒子后使用市售的试剂盒(QuickGene RNA组织试剂盒S II、 富士胶片公司制)等抽提病毒RNA，再利用逆转录酶获取病毒来源的DNA。可以从病毒感染的组织中抽提RNA后利用逆转录酶获取病毒来源的DNA，也可以从病毒感染的组织中获取 DNA而获取病毒来源的DNA。另外，在利用逆转录酶由RNA获取DNA的情况下，可以使用市售的试剂盒CTranscriptor高保真cDNA合成试剂盒、Roche Diagnostics公司制)等。
本发明中的“目标DNA区域”(以下有时也记作目标区域)是指，样本中所含的DNA 中想要通过本发明检测或定量的DNA区域。样本为DNA的情况下的目标DNA区域是指DNA 的碱基序列上的规定的碱基序列，在样本为RNA的情况下，是指利用逆转录酶从RNA制作的 DNA上的碱基序列，是RNA上的作为检测或定量对象的规定碱基序列的互补碱基序列。“具有目标DNA区域的DNA”，可以是预先用在该DNA所具有的目标DNA区域内的碱基序列处不具有识别切割位点的限制性内切酶进行消化处理后得到的DNA，或者也可以是预先纯化后得到的DNA试样、血液中的游离DNA、微生物基因组来源的DNA、利用逆转录酶从样本中的 RNA合成的DNA等。
“目标DNA区域”可以是在基因组中可见到多个的碱基序列(以下，有时也记作重复序列)，如果是作为疾病指标的碱基序列则更好。例如，对于癌症而言，已知血液中的来自基因组DNA的游离DNA会增加，此时，被测寡核苷酸可以列举具有血液中的游离DNA中的重复序列或其部分序列的寡核苷酸。这些具有重复序列或其部分序列的寡核苷酸的定量值， 可以作为表示癌症进展程度的指标。另外，重复序列如后所述，可以是简单重复序列(称为串联重复序列，tandem r印eat)、散在重复序列、重复基因或假基因等 本发明中的“目标RNA区域”的一种情况是指，生物细胞中的RNA上的要检测的碱基序列。作为生物来源样本中所含的“具有目标RNA区域的RNA”，可以列举从样本中抽提的RNA，具体而言，可以列举核糖体RNA、信使RNA、转运RNA以及小RNA等。RNA不仅包括由 RNA聚合酶从宿主的基因组转录而来的RNA，也包括以RNA为基因组的病毒基因组等，只要是RNA即可。
本发明中的“目标DNA区域”可以是与疾病等相关的基因。例如，作为与癌症相关的基因，可以列举赖氨酰氧化酶、HRAS样抑制因子、bA305P22. 2. 1、γ细丝蛋白、HAND1、 RIKEN 2210016F16同源蛋白、FLJ32130、PPARG血管生成素相关蛋白、血栓调节蛋白、ρ53应答基因2、原纤蛋白2、神经丝蛋白3、去整合素-金属蛋白酶域23、G蛋白偶联受体7、G蛋白偶联生长抑素和血管紧张素样肽受体、溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2等有用蛋白质基因的启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)等。可以逐个对所述“目标DNA区域”中甲基化的DNA进行检测或定量，但是，例如如果能在一个检测系统中定量或检测更多的该“目标DNA区域”，则能够相应地提高定量精度和检测灵敏度。
具体而言，例如，在有用蛋白质基因为赖氨酰氧化酶基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的赖氨酰氧化酶基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举赖氨酰氧化酶基因的碱基序列(相当于Genbank 收录号AF270645所记载的碱基序列的碱基序号16001 18661所示的碱基序列)。该区域中，编码人来源的赖氨酰氧化酶蛋白质的氨基末端的蛋氨酸的ATG编码子如碱基序号 18031 18033所示，上述外显子1的碱基序列如碱基序号17958 18662所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为HRAS样抑制因子基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的HRAS样抑制因子基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举HRAS样抑制因子基因的碱基序列(相当于Genbank收录号AC068162所记载的碱基序列的碱基序号172001 173953所示的碱基序列)。该区域中，人来源的HRAS样抑制因子基因的外显子1的碱基序列如碱基序号 173744 173954 所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为bA305P22. 2. 1基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的bA305P22. 2. 1基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举bA305P22. 2. 1基因的碱基序列(相当于Genbank收录号AL121673所记载的碱基序列的碱基序号13001 13889所示的碱基序列)。该区域中，编码人来源的bA305P22. 2. 1蛋白质的氨基末端的蛋氨酸的ATG编码子如碱基序号13850 13852所示，上述外显子1的碱基序列如碱基序号13664 13890所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为Y细丝蛋白基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的Y细丝蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举γ细丝蛋白基因的碱基序列(相当于Genbank 收录号AC074373所记载的碱基序列的碱基序号63528 64390所示的碱基序列的互补序列)。该区域中，编码人来源的、细丝蛋白蛋白质的氨基末端的蛋氨酸的ATG编码子如碱基序号64101 64103所示，上述外显子1的碱基序列如碱基序号63991 64391所示。
另夕卜，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为HANDl基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的HANDl基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举HANDl基因的碱基序列(相当于Genbank收录号AC026688 所记载的碱基序列的碱基序号24303 26500所示的碱基序列的互补序列)。该区域中，编码人来源的HANDl蛋白质的氨基末端的蛋氨酸的ATG编码子如碱基序号25959 25961所示，上述外显子1的碱基序列如碱基序号25703 26501所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为RIKEN 2210016F16同源蛋白基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的RIKEN 2210016F16同源蛋白基因的外显子 1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举RIKEN 2210016F16同源蛋白基因的碱基序列(相当于Genbank收录号AL354733所记载的碱基序列的碱基序号157056 159000所示的碱基序列的互补碱基序列)。该区域中，人来源的 RIKEN 2210016F16同源蛋白蛋白质的外显子1的碱基序列如碱基序号158448 159001所不。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为FLJ32130基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列， 可以列举包含人来源的FLJ32130基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组 DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举FLJ32130基因的碱基序列(相当于Genbank收录号AC002310所记载的碱基序列的碱基序号1 2379所示的碱基序列的互补碱基序列)。 该区域中，编码人来源的FLJ32130蛋白质的氨基末端的蛋氨酸的ATG编码子如碱基序号 2136 2138所示，上述外显子1的碱基序列如碱基序号2136 2379所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为PPARG血管生成素相关蛋白基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上 CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的PPARG血管生成素相关蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举序列号8所示的碱基序列。该区域中，优选编码人来源的PPARG血管生成素相关蛋白蛋白质的氨基末端的蛋氨酸的ATG编码子的、含有5’侧约1200个碱基 2000个碱基的区域。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为血栓调节蛋白基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的血栓调节蛋白基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举血栓调节蛋白基因的碱基序列(相当于 Genbank收录号AF4卯471所记载的碱基序列的碱基序号1 6096所示的碱基序列)。该区域中，编码人来源的血栓调节蛋白蛋白质的氨基末端的蛋氨酸的ATG编码子如碱基序号 2590 2592所示，上述外显子1的碱基序列如碱基序号2048 6096所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为p53应答基因2基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的P53应答基因2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举p53应答基因2基因的碱基序列(相当于Genbank收录号AC009471所记载的碱基序列的碱基序号113501 116000所示的碱基序列的互补序列)。该区域中，人来源的P53应答基因2基因的外显子1的碱基序列如碱基序号114059 115309所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为原纤蛋白2基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的原纤蛋白2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举原纤蛋白2基因的碱基序列(相当于Genbank 收录号ACl 13387所记载的碱基序列的碱基序号118801 121000所示的碱基序列的互补序列)。该区域中，人来源的原纤蛋白2基因的外显子1的碱基序列如碱基序号119892 112146 所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为神经丝蛋白3基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的神经丝蛋白3基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举神经丝蛋白3基因的碱基序列(相当于 Genbank收录号AF106564所记载的碱基序列的碱基序号28001 30000所示的碱基序列的互补序列)。该区域中，人来源的神经丝蛋白3基因的外显子1的碱基序列如碱基序号 28615 29695 所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为去整合素-金属蛋白酶域23基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上 CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的去整合素-金属蛋白酶域23基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举去整合素-金属蛋白酶域23基因的碱基序列(相当于Genbank收录号AC009225所记载的碱基序列的碱基序号21001 23300所示的碱基序列)。该区域中，人来源的去整合素_金属蛋白酶域 23基因的外显子1的碱基序列如碱基序号22195 2沈31所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为G蛋白偶联受体7基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的G蛋白偶联受体7基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举G蛋白偶联受体7基因的碱基序列 (相当于Genbank收录号AC009800所记载的碱基序列的碱基序号75001 78000所示的碱基序列)。该区域中，人来源的G蛋白偶联受体7基因的外显子1的碱基序列如碱基序号 76667 77653 所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为G蛋白偶联生长抑素和血管紧张素样肽受体基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的G蛋白偶联生长抑素和血管紧张素样肽受体基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举G蛋白偶联生长抑素和血管紧张素样肽受体基因的碱基序列(相当于 Genbank收录号AC008971所记载的碱基序列的碱基序号57001 60000所示的碱基序列的互补序列)。该区域中，人来源的G蛋白偶联生长抑素和血管紧张素样肽受体基因的外显子 1的碱基序列如碱基序号57777 59633所示。
另外，具体而言，例如，在有用蛋白质基因为溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的情况下，作为其启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列中存在的含有一个以上CpG的碱基序列，可以列举包含人来源的溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的外显子1和位于其5’上游的启动子区域的基因组DNA的碱基序列，更具体而言，可以列举溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的碱基序列(相当于Genbank收录号AC026802所记载的碱基序列的碱基序号 78801 81000所示的碱基序列的互补序列)。该区域中，人来源的溶质载体家族6神经递质转运蛋白去甲肾上腺素成员2基因的外显子1的碱基序列如碱基序号80280 80605所
7J\ ο 作为“目标DNA区域”(以下，有时也记作目标区域)，可以列举包含由例如MLH1、 RUNX3、CDHl、TIMP3、CSPG, RARBU4-3-3 σ、CALCA, HICl、ESRl、PTEN、SOCSl、BLTl、ESR2、 MTMG, TWIST、INK4、CDKN2、GSTP, DCR2、TP73、PGR、HIC2、MTHFR, TFFU MLLT7、SLC5A8、 THBSl、S0CS2、ACTB, CDHl3, FGF18、GSTM3、HSD17B4、HSPA2、PPP1R13B、PTGS2、SYK, TERT, TITFl、BRACAl、AATF, ABCBl、ABCCl、ABI1、ABLl、AF1Q、AF3P21、AF4、AF9、AFF3、AKAP12、 AKAP9、ALEX3、ALK、ALOXl5、APAF1、APC、ARHA、ARHGAP26、ARHGEF12、ARNT、ATBFl、ATFl、 ATM、AXIN2、BCAS3、BCAS4、BCLl、BCL10、BCLl 1A、BCLlIB、BCL2、BCL5、BCL7A、BCR、BIRC3、 BMPRlA、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BUBIB、CAGE-1、CARS、CASC5、CCDC6、CCND2、CCND3、CDHl1、 CDKNlB, CDKN2A、CDX2、CEPl 10、CKNl、CLPl、CLTC, CLTCLl、CNC, COLlAl、C0X6C、CREBBP、 CXXC6、DAB2IP、DDIT3、DDX43、DIRCl、DIRC2、DKKl、E2F3、EEN、EGFR、ELL、EPS 15、ERBB2、 ERCl、ERCCl、ERCC4、ERG、ETVl、ETV6、EVI1、EffSRl、EXTl、EXT2、FANCA、FANCD2、FANCF、FAS、 FBP17、FCRL4、FEV、FGFRl、FHIT、FLI1、F0X03A、FUS、FVTl、GAS7、GLI1、GNAS、G0LGA5、GOPC、 GRB2、HCMOGT-1、HI ST1H41、HLF、HMGA2、HOXA13、HOXC11、HOXC13、HOXD13、HSPBAP1、HSPCB、HSPDl、HSPHl、IKZF2、INTS6、IRF4、JAGl、JAG2、JAK2、JARID1A、JAZFl、JMJD2C、JUN、KIT、 KITLG、KLF5、KLF6、LASPl、LDBl、LHFP, LMOl、LM02、LPHN2、LPP, LYLl、MADH4、MAF, MAFB, MDM2、MDS2、MET、MKL1、MLF1、MLH1、MLL、MLLT10、MMP2、MN1、MRE11B、MSF、MSH2、MSH6、MS 12、 MUCl、MUTYH、MXI1、MYC、MYH9、MYST3、NFl、NFKBl、NIN、NKX2-5、Ν0Ν0、NOTCHl、N-RAS、NTRK3、 NUMAl、NUP214、NUP98、0LIG2、P53、PALB2、PAX2、PAX5、PAX7、PAX9、PBXl、PCMl、PCSK7、PDGFB、 PDGFRA, PDGFRB, PH0X2B、PICALM、PLAG1、PLCBl、PLK、PML, PMSU POLH, P0U5F1P1、P0U6F2、 PPP1R13L、PRDM16、PRRX1、PSIP1、PTCH、RABEP1、RAD51L1、RAD53、RANBP17、RAP1⑶S1、RAP2B、 RARA, RASSFl、RBI、RBL2、RBMl5, RBM5、RCHYl、RECQL, RECQL5、RET、RUNX, RUNX1T1、SBDS, SDHC, SDHD, SET、SHH、SIL、SIX1、SNAI2、SPI1、SPINK7、STARD3、STAT3、STKl 1、STK4、SUFU, SYK, SYNP02、TBX2、TCF3、THBS2、THRAP3、TMPRSS2、TNF, TOPI、TPM4、TPR、TRIM24、TRIM33、 TRIPl 1、TSCl、TSC2、TSHR、TTL、VAV1、VHL、WFDC1、WTl、WffOX、XPC、ZBTB16、ZNF146、ZNF217 等符号表示的基因的启动子区域、非翻译区或翻译区(编码区)的碱基序列的DNA的区域等。本发明的方法中，可以逐个对这些目标DNA区域进行定量或检测，但若能在一个检测系统中定量或检测更多的这些目标DNA区域，则能够相应地提高定量精度和检测灵敏度。
在本发明中的目标区域为微生物来源的碱基序列的情况下，作为目标区域，可以列举从样本中抽提的基因组DNA或DNA片段、或利用逆转录酶将从样本中抽提出的RNA变为DNA而得到的碱基序列。因此，作为能够与检测寡核苷酸互补结合的碱基序列，选择对该微生物具有特异性的区域即可。例如，在本发明中的目标区域为微生物的碱基序列的情况下，为了从样本中选择性地抽提出目标区域，将微生物基因组DNA或利用逆转录酶由样本中抽提出的RNA而得到的DNA等的碱基序列中，位于目标区域附近的微生物特有的碱基序列作为与特定寡核苷酸特异性结合的碱基序列即可。
作为本发明中的“具有目标DNA区域的DNA”，可以列举革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等细菌、真菌、病毒、病原性原虫等微生物等来源的DNA、或利用逆转录酶从这些微生物等来源的RNA获取的DNA。例如，生殖支原体(Mycoplasma genitalium)、肺炎支原体 (Mycoplasma pneumoniae)、■{白氏 旋体(Borrelia burgdorferi)B31、普氏立克次氏体 (Rickettsia prowazekii)、梅毒螺方宠体(Treponema pallidum)、月市炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙目艮衣原体(Chlamydia trachomatis)、幽门螺方宠杆菌(Helicobacter pylori) J99、幽门螺旋杆菌26695、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)RcU结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv、绿月农假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 口耆月市军团菌(Legionella pneumophila)、丰占质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、空肠弯曲！flif (Campylobacter jejuni subsp. Jejuni) > 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、畐Ij溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、 蜡样芽胞杆菌(Bacillusu cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、小肠结肠炎耳口尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 假结核耳口尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、红色毛痛菌(Trichophyton ruburum)、须发;)||菌(Trichophyton mentagrophytes)、白菌(Candida albicans) > 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、卡氏月市孢子菌(Pneumocystis carinii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、巨细胞病_ (Cytomegalovirus) > XMM^iIPlM (human herpesvirus) 5> g^Sjrfi - E/K # (Epstein-Barr virus)、人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)、人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus)、肠病毒(Enterovirus)、诺如病毒(Norovirus)、 流感病毒anfluenza Virus)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米(Entamoeba histolytica)的基因组 DNA 或利用逆转录酶从RNA制作的DNA，可以用于样本中的感染症病原菌或食品中的食物中毒病原菌等的检测。
在检查活检样品中或食品等一般制品中所含的病原性微生物等的有无的情况下， 通常，通过利用对各个微生物等的抗原的免疫法进行检查，来决定病原性微生物等的有无或确定病原性微生物等。但是，免疫法检查所用的抗体有时不易制作，并且为了检测多种细菌，需要制作针对各个细菌等的抗原的抗体。但是，通过利用本发明，无需制作抗体即可进行检查。即，通过利用本发明，能够对难以制作抗体的微生物或未制作出抗体的微生物提供简易的检查方法。另外，本发明中，能够同时检查不同微生物的碱基序列，因此能够同时检测一个样本中所含的多种微生物。作为这些微生物，具体而言，已知单核细胞土曾牛寺胃(Listeria monocytogenes)(Salmonella enterica) > 弯曲杆菌(Campylobacter jejuni subsp. Jejuni)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、畐Ij溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、赌样芽胞杆菌(Bacillusu cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、小肠结肠炎耳口尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等食物中毒菌，但是尚未已知同时检测这些细菌的技术。本发明中，能够同时检测多个碱基序列，因此能够同时检查多种食物中毒菌的有无。另外，在通过后述的特定寡核苷酸选择(结合)作为检测对象的碱基序列的CRISHUClustered regularly interspaced short palindromic r印eats，成簇的规律间隔的短回文重复序列)区域等、 在基因组中可见到多个的碱基序列的情况下，能够以高于检测1个基因组中的1个基因的灵敏度进行检测。这样的技术对于感染症的诊断、食物中毒菌的迅速检测也有用。另外， 本发明通过检测环境中的微生物的基因组DNA，也可以用于产业上的有用菌的鉴定和土壤、河流、湖沼的底质等的微生物群的简易调查等。在环境中生息的微生物中，可以确认例如詹氏甲烧球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烧杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum) deltaH、超口誉热菌(Aquifex aeolicus)、掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii) 0T3、发光古球菌(Archaeoglobus fulgidus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8> 1 Λ ^ (Aeropyrum pernix)Kl> Φ g ik ^ (Haloferax mediterranei)等的生息。另外，还可以对硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)等工业上能利用的细菌、嗜热链球菌(Sti^ptococcus thermophilus)等用于发酵的微生物等进行检测和鉴定。
例如，作为用于检测微生物中的基因组的目标区域和后述的检测寡核苷酸互补结合的区域，具体而言，可以是相当于Genbank收录号NC_001139等所示的酵母染色体VII 的碱基序号271743-272083的碱基序列、相当于Genbank收录号NC_001139等所示的酵母染色体VII的碱基序号384569-384685的碱基序列等不编码基因的碱基序列。另外，以各种病原性微生物中共有的特征性基因的、在病原性微生物中保守的碱基序列作为检测对象时，能够提供同时检测多种病原性微生物的方法，因而是很有用的。具体而言，mce-家族基因(结核杆菌(Micobacterium tuberculosis))、13号染色体上的tRNA-Tyr碱基序列 (新型隐球菌(Cryptococcus neoformans))、几丁质合成酶活化因子(Chs3)具有烟曲霉菌 (Aspergillus fumigatus)和新萨托菌(Neosartorya)属特有的碱基序列，因此，通过鉴定从人的痰、肺的活检样本中抽提的DNA中是否含有来源于这些微生物的DNA，能够用于微生物所致感染症的鉴定。另外，actA(单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)), pyrG(NC_002163、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni subsp. Jejuni))等为食物中毒菌特有的共同的基因，因此，这些基因能够用于食物中毒的微生物鉴定。另外，thrA具有在肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、小肠结肠炎耳口尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 大肠杆菌(Escherichia coli)中保存的序列，通过一个基因也能够检测多种微生物。
“重复序列”是指在基因组中可见到多个相同的规定序列的碱基序列。作为这样的重复序列，已知简单重复序列(称为串联重复序列，tandem r印eat)、散在重复序列等。
简单重复序列的特征在于，相同的序列以相同的朝向相邻存在。已知卫星DNA、小卫星、微卫星、着丝粒、端粒、动粒、核糖体基因簇等一系列碱基序列等。
散在重复序列的特征在于，不相邻而散在，认为其为来自于逆转录转座子的 DNA。根据碱基序列的长度，散在重复序列分类为SINE (Short Interspersed Repetitive Element,短散在重复序列)和LINE (Long Interspersed Elements,长散在重复序列)，作为人的碱基序列，已知Alu序列和LINE-I序列分别为其代表性重复序列。另外，还已知由 RNA或蛋白质反转录而得到的失活加工假基因、通过基因重复扩增而得到的基因序列。
重复基因是指在一个基因组中存在多个具有高同源性的基因的情况，多数情况下，为在一个基因附近随机排列而存在的碱基序列。另外，假基因中已知也包括包含于重复基因中的基因。
作为重复序列的具体例子，例如，作为含有比较短的碱基序列的重复序列，已知 (A) n、(T) η、(GA) η、(CA) η、(TAA) η、(GGA) η、(CAGC) η、(CATA) η、(GAAA) η、(TATG) η、(TTTG) η、 (TTTA) η、(TTTC) η、(TAAA) η、(TTCA) η、(TATAA) η、(TCTCC) η、(TTTCC) η、(TTTAA) η、(TTTTC) η、(TTTTA) η、(TTTTG) η、(CAAAA) η、(CACCC) η、(TATATG) η、(CATATA) η、(TCTCTG) η、(AGGGGG) η、(CCCCCA) η, (TGGGGG) η (η表示重复数)等序列；作为来自于转录因子的序列，有hAT组 (group)的 MERl-Charlie、Zaphod，Tc-l组(group)的 MER2_Tigger、Tc_l、Mariner。此夕卜， 具体而言，还已知Tiggerl、Tigger2a、Tigger5、Charlie4a、Charlie7等。这些序列通常为较短且简单的碱基序列，难以设定后述的特定接合序列(日文接着配列)和检测用接合序列，但是只要具有能够设定为本发明中的后述的特定接合序列和检测用接合序列的设定对象的序列，则也可以用于本发明，因此未必一定排除在本发明的对象之外。另外，卫星DNA、 小卫星、微卫星等是分类为简单重复序列的重复序列。
另外，作为在基因中存在多个拷贝的序列，可以列举存在于着丝粒中的序列ALR6 或作为snRNA的U2、U6，或者tRNA、rRNA等已知通常在基因组中存在多个拷贝的基因，除此之外还可以举出通过基因重复在基因组中存在多个拷贝的基因等。
关于假基因，是指在DNA的序列中，具有以使人联想到其曾经编码基因产物(特别是蛋白质)为特征的碱基序列，但目前已丧失功能的基因。认为其是由原来的具有功能的序列发生突变的结果而产生的。例如有由突变导致终止密码子产生，蛋白质的肽链缩短，无法发挥作为蛋白质的功能的情况；或由单碱基置换等突变导致正常转录所需的调节序列丧失功能的情况等。假基因大多会另外留有原来的正常的基因，但也有单独成为假基因的情况。
假基因根据基因序列的特点可以分类为3种类型。有如下情况基因组中插入有由逆转录转座子的逆转录酶从mRNA制作成的DNA的情况(加工型假基因)；原基因序列在基因组内重复，其拷贝中的一部分因突变等丧失功能而成为假基因的情况(重复假基因或非加工型假基因)；以及基因组内的基因(无重复基因而仅有单独的基因的状态)丧失功能而成为假基因的情况。
目前，在作为假基因已知的基因中，还已知进行转录的例子、具有基因功能的例子 (尚不确定是否应称为假基因)，因此本发明方法中的“假基因”，不表示有无基因功能或是否进行转录，而表示前述的“加工型假基因”和“重复假基因(非加工型假基因)”。
重复基因是指，通过基因重复使基因组中的特定基因、基因片段加倍而产生的基因或其基因片段。基因重复是包含基因的DNA的某个区域产生重复的现象。作为产生基因重复的原因，有基因重组的异常、逆转录转座子的转移、染色体整体的重复等。例如，当1 个基因被复制而插入基因组DNA时，有插入到不同的染色体位置的情况和插入到原基因的附近的情况。通过插入到原基因的附近而使所复制的基因串联的场所称为串联重复序列 (tandem r印eat)，通过基因重复而制作的基因组称为基因簇(基因家族)。
此外，已知逆转录病毒、末端具有LTR(Long terminal r印eat，长末端重复序列)的逆转录转座子、MaLRs (Mammalian apparent LTR-Retrotransposons，哺乳动物显性 LTR-逆转录转座子)等认为来源于病毒的内源序列、逆转录病毒来源的LTR等也在一个基因组中存在多个。例如，作为逆转录病毒来源的LTR，具体而言，已知LTR1、LTR1B、LTR5、 LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E, MER48、MLT2CB 等亚家族。另外，逆转录转座子来源的LTR分类为ERV、ERVK, ERVL各类，具体而言，可以列举LTR8A、LTR28、 MER21B、MER83、MER31B、MER49、MER66B、HERVH、ERVL, LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、 MLT2A1、MLT2E、MER11C、MERllC等亚家族。另外，MaLRs是指与典型的逆转录转座子同样地在其序列的两端含有LTR，但是LTR所夹的内部序列并非逆转录病毒来源的序列的DNA 因子。可以列举例如MLT1A1、MLT1A2、MLTIB, MLT1C、MLTID, MLT1F、MLT1G、MLT1H、MLT1J、 MLT1K、MLTlI、MLT2CB、MSTA、MSTA-int、MSTB、THE1A、THE IB, THElB-internal、THEl 等亚家族。
“散在重复序列”的特征在于不相邻而散在，认为其来自于逆转录转座子。另外， 散在重复序列根据其长度分类为SINE (Short Interspersed Repetitive Element，短散在重复序列)和LINE(Long Interspersed Elements，长散在重复序列)。SINE中，大部分为属于Alu家族的序列。作为特征，具有7SL RNA的3’侧的序列或5’侧的序列，并且具有由称为左单体(Left-monomer)和右单体(Right-monomer)的区域夹着的AT富集区域。作为 Alu 家族的亚家族，可以列举 Alu、Alujb、Alujo、AluSc、AluSg、AluSp、AluSq、AluSx、AluY， 以及 FAM (Fossil Alu Monomer)和具有 FAM 的序列的 FLAM (Free Left Alu Monomer)禾口 FRAM (Free Right Alu Monomer)。作为 Alu 家族以外的 SINE，已知 MIR 及 Ther/MIR3，作为各自的亚家族，已知MIR、MIR3。此外，作为其它生物种类的Alu家族的亚家族，已知B1、B2、 B4、PB1、PB1D 等。作为 LINE，报道了从 LINEl 到 Line23 的亚家族，但已知 LINE—1、LINE2、LINE3在基因组中广泛存在。另外，对于LINE-I,已知例如L1M1、L1M2、L1M3、LlM3d、L1M4、 LlM4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、LlMBU LlMBU L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、 LIMCa、LlMCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、LlMC4a、L1MC5、LIMDa、LIME、LlMEc、LIMEd、LIMEg、 LlMEl、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、LlME4a、L1PB3、L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、 L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、LlPBU L1PB3、L1PB4、L1PREC2、 HALl的亚家族，作为LINE-2，已知L2、L2c的亚家族。另外，对于例如Alu家族或Alu的亚家族中共有的序列、LINE-I家族或LINE-I的亚家族中共有的序列，如果能够设定后述的特定接合序列和检测用接合序列，则能够在一个基因组中设定多个检测对象，因此能够以更高的灵敏度进行基因组的检测。
作为目标DNA区域，具体可以列举例如LINE-I的部分序列(序列号12、序列号13 或序列号14所示的碱基序列)、Alu的部分序列(序列号15所示的碱基序列)或显示它们的同源性的碱基序列等。
本发明中，测定重复序列是指同时测定一个基因组中存在多个的碱基序列，例如， 与序列号13表示的碱基序列具有80%以上的序列同源性的碱基序列，在人基因组中约有 280个拷贝，与序列号15表示的碱基序列具有80%以上的同源性的碱基序列，在人基因组中约有820个拷贝。因此，如果能够在各个碱基序列中设定检测用接合序列和特定接合序列，与在一个基因组中仅存在一种的序列中设定检测用接合序列和特定接合序列的情况相比，理论上能够将一个基因组的检测灵敏度提高沈0 820倍。
第二步骤是将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸和与该被测寡核苷酸互补结合且具有多种识别功能的检测寡核苷酸混合，形成含有该被测寡核苷酸和该检测寡核苷酸的检测复合物，并使该检测复合物固定在支撑体上的步骤。
作为具有多种识别功能的检测寡核苷酸，可以列举由多个寡核苷酸互补结合而成的复合检测寡核苷酸、含有具有多个甲基化位点的甲基化寡核苷酸的复合检测寡核苷酸寸。
本发明中的“检测寡核苷酸”是指，能够通过后述的“识别功能”进行检测且与被测寡核苷酸互补结合的寡核苷酸。另外，检测寡核苷酸只要具有“识别功能”且与被测寡核苷酸互补结合，则可以是任意的寡核苷酸，也可以是多个寡核苷酸互补结合而成的复合寡核苷酸。作为识别功能，在结合后述的“检测分子”的情况下，检测寡核苷酸可以具有后述的“检测序列”。
作为本发明方法中的“具有多种识别功能的检测寡核苷酸”，是指检测寡核苷酸具有多种识别功能。例如，在检测寡核苷酸为多个寡核苷酸互补结合而成的复合寡核苷酸的情况下，只要复合寡核苷酸上具有多种识别功能则可以是任意的复合寡核苷酸，特别是不确定识别功能的位置。更具体而言，可以是后述的“复合检测寡核苷酸”。另外，在检测寡核苷酸为单链寡核苷酸的情况下，只要寡核苷酸上具有多种识别功能则可以是任意的寡核苷酸。例如，在检测寡核苷酸为甲基化寡核苷酸的情况下，可以在检测寡核苷酸上合成多个具有的甲基化DNA而作为检测寡核苷酸使用。甲基化DNA可以使用甲基化DNA抗体进行检测，因此，检测寡核苷酸上结合的甲基化DNA抗体数越多，则可以期待得到越高的检测灵敏度。另外，为了检测甲基化DNA，除了使用甲基化DNA抗体的方法以外，还有后述的利用“锇络合物”的方法。
在检测寡核苷酸为甲基化寡核苷酸的情况下，可以容易地增加检测寡核苷酸上的识别功能，并且，可以从使用甲基化DNA抗体的检测方法、使用锇络合物等的检测方法等多种检测方法中选择适合测定的检测方法。
本发明中的“复合检测寡核苷酸”是指，与被测寡核苷酸互补结合且由多个寡核苷酸互补结合而成的寡核苷酸。另外，复合检测寡核苷酸具有后述的识别功能，并采用多个寡核苷酸通过各个寡核苷酸所具有的含有相互互补的碱基序列的接合碱基序列结合而成的结构。
另外，识别功能可以预先与复合检测寡核苷酸结合，也可以间接与复合检测寡核苷酸结合。
构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸，可以全部或部分被甲基化。本发明中，将至少一部分被甲基化的复合检测寡核苷酸称为甲基化复合检测寡核苷酸。在使甲基化寡核苷酸互补结合而形成复合检测寡核苷酸的情况下，甲基化复合检测寡核苷酸例如可以仅由甲基化寡核苷酸结合而成，也可以由甲基化寡核苷酸与未甲基化的寡核苷酸组合结合而成。
“甲基化寡核苷酸”是指，构成寡核苷酸的核苷酸的碱基被甲基化的寡核苷酸，本发明中可以是人工合成的甲基化寡核苷酸。另外，也可以通过将人工合成的寡核苷酸或基因组DNA片段化所得到的寡核苷酸用甲基转移酶修饰来制备。已知若干种甲基转移酶将寡核苷酸中的“CpG”中的胞嘧啶的5位甲基化，作为这样的甲基化酶的具体例，可以列举SssI 甲基化酶、Dmntl甲基化酶等。另外，由于基因组DNA是部分甲基化的，因而将从细胞等获取的基因组DNA片段化时，有时可以获得在基因组中被甲基化的区域作为甲基化寡核苷酸。 另外，胞嘧啶的5位被甲基化的甲基化寡核苷酸，可以是使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶而人工合成的甲基化寡核苷酸。此时，不仅能够将“CpG”的胞嘧啶而且能够将所有的胞嘧啶 (例如，5，-CA-3’、5’ -CT-3’、5’ -CC-3’等)均合成为5-甲基胞嘧啶。
"DNA甲基化酶”是将DNA中的碱基甲基化的酶，从哺乳动物细胞、细菌等已分离出多种DNA甲基化酶。DNA甲基化酶根据底物的碱基的种类分类为腺嘌呤甲基化酶、胞嘧啶甲基化酶等几种。胞嘧啶甲基化酶是识别DNA碱基序列中的特定序列并将该序列附近的胞嘧啶甲基化的酶，根据所识别的碱基序列已知有不同的胞嘧啶甲基化酶。
另外，DNA甲基化酶所催化的DNA的甲基化反应多数是从称为限制性修饰系统的原始的免疫系统中发现的。限制性修饰系统是指，在细菌中起作用的、通过将整个基因组定期甲基化从而使其不被识别特定序列的限制性内切酶(限制性核酸内切酶)消化、并且使外源DNA(特别是噬菌体)被限制性内切酶消化的功能来保护微生物基因组免受噬菌体感染的系统。已知作用于基因组的甲基化的酶，将胞嘧啶或腺嘌呤甲基化，多数将嘌呤残基的 6位的氮(N6)或5位的碳(C5)甲基化。这样的酶中，作为将胞嘧啶的C5甲基化的胞嘧啶甲基化酶，已知有SssI (M. SssI)甲基化酶、AluI甲基化酶、HhaI甲基化酶、HpaII甲基化酶、MspI甲基化酶、HaeIII甲基化酶等。另外，这些将胞嘧啶的C5位甲基化的酶所识别的碱基序列不同，识别CpG的胞嘧啶甲基化酶仅有SssI。
另外，作为人基因组中的DNA的甲基化反应，就表观遗传(不依赖基因序列而产生基因表达的多样性的机制)而言，已知CpG的胞嘧啶的5位(C5)的甲基化，作为这样的胞嘧啶甲基化酶，已知DNA甲基转移酶。作为DNA甲基转移酶，已知DnmtI甲基转移酶。
因此，由于人细胞中CpG序列的胞嘧啶的C5位被甲基化，因而在人为地将基因组甲基化的情况下，通过使用SssI，可以将与人细胞内的甲基化相同的序列(CpG)的相同的胞嘧啶的相同的位置甲基化。
为了利用胞嘧啶甲基化酶得到甲基化的DNA，具体而言例如如下实施即可。在DNA 试样中加入最适IOX缓冲液(NEBuffer2 (NEB公司制))5 μ L、S-腺苷蛋氨酸(3. 2mM, NEB 公司制)0. 5 μ 1、胞嘧啶甲基化酶ksl (NEB公司制)0. 5 μ L，然后在该混合物中加入灭菌超纯水使液量为50 μ L，并在37°C孵育30分钟即可。
本发明中，在构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸相互互补地串联结合(连接)的情况下(有时也称为“串联型”)，将构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)中具有通过互补性与被测寡核苷酸上连接碱基序列结合的互补连接碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第1寡核苷酸。
第1寡核苷酸具有第1接合碱基序列，所述第1接合碱基序列是能够与第2寡核苷酸的互补接合序列互补结合的接合碱基序列，所述第2寡核苷酸是不与被测寡核苷酸的碱基序列互补结合并且能够与第1寡核苷酸互补结合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。
第2寡核苷酸具有第2接合碱基序列，所述第2接合碱基序列是能够与第3寡核苷酸互补结合的接合碱基序列，所述第3寡核苷酸是不与被测寡核苷酸和第1接合序列以外的第1寡核苷酸的碱基序列部分互补结合而能够与第2寡核苷酸互补结合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。将具有含有能够与第2接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第 2接合碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第3寡核苷酸。
同样地，将具有含有能够与第N接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第N接合碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第(N+1)寡核苷酸。第(N+1)寡核苷酸具有第(N+1)接合碱基序列，所述第(N+1)接合碱基序列是能够与第(N+幻寡核苷酸互补结合的接合碱基序列，所述第(N+幻接合碱基序列是不与被测寡核苷酸和第N接合序列以外的、第1寡核苷酸至第N寡核苷酸的寡核苷酸的碱基序列部分互补结合而能够与第 (N+1)寡核苷酸互补结合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。将具有含有能够与第(N+1) 接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第(N+1)接合碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第(N+幻寡核苷酸。
同样地，将具有含有能够与第(N-I)接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第 (N-I)接合碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第N寡核苷酸。第N寡核苷酸具有第N接合碱基序列，所述第N接合碱基序列是能够与第(N+1)寡核苷酸互补结合的接合碱基序列，所述第(N+1)寡核苷酸是不与被测寡核苷酸和第(N-I)接合序列以外的、第 1寡核苷酸至第(N-I)寡核苷酸的寡核苷酸的碱基序列部分互补结合而能够与第N寡核苷酸互补结合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。
另外，在不存在第(N+1)寡核苷酸的情况下，将第N寡核苷酸称为末端寡核苷酸， 该第N寡核苷酸可以不具有第N接合碱基序列。
即，本发明方法中的复合检测寡核苷酸的一种形态，是将第1寡核苷酸至末端寡核苷酸通过接合碱基序列与互补接合碱基序列的互补结合连接而成的复合检测寡核苷酸。
在复合检测寡核苷酸仅由含有具有多个甲基化位点的甲基化寡核苷酸的第1寡核苷酸形成的情况下，根据上述，该第1寡核苷酸可以不具有接合碱基序列。
另外，即使不使用复合检测寡核苷酸而使用含有仅具有一个甲基化位点的甲基化寡核苷酸的检测寡核苷酸，也能够对样本中所含的具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
接合碱基序列与互补接合碱基序列，只要是能使寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)互补结合的碱基序列即可，可以位于寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)的末端，也可以位于中间。
另外，第N接合碱基序列优选不与互补第N接合碱基序列以外的碱基序列互补结合，并且也不妨碍该互补第N接合碱基序列以外的碱基序列的任意互补结合。另外，第N接合碱基序列优选不与互补第N接合碱基序列以外的、包含构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸、样本中所含的核酸、被测寡核苷酸及后述的特定寡核苷酸在内的其它寡核苷酸的碱基序列互补结合。
本发明的方法中，在构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸能够相互互补地分枝(除串联之外)结合(连接)的情况下(有时也称为“分枝型”)，构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)中，在第N寡核苷酸上可以存在多个接合碱基序列。例如，在第N寡核苷酸上存在M个接合碱基序列的情况下，分别将其称为第(N，l)接合碱基序列、第 (N, 2)接合碱基序列、第(N, 3)接合碱基序列、…、第(N, (M-I))接合碱基序列、第(N，M)接合碱基序列，将通过互补性与这些接合碱基序列结合的寡核苷酸分别称为第((N+l)，l)寡核苷酸、第((N+l)，2)寡核苷酸、第((N+l)，3)寡核苷酸、…、第((N+l)，(N-I))寡核苷酸、 第((N+1)，M)寡核苷酸。此时，例如在不存在第((N+2)，l)寡核苷酸的情况下，第((N+1), 1)寡核苷酸为末端寡核苷酸，且可以不存在第((N+l)，l)接合碱基序列。
同样地，在第(N，l)寡核苷酸上存在多个接合碱基序列的情况下，例如在第(N， 1)寡核苷酸上存在L个接合碱基序列的情况下，将其分别称为第(N，l，l)接合碱基序列、 第(N, 1,2)接合碱基序列、第(N, 1,3)接合碱基序列、…、第(N，l，(L-I))接合碱基序列、 第(N，l，L)接合碱基序列，将通过互补性与这些接合碱基序列结合的寡核苷酸分别称为第((N+l)，l，l)寡核苷酸、第((N+l)，l，2)寡核苷酸、第((N+l)，l，3)寡核苷酸、…、第 ((N+l)，l，(L-I))寡核苷酸、第((N+1)，1，L)寡核苷酸。此时，例如在不存在第((N+2)，l， 1)寡核苷酸的情况下，第((N+l)，l，l)寡核苷酸为末端寡核苷酸，且可以不存在第((N+1)， 1,1)接合碱基序列。
分枝型的复合寡核苷酸也包括存在多种第1寡核苷酸且被测寡核苷酸上结合多个第1寡核苷酸的情况。此时，在被测寡核苷酸上存在M个第1寡核苷酸的情况下，只要是具有能够分别与被测寡核苷酸上的第1连接序列、第2连接序列…第M连接序列互补结合的第(1，1)接合序列、第(1，2)接合序列、第(1，3)接合序列…第(1、M)接合序列的第(1， 1)寡核苷酸、第(1，幻寡核苷酸、第(1，；3)寡核苷酸…第(1、M)寡核苷酸即可。
另外，在第1寡核苷酸上存在M个第2寡核苷酸的情况下，只要是各自具有能够分别与第ι寡核苷酸上的第1连接序列、第2连接序列…第M连接序列互补结合的第(2，1)接合序列、第(2，2)接合序列、第(2，3)接合序列…第(2，M)接合序列的第(2，1)寡核苷酸、 第(2，幻寡核苷酸、第(2，；3)寡核苷酸…第(2、M)寡核苷酸即可。
另外，在第N寡核苷酸上存在M个第N+1寡核苷酸的情况下，只要是各自具有能够分别与第N寡核苷酸上的第1连接序列、第2连接序列…第M连接序列互补结合的第(N+1， 1)接合序列、第(N+1,2)接合序列、第(N+1,3)接合序列…第(N+Ι,Μ)接合序列的第(Ν+1，1)寡核苷酸、第(N+1,2)寡核苷酸、第(N+1,3)寡核苷酸…第(N+1、M)寡核苷酸即可。
另外，在第(N，M)寡核苷酸上存在P个第N+1寡核苷酸的情况下，只要是各自具有分别能够与第(N，M)寡核苷酸上的第(N+1，M，1)连接序列、第(N+1，M，2)连接序列…第 (N+1，M，P)连接序列互补结合的第(N+1，M，1)接合序列、第(N+1，M，2)接合序列、第(N+1, M，3)接合序列…第(N+1, M, P)接合序列的第(N+1, M，l)寡核苷酸、第(N+1, M，2)寡核苷酸、第(N+1，M，3)寡核苷酸…第(N+1,M, P)寡核苷酸即可。
另外，在第(Ν，Μ，…，X)寡核苷酸上存在P个第Ν+1寡核苷酸的情况下，只要是各自具有分别能够与第(N，Μ，…，X)寡核苷酸上的第(N+Ι,Μ,…，X，l)连接序列、第(Ν+1， Μ，…，Χ，2)连接序列…第(N+Ι,Μ,…，Χ，Ρ)连接序列互补结合的第(N+Ι,Μ,…，X，l)接合序列、第(N+l，Μ，…，Χ，2)接合序列、第(N+l，Μ，…，Χ，3)接合序列…第(N+l，Μ，…， Χ，Ρ)接合序列的第(Ν+1，Μ，…，X，l)寡核苷酸、第(Ν+1，Μ，…，X，2)寡核苷酸、第(Ν+1， Μ，…，Χ，3)寡核苷酸…第(Ν+1，Μ，…，X，P)寡核苷酸即可。
如上所述，可以进行各种组合来提高灵敏度，可以根据检测所需的灵敏度或精度来制备各寡核苷酸、末端寡核苷酸的组合。
在一个寡核苷酸上存在多个接合碱基序列的情况下，这些接合碱基序列可以相同，也可以不同。具体而言，例如，前述第(N，l)接合碱基序列、第(Ν，2)接合碱基序列、第 (N, 3)接合碱基序列的碱基序列可以全部相同，也可以是各自不同的碱基序列。连接接合序列与互补连接碱基序列、以及接合碱基序列与互补接合碱基序列，只要是能够相互互补结合的碱基序列即可，具体而言，只要具有90%以上的同源性即可，通常分别为5 lOObp、优选10 50bp。接合碱基序列和互补接合碱基序列优选以不与基因组互补结合的方式进行设计，或者优选为人工合成的DNA。为了简便地确认所设计的接合碱基序列和连接碱基序列等不与基因组互补结合，用PubMeD等公共机构等的基因组数据库进行Blast检索，确认不存在显示80%以上的同源性的碱基序列即可。
即，“复合检测寡核苷酸”通过连接碱基序列和互补连接碱基序列的互补结合与被测寡核苷酸连接，从而形成检测复合物。
检测复合物是一个被测寡核苷酸上结合有检测寡核苷酸的复合物、或多个复合检测寡核苷酸结合成的复合物。多个复合检测寡核苷酸结合在一个被测寡核苷酸上的情况下，各个复合检测寡核苷酸可以是相同的复合检测寡核苷酸，或者也可以是不同的复合检测寡核苷酸。另外，被测寡核苷酸上的连接碱基序列，可以是多种连接碱基序列各存在一个，也可以是一种连接碱基序列存在多个。
本发明中的“检测复合物”是指，通过被测寡核苷酸的连接碱基序列与复合检测寡核苷酸的互补连接碱基序列的互补结合，将复合检测寡核苷酸与被测寡核苷酸连接。检测复合物只要具有用于通过利用后述的识别功能进行检测而在后述的第三步骤中对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的识别功能、或能够与具有识别功能的检测分子结合即可。
“识别功能”是指能够对复合检测寡核苷酸进行检测或定量的功能。即，识别功能只要是能够识别复合检测寡核苷酸的功能则可以是任意识别功能，可以列举例如基于复合检测寡核苷酸的标记的识别功能、或由复合检测寡核苷酸上结合的检测分子赋予检测寡核苷酸的识别功能。具体而言，可以列举在构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸的5’末端或3’末端进行了铕标记、胶体金标记、乳胶珠标记、放射性同位素标记、荧光物质(FITC等)标记、辣根过氧化物酶(HRP)标记、碱性磷酸酶标记等的复合检测寡核苷酸的荧光、发色等特性。
为了检测铕，添加增强溶液(Enhancement Solution) (PerkinElmer公司制)并混合，在室温下静置约45分钟后，用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光612nm)即可。另夕卜，在复合检测寡核苷酸为甲基化寡核苷酸的情况下，作为检测分子，具体可以列举甲基化 DNA抗体、锇络合物(J. Am. Chem. Soc.，2007 ；129 =5612-5620)等。甲基化复合寡核苷酸是指具体包含5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤等的复合寡核苷酸。另外，在复合检测寡核苷酸用FITC标记的情况下，作为检测分子可以列举FITC抗体。
在检测分子为甲基化DNA抗体的情况下，通过以下的方法，可以赋予其作为用于定量或检测的识别功能的功能。具体而言，铕标记、胶体金标记、乳胶珠标记、放射性同位素标记、荧光物质(FITC等)标记、辣根过氧化物酶(HRP)标记、碱性磷酸酶标记、生物素标记等标记具有荧光、发色等功能。另外，作为对这些作为检测分子的抗体赋予识别功能的方法，可以在作为检测分子的抗体上直接结合识别功能，也可以列举使具有识别功能的二次抗体或三次抗体与作为检测分子的抗体结合的方法。具体而言，荧光物质标记的抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体、碱性磷酸酶标记的抗体、生物素标记的抗体、铕标记的抗体有市售品，因此可以作为二次抗体或三次抗体来利用。另外，也可以是结合有能够通过酶循环法检测的底物的抗体。作为这些功能的定量或检测手段，可以列举例如利用放射线检测器、分光光度计等进行测定或目测等。例如，在利用复合检测寡核苷酸的识别功能对其进行检测或定量的情况下，具体而言在使用附加有铕的二次抗体作为能够检测或定量的功能的情况下，使二次抗体与检测复合物结合后，添加增强溶液(PerkinElmer公司制)并混合，在室温下静置约45分钟。然后，用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光612nm)即可。
在使甲基化DNA抗体与复合检测寡核苷酸上的甲基化DNA结合，并利用其功能进行检测或定量的情况下，具体而言例如如下操作即可。使甲基化DNA抗体与结合在支撑体上的检测复合物结合后，添加抗甲基化DNA抗体的二次抗体(例如，Eu-Nl标记的小鼠IgG 抗体，PerkinElmer公司制)，在室温下静置约1小时，从而促进二次抗体在检测复合物上的结合。然后，添加增强溶液(PerkinElmer公司制)并混合，并在室温下静置例如约45分钟。然后，用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光612nm)，由此进行检测或定量。
另外，为与支撑体结合而使用甲基化DNA抗体的情况下，使用与为与支撑体结合而使用的甲基化DNA抗体具有不同底物特异性的甲基化DNA抗体作为与该检测寡核苷酸的甲基化DNA结合的检测分子。
另外，在用FITC将与复合检测寡核苷酸上的甲基化DNA结合的甲基化DNA抗体进行了标记的情况下，也可以使用结合有FITC的抗体作为二次抗体。此时，也可以通过公知的方法测定FITC的荧光，进行检测或定量，也可以以抗FITC抗体作为二次抗体进行检测或定量。另外，在检测寡核苷酸上直接结合有FITC的情况下，也可以利用FITC作为识别功能， 也可以通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的FITC抗体、碱性磷酸酶标记的FITC抗体、生物素标记的FITC抗体、铕标记的FITC抗体等来赋予标记功能。具体而言，作为复合检测寡核苷酸，在使用FITC标记的寡核苷酸作为复合检测寡核苷酸的情况下，将包含该复合检测寡核苷酸的检测复合物结合到支撑体上后，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体(例如，HRP标记的FITC抗体(Jackson Immuno Research Laboratories公司制))，在室温下静置约1 小时 2小时，从而促进FITC抗体与结合在支撑体上的检测复合物的结合。然后，将FITC 抗体溶液洗涤除去后，添加适当的底物(例如，底物试剂包#DY999，R&D SYSTEMS公司制) 并混合。在室温下静置约5 60分钟后，添加终止溶液ON H2SO4水溶液)，使辣根过氧化物酶(HRP)的反应停止，反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度即可。
将被测寡核苷酸固定在支撑体上时未使用生物素的情况下，检测或定量中可以使用生物素化检测寡核苷酸。对生物素化的检测寡核苷酸进行检测或定量的情况下，例如，将 HRP标记的链霉亲和素添加到固定在支撑体上的检测复合物中并混合，形成生物素化检测寡核苷酸与HRP标记的链霉亲和素的结合物并分离后，通过公知的方法测定HRP的活性，由此可以对生物素化甲基化DNA抗体进行检测或定量。
另外，作为识别功能，可以利用酶循环法等高灵敏度检测法中使用的底物等。具体而言，以结合有酶循环法中使用的酶的抗体作为检测分子，使其与检测复合物结合即可。另外，作为本发明中赋予检测分子的识别功能，不限于上述的方法。
“检测分子”只要具有对复合检测寡核苷酸进行检测或定量的性质即可。另外，检测分子可以识别复合检测寡核苷酸的检测序列，也可以预先结合在复合检测寡核苷酸上。 即，检测分子只要具有与检测寡核苷酸特异性结合的性质，并且具有能够用于定量或检测的功能、特性即“识别功能”或能够被赋予识别功能即可。具体而言，在检测序列为甲基化寡核苷酸的情况下，检测分子只要是与该甲基化寡核苷酸结合从而能够检测该甲基化寡核苷酸的检测分子即可，只要是与该甲基化寡核苷酸特异性结合而显示识别功能的检测分子即可。(其中，在为了与支撑体结合而使用甲基化DNA抗体的情况下，使用与为了与支撑体结合而使用的甲基化DNA抗体具有不同底物特异性的甲基化DNA抗体作为与该检测寡核苷酸的甲基化DNA结合的检测分子)。此外，例如，检测分子可以是甲基化DNA抗体。另外，在检测序列为检测分子本身的情况下，为了对复合检测寡核苷酸进行检测，可以不添加新的检测分子，通过对检测寡核苷酸中结合的检测分子进行检测，可以进行该检测寡核苷酸的检测。
本发明方法中的“检测序列”是指，用于使检测分子与复合检测寡核苷酸结合的碱基序列。
检测序列只要是不与接合序列、互补接合序列等与本发明方法中的检测复合物的形成有关的碱基序列互补结合的序列即可，可以是合成的碱基序列，也可以与自然界中存在的碱基序列具有同源性，只要以能够使检测分子与检测复合物结合的形式存在即可。
例如，具体而言，检测序列可以存在于全部复合检测寡核苷酸中，也可以仅存在于检测复合物中所含的特定的复合检测寡核苷酸中。
本发明中，“甲基化DNA抗体”是指以DNA中的甲基化的碱基为抗原进行结合的抗体。具体而言，可以列举作为甲基胞嘧啶抗体、具有识别单链DNA中的5位被甲基化的胞嘧啶并与之结合的性质的抗体。另外，只要是特异性识别本说明书记载的甲基化状态的DNA 并能够特异性结合的抗体即可，也可以使用市售的甲基化DNA抗体。甲基化DNA抗体可以以甲基化的碱基、甲基化DNA等为抗原，通过通常的方法制作。具体而言，为了制作甲基胞嘧啶抗体，可以通过从以5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或者含有5-甲基胞嘧啶的DNA 等为抗原而制作的抗体中，以该抗体与DNA中的甲基胞嘧啶的特异性结合为指标进行挑选来制作。另外，从这样的固定化甲基化DNA抗体的性质(1个甲基化的碱基(胞嘧啶)上结合1个抗体)来考虑，优选挑选存在数量较多的甲基化的碱基(胞嘧啶)即CpG的区域作为目标DNA区域，并且可以期待定量精度和检测灵敏度的提高。
作为使动物接触抗原而得到的抗体，有用从动物纯化得到的抗原进行免疫后，利用IgG级分(fraction)的抗体(多克隆抗体)的方法和利用生产单一克隆的抗体(单克隆抗体)的方法。本发明中优选为能够特异性识别甲基化DNA或甲基胞嘧啶的抗体，因而优选利用单克隆抗体。
作为制作单克隆抗体的方法，可以列举利用细胞融合法的方法。例如，细胞融合法是通过使来自于免疫小鼠的脾细胞(B细胞)与骨髓瘤细胞进行细胞融合来制作杂交瘤，挑选杂交瘤所生产的抗体，从而能够制作甲基胞嘧啶抗体(单克隆抗体)。在通过细胞融合法制作单克隆抗体的情况下，不需要纯化抗原，例如，可以以5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等的混合物作为抗原，施用于免疫所用的动物。作为施用方法，将5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等直接施用于产生抗体的小鼠。在难以产生抗体的情况下，也可以使抗原与支撑体结合而进行免疫。另外， 通过将佐剂溶液(例如，将液体石蜡与Aracel A混合并混合结核杆菌的死菌作为佐剂而得到的溶液)与抗原混合施用、或将抗原吸收到核糖体中来免疫，能够提高抗原的免疫性。或者，还有等量添加含有抗原的溶液与佐剂溶液，充分形成乳液状后，注射到小鼠的皮下或腹腔内的方法；或与明矾水充分混合后添加百日咳死菌作为佐剂的方法。另外，也可以在初次免疫后间隔适当的时间后，向小鼠的腹腔内或静胍内进行追加免疫。另外，抗原的量较少的情况下，可以将悬浮有抗原的溶液直接注入小鼠脾脏内来进行免疫。自末次免疫起数天后摘取脾脏并剥离脂肪组织后，制作脾细胞悬浮液。将该脾细胞与例如HGPRT缺陷骨髓瘤细胞进行细胞融合，从而制作杂交瘤。作为细胞融合剂，只要是能够使脾细胞(B细胞)与骨髓瘤细胞有效融合的方法则可以是任何方法，可以列举例如使用仙台病毒(HVJ)、聚乙二醇(PEG)的方法等。另外，也可以通过使用高压脉冲的方法进行细胞融合。细胞融合操作后，在HAT培养基中培养，选择脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤的克�。却赴さ侥芄唤猩秆〉某潭�。作为用于选择生产目标抗体的杂交瘤的抗体检测方法或抗体效价的测定方法，可以利用抗原抗体反应系统。具体而言，在抗可溶性抗原的抗体的测定方法中，可以列举放射性同位素免疫定量法(RIA)、酶联免疫定量法(ELISA)等。
“互补结合”是指，通过碱基之间利用氢键进行的碱基配对，使两条单链DNA或者单链DNA与RNA形成双链DNA或者由DNA与RNA构成的杂合双链。例如，构成单链DNA的碱基通过与构成其它单链DNA的碱基之间产生嘌呤与嘧啶的碱基配对，使这些单链DNA形成双链DNA，更具体而言，是指通过多个连续的胸腺嘧啶与腺嘌呤、鸟嘌呤与胞嘧啶的利用氢键进行的碱基结合，形成双链DNA。另外，例如，构成单链DNA的碱基通过与构成RNA的碱基之间产生嘌呤与嘧啶的碱基配对，使这些单链DNA与RNA形成双链，更具体而言，是指通过多个连续的尿嘧啶与腺嘌呤、鸟嘌呤与胞嘧啶的利用氢键进行的碱基结合，形成杂合双链。
“互补结合”有时也记作“通过互补碱基配对进行的结合”、“互补的碱基配对”或 “通过互补性而结合”。另外，能够互补结合的碱基序列有时也记作相互“具有互补性”、“为互补性”。人工制作的寡核苷酸中所含的次黄嘌呤通过氢键与胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶的结合也包括在互补性结合中。“含有相对于目标DNA区域为互补性的碱基序列的单链DNA”是指，为了与含有目标DNA区域的单链DNA形成结合物(双链)所需的碱基序列，即，含有与目标DNA区域的碱基序列的一部分互补的碱基序列的碱基序列，有时也记作“互补碱基序列”。
“显示同源性的碱基序列”是指具有序列同源性的碱基序列。本发明中，在未记载序列同源性的比率的情况下，是指具有75%以上、优选80%以上的序列同源性的碱基序列。具体而言，“与序列号1显示同源性的碱基序列”是指，与序列号1的碱基序列或序列号 1的部分序列具有75%以上的序列同源性的碱基序列，优选具有80%以上的序列同源性的碱基序列。
第二步骤中，检测复合物被固定于支撑体上。将检测复合物固定于支撑体上时，可以通过预先将所得的被测寡核苷酸的5’末端或3’末端生物素化并实施与上述同样的方法，使其直接结合到支撑体上。
例如，可以将生物素标记的被测寡核苷酸固定于链霉亲和素标记的抗体上。该情况下，利用复合检测寡核苷酸的识别功能对被测寡核苷酸进行定量或检测，就变成对链霉亲和素标记的抗体进行定量或检测。即，在被测寡核苷酸为人工合成的寡核苷酸的情况下， 能够用于固定被测寡核苷酸的对象(即支撑体)的定量或检测。
作为将本发明中的“被测寡核苷酸”固定化的支撑体，不仅可以检测DNA、RNA，也可以是抗体等蛋白质。例如，在“复合检测寡核苷酸”含有甲基化寡核苷酸的情况下，由于“复合检测寡核苷酸”上能够结合多个甲基化DNA抗体，因此，能够以与甲基化DNA抗体的结合数相关的检测灵敏度来检测支撑体。通常在抗体等的检测中，一个抗体分子对应一个标记分子(HRP、FITC等)，因此通过本发明可以期待高灵敏度化。另外，在甲基化寡核苷酸含有 5-甲基胞嘧啶的情况下，复合检测寡核苷酸能够被锇络合物识别，因此，可以期待与“复合检测寡核苷酸”中所含的5-甲基胞嘧啶数相关的检测灵敏度的高灵敏度化。
具体而言，在将含有使用至第3寡核苷酸的复合检测寡核苷酸与被测寡核苷酸的检测复合物通过生物素化特定寡核苷酸固定于支撑体上的情况下，在包含被测寡核苷酸的基因组DNA水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1，基因组DNA的情况下，优选预先用适当的限制性内切酶处理，将DNA片段化)中，加入通过互补性与被测寡核苷酸结合的第1寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通过互补性与第1寡核苷酸结合的第2寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通过互补性与第2寡核苷酸结合的第3寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ,此时第3寡核苷酸成为末端寡核苷酸)、不妨碍该被测寡核苷酸与该复合检测寡核苷酸的结合并且与该被测寡核苷酸互补结合的生物素化特定寡核苷酸(0. 02 μ Μ)各5 μ L，再加入IOOmM的MgCl2 20 μ L以及最适 IOX 缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ 1，然后向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为10(^。在951加热10分钟，在 70°C保温10分钟，在50°C保温10分钟后，在37°C进行10分钟冷却处理，得到检测复合物与特定寡核苷酸互补结合而成的特定检测复合物。将这样形成的特定检测复合物转移到链霉亲和素培养皿中，在室温下静置30分钟即可。然后，进行残留溶液的除去和洗涤。以 200 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4, 3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作，残留(选择) 通过特定寡核苷酸结合在链霉亲和素培养皿上的检测复合物。另外，上述方法中的第1寡核苷酸 末端寡核苷酸中，至少一个以上的寡核苷酸必须为甲基化寡核苷酸。也可以全部寡核苷酸均为甲基化寡核苷酸。上述中，说明了使用至第3寡核苷酸的情况，在使用至第N 寡核苷酸的情况下通过与上述同样的方法实施即可。将被测甲基化寡核苷酸复合物固定化 (选择)时，只要最终形成被测甲基化寡核苷酸复合物并将其固定化(选择)即可，因此，虽然上述方法中是同时添加被测寡核苷酸、生物素化特定寡核苷酸、甲基化寡核苷酸(复合物)而获得该复合物，然后使用生物素化特定寡核苷酸进行固定(选择)，但对其顺序并没有特别限制。即，也可以先将生物素化特定寡核苷酸固定于链霉亲和素培养皿上，然后，添加被测寡核苷酸和甲基化寡核苷酸(复合物)而获得被测甲基化寡核苷酸复合物，从而进行固定(选择)。
另外，洗涤缓冲液只要适于将溶液中漂浮的单链DNA等除去即可，不限于上述洗涤缓冲液，可以是DELFIA缓冲液(PerkinElmer公司制、含Tween 80的Tris-HCl、pH 7.8)、 TE缓冲液等。
作为“支撑体”，只要是检测复合物能够结合的支撑体，则材质、形状没有特别限制。例如，形状适合使用目的即可，可以列举管状、检测板状、过滤器状、盘状、珠状等。另外， 材质可以是通常的免疫测定法用支撑体所用的材质，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚丙烯腈、尼龙等合成树脂、或者在所述合成树脂中引入磺基、氨基等反应性官能团而得到的物质。另外，也可以是玻璃、多糖类或其衍生物(纤维素、硝酸纤维素等)、硅胶、多孔陶瓷、金属氧化物等。另外，支撑体可以是胶体金(金纳米粒子)、乳胶珠。另外，支撑体也可以是作为生物分子的蛋白质、抗体、脂质等生物分子、寡核苷酸。
第二步骤中的“使检测复合物固定在支撑体上”时，可以通过使该被测寡核苷酸与不妨碍其与该复合检测寡核苷酸的结合且与该被测寡核苷酸互补结合、并且能够与支撑体结合的特定寡核苷酸互补结合，将检测复合物固定在支撑体上。使特定寡核苷酸与支撑体结合时，特定寡核苷酸只要具有与支撑体结合的功能和能够与被测寡核苷酸互补结合的序列即可。
作为本发明的第二步骤中的“形成检测复合物”的方法，具体而言，例如，在获得含有使用至第3寡核苷酸的复合检测寡核苷酸与被测寡核苷酸的检测复合物的情况下，在包含被测寡核苷酸的基因组DNA水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1，基因组DNA的情况下，优选预先用适当的限制性内切酶处理，将DNA片段化)中，加入通过互补性与被测寡核苷酸结合的第1寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通过互补性与第1寡核苷酸结合的第2寡核苷酸水溶液 (0. 02 μ Μ)和通过互补性与第2寡核苷酸结合的第3寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ,此时第3 寡核苷酸成为末端寡核苷酸)各5 μ L，再加入IOOmM的MgCl2 20 μ L以及最适IOX缓冲液 (330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ 1，然后向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100μ L，在95°C加热10分钟，在70°C保温10分钟， 在50°C保温10分钟后，在37°C进行10分钟冷却处理即可。另外，上述方法中的第1寡核苷酸 末端寡核苷酸中，至少一个以上的寡核苷酸必须为甲基化寡核苷酸。也可以全部寡核苷酸均为甲基化寡核苷酸。上述中，说明了使用至第3寡核苷酸的情况，在使用至第N寡核苷酸的情况下通过与上述同样的方法实施即可。
本发明中的“特定寡核苷酸”是指，具有能够通过互补性与包含目标DNA区域的 DNA结合的碱基序列的寡核苷酸，并且，只要具有与支撑体结合的功能即可。具体而言，具有与包含目标DNA区域的DNA互补结合的特定接合序列，且与上述支撑体结合。另外，“特定寡核苷酸”优选不妨碍复合检测寡核苷酸与被测寡核苷酸的结合，并且优选不妨碍复合检测寡核苷酸的形成。并且，优选不与样本中所含的核酸或其它寡核苷酸的碱基序列互补结合。
“特定接合序列”是指，含有与具有目标DNA区域的碱基序列(被测寡核苷酸)互补的碱基序列的寡核苷酸。特定接合序列能够配对的被测寡核苷酸的碱基序列的互补碱基序列，与特定接合序列的碱基序列具有75%以上、优选90%以上的同源性。特定接合序列的碱基序列的长度为5bp lOObp、优选IObp 50bp即可。另外，特定接合序列不妨碍检测用接合序列与目标DNA区域的结合即可。另外，“特定接合序列”优选为与基因组中的重复序列结合的碱基序列，更优选在同一重复序列中设计有检测用接合序列的碱基序列。另外，在同一重复序列中设计的检测用接合序列和特定接合序列优选不妨碍彼此与被测寡核苷酸的结合。
为了将特定寡核苷酸固定在支撑体上，具体而言，可以列举将特定寡核苷酸的5’ 末端或3’末端生物素化而得到的生物素化寡核苷酸固定于用链霉亲和素包被的支撑体 (例如，用链霉亲和素包被的PCR管、用链霉亲和素包被的磁珠、用链霉亲和素部分包被的层析条等)上的方法。
也有在特定寡核苷酸的5’末端或3’末端共价结合具有氨基、硫醇基、醛基等活性官能团的分子后，使其与表面经硅烷偶联剂等活化的玻璃、多糖类衍生物、硅胶、或前述合成树脂等、或耐热性塑料制的支撑体共价结合的方法。另外，对于共价结合，例如，通过5 个甘油三酯串联连接而成的间隔物、交联剂等进行共价结合。另外，还可以列举在玻璃或硅制的支撑体上直接自特定寡核苷酸的末端侧进行化学合成的方法。
第三步骤是利用复合检测寡核苷酸的识别功能对第二步骤中形成的检测复合物中所含的复合检测寡核苷酸进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的步骤。
作为本发明的第三步骤中的“利用复合检测寡核苷酸的识别功能对检测复合物中所含的复合检测寡核苷酸进行检测”的方法，例如，(1)利用甲基化寡核苷酸作为被测检测寡核苷酸的情况下，使可与甲基化DNA抗体结合的铕(以下有时也记作“Eu”)标记的抗体 (二次抗体)与结合有检测复合物的链霉亲和素培养皿结合，添加增强溶液(Perkin Elmer 公司制)后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光即可。也可以使用FITC标记代替Eu标记。另外，也可以使FITC标记的抗体(二次抗体)进一步与HRP标记的FITC抗体结合，并利用HRP的酶活性进行检测。在利用HRP的酶活性进行检测的情况下，添加底物(R&D公司、#DY999)并在室温下孵育，然后添加终止溶液(1M KSO4JOyL/孔)，测定450nm(参比值650nm)的吸光即可。
(2)例如，在前述的方法具体例中得到的结合在链霉亲和素培养皿上的检测复合物中添加适当量(例如，4 μ g/mL溶液、100 μ L/孔)的甲基化DNA抗体，然后，在室温下静置例如约3小时，促进甲基化DNA抗体与复合检测寡核苷酸中所含的甲基化DNA的结合。 然后，进行残留溶液的除去和洗涤。以例如300 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液(例如，含 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7·4))，并除去溶液。重复数次该洗涤操作，使结合有甲基化DNA抗体的检测复合物残留在孔上。另外，洗涤缓冲液只要适于将上述的游离的甲基化DNA抗体、溶液中漂浮的单链DNA等除去即可，不限于上述洗涤缓冲液，也可以是DELFIA缓冲液(PerkinElmer公司制、含Tween 80的 Tris-HCUpH 7. 8)、TE 缓冲液等。
(3)例如，在链霉亲和素培养皿的各孔中添加甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology 公司制、0· 5μ g/mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImMKH2PO4、3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]100 μ L，并在室温下放置1小时。然后，通过移液操作去除溶液，将各孔用 200 μ L 洗涤缓冲液[含 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl pH7. 4)]洗涤3次。再添加抗甲基化DNA抗体的二次抗体(例如，Eu-Nl标记的小鼠IgG抗体，PerkinElmer公司制)，在室温下静置约1小时，促进二次抗体与复合物的结合。然后，添加增强溶液(PerkinElmer公司制)并混合，并在室温下静置例如约45分钟。然后，用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光612nm)，由此对甲基化DNA抗体进行检测或定量。
或者，在链霉亲和素培养皿上结合的检测复合物中，以IOOyL/孔的比例添加调节为2 μ g/mL的FITC标记的小鼠IgG抗体(山羊)作为二次抗体，在室温下静置1小时后，除去残留溶液，以200 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作。再以100 μ L/孔的比例在链霉亲和素包被的培养皿中添加抗FITC的三次抗体 (例如，HRP 标记的 FITC 抗体，Jackson ImmunoResearchLaboratories 公司制)，并在室温下孵育。以200 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液 (ImM KH2PO4、3mMNa2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作。以 100 μ L/孔的比例添加底物(R&D公司、#DY999)，并搅拌约10秒钟。在室温下孵育，添加终止溶液(1M H2SO4,50 μ L/孔)，并搅拌约10秒钟。在30分钟以内测定450nm(参比值650nm) 的吸光(优选避光)。
本发明中，作为对具有目标RNA区域的RNA进行定量或检测的方法，首先，从生物来源样本获取具有目标RNA区域的RNA即可。
例如，具体而言，为了从生物来源样本获得RNA，使用例如市售的RNA抽提用试剂盒等抽提RNA即可。
接着，使和能够与具有目标RNA区域的RNA互补结合的被测检测寡核苷酸的结合物，固定在该支撑体上，利用被测检测寡核苷酸的识别功能进行检测即可。为了使含有该具有目标RNA区域的RNA与该被测检测寡核苷酸的检测复合物固定在支撑体上，在形成该检测复合物时添加能够与构成检测复合物的该具有目标RNA区域的RNA互补结合、并且具有与支撑体结合的功能的特定寡核苷酸，形成含有该具有目标RNA区域的RNA、该被测检测寡核苷酸和该特定寡核苷酸的复合物，并固定在支撑体上即可。
为了“形成含有该具有目标RNA区域的RNA、该被测检测寡核苷酸和该特定寡核苷酸的复合物”，例如，使从生物来源样本中抽提的RNA形成下述检测复合物与生物素化特定寡核苷酸构成的复合物而固定在支撑体上即可，所述检测复合物由第1寡核苷酸至第3寡核苷酸所形成的“直链型”的复合检测寡核苷酸与该具有目标RNA区域的RNA互补结合而成。具体而言，在包含该RNA的水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1，用不含RNA酶的水溶液制备。具体而言，使用在120个气压下处理20分钟后的水等，制备水溶液等)中，添加通过互补性与该RNA结合的第1寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通过互补性与第1寡核苷酸结合的第2寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)、通过互补性与第2寡核苷酸结合的第3寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ, 此时，第3寡核苷酸成为末端寡核苷酸)、不妨碍该RNA与该复合检测寡核苷酸的结合且与该RNA互补结合的生物素化特定寡核苷酸(0. 02 μ Μ)各5 μ L，使用所得的溶液制备混合液 (包含50%甲酰胺、5XSSC(150mM的NaCl、15mM的柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(ρΗ7· 6)、 5 X Denhardt，s液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml的变性剪切鲑鱼精子DNA)，将该混合液的液量调节为100μ L，在95°C加热10分钟，在70°C保温10分钟，在50°C保温10分钟后，在 37°C进行10分钟冷却处理，得到检测复合物与特定寡核苷酸互补结合而成的特定检测复合物。另外，该混合液为一般的杂交溶液，是Molecular Cloning,A Laboratory Manual (分子克隆试验指南)，第二版，冷泉港实验室(1989)中记载的公知的杂交方法中使用的溶液。
为了使“含有该具有目标RNA区域的RNA、该被测检测寡核苷酸和该特定寡核苷酸的复合物"‘固定在支撑体上”，具体而言，使生物素化特定寡核苷酸和由第1寡核苷酸至第3 寡核苷酸形成的“直链型”的复合检测寡核苷酸与该具有目标RNA区域的RNA互补结合而成的检测复合物互补结合，将所得的复合物转移到链霉亲和素培养皿中，在室温下静置30分钟即可。然后，进行残留溶液的除去和洗涤。以200 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如， 含有 0.05%Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作，残留(选择)通过特定寡核苷酸结合在链霉亲和素培养皿上的检测复合物。另外，上述方法中的第1寡核苷酸 末端寡核苷酸中，至少一个以上的寡核苷酸必须为甲基化寡核苷酸。也可以全部寡核苷酸均为甲基化寡核苷酸。上述中，说明了使用至第3寡核苷酸的情况，在使用至第N寡核苷酸的情况下通过与上述同样的方法实施即可。将被测甲基化寡核苷酸复合物固定化(选择)时，只要最终形成被测甲基化寡核苷酸复合物并将其固定化(选择)即可，因此，虽然上述方法中是同时添加被测寡核苷酸、 生物素化特定寡核苷酸、甲基化寡核苷酸(复合物)而获得该复合物，然后使用生物素化特定寡核苷酸进行固定(选择)，但其顺序并没有特别限制。即，也可以先将生物素化特定寡核苷酸固定于链霉亲和素培养皿上，然后，添加被测寡核苷酸和甲基化寡核苷酸(复合物) 而获得被测甲基化寡核苷酸复合物，从而进行固定(选择)。
本发明中，作为对具有目标RNA区域的RNA进行定量或检测的方法，为了对“使生物素化特定寡核苷酸与由所述第1寡核苷酸至第3寡核苷酸所形成的“直链型”的复合检测寡核苷酸与该具有目标RNA区域的RNA互补结合而成的检测复合物互补结合而得到的复合物”进行定量或检测，利用被测检测寡核苷酸的识别功能即可。具体而言，在链霉亲和素培养皿的各孔中添加甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/mL含0. 1 % BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20U54mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L，并在室温下放置1小时。然后，通过移液操作去除溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。再添加抗甲基化DNA抗体的二次抗体(例如，Eu-m标记的小鼠IgG抗体，PerkinElmer公司制)， 在室温下静置约1小时，促进二次抗体与复合物的结合。然后，添加增强溶液(PerkinElmer 公司制)并混合，并在室温下静置例如约45分钟。然后，用荧光检测器测定荧光(激发 340nm/荧光612nm)，由此对甲基化DNA抗体进行检测或定量，从而能够得到生物来源样本中所含的、该RNA的目标区域的相关测定值。
本发明可以用于下述场合。
各种疾病中，通过对与各种疾病的程度显示相关性的RNA本身、以该RNA为模板制作的DNA或与各种疾病的程度显示相关性的DNA等进行定量或检测，能够推测各种疾病的程度。例如，在癌症等的诊断中，通过血液中的游离DNA的定量，可以作为定期体检中的筛选检查来利用。在感染症等中，通过对致病的细菌、病毒的DNA、RNA、以该RNA为模板利用逆转录酶制作的DNA进行定量或检测，能够确定病原菌或致病病毒。另外，对于迄今为止由于微量而需实施PCR等将DNA扩增后再进行检测的DNA、或利用逆转录酶合成DNA来进行检测的RNA等，通过本发明即使不进行PCR等繁杂的方法也能够检测DNA。另外，即使不用逆转录酶合成DNA也能够进行RNA的定量或检测。
作为血液、尿等生物试样中所含的微量物质的检测或定量方法，通用免疫学测定方法。该免疫学测定方法中，利用层析法的所谓免疫层析法操作简单，检测所需的时间也短，因此，目前广泛用于例如医院的临床检查、研究室的检验试验等多种场合。另外，近年来，开始使用通过将标记的DNA(基因)在层析条上展开，并使用能够捕获目标DNA(基因) 的探针进行杂交来检测目标DNA(基因)的、所谓的杂交层析法。该方法也操作简便，检验所需的时间也短，因此目前开始广泛用于医院的临床检查、研究室的检验试验等场合。本发明测定方法中，在概念上使上述的免疫层析法与杂交层析法的混合方法成为可能。本发明的测定方法中，关于复合物形成和复合物获取的顺序没有特别限制，因此可以使用各种方法。 具体而言，例如如下实施即可。
例如，在刚结束第二步骤后的试样中添加生物素化特定寡核苷酸和具有识别功能的检测寡核苷酸，使包含目标DNA区域的甲基化的单链DNA、具有识别功能的检测寡核苷酸与生物素化特定寡核苷酸结合，形成包含目标DNA区域的单链DNA、具有识别功能的检测寡核苷酸与生物素化特定寡核苷酸结合而成的检测复合物。将所得的试样滴加(导入)到层析条的导入部时，所述复合物由于毛细管现象沿展开部移动，并被预先用链霉亲和素包被的部分捕获。然后，基于检测寡核苷酸的识别功能对所得的复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测或定量，由此能够对具有目标DNA区域的DNA进行检测或定量。
也可以使目标DNA区域中存在多个检测部位(使用分别能够与不同的目标DNA区域互补结合的检测寡核苷酸)，依次检测或定量各目标DNA区域，另外，为了与多个目标DNA 区域形成复合物，使用同时检测基因组中的重复序列、重复基因或多个不同基因的、能够与多个目标DNA区域互补结合的检测寡核苷酸，也能够飞跃性地提高检测灵敏度。另外，在一个目标区域中设计多数的检测寡核苷酸，将它们用于支撑体一侧或检测一侧，也能够飞跃性地提高检测灵敏度。
作为实施使检测寡核苷酸、生物素化特定寡核苷酸及目标DNA区域或目标RNA区域形成复合物并结合到支撑体上的过程的方法，并不限于前述的方法，只要是使用免疫抗体法的方法即可。例如，在ELISA法中，使用与层析条法同样的原理，因而可以按照记载的顺序实施形成复合物并结合到支撑体上的过程。
这样的本发明中的甲基化寡核苷酸等，作为检测用试剂盒的试剂有用。另外，本发明的专利保护范围也包括利用该方法的实质性原理而得到的前述那样的检测用试剂盒等形态的应用。
从数据库中公开的碱基序列中，可以查找微生物特有的碱基序列。例如，如果是 PubMed等公开数据库中存在的碱基序列，则可以通过通常的手续获得，获得的碱基序列通过按照通常的手续用Blast进行检索，能够研究其是否为特有的碱基序列。另外，特有的碱基序列是指，检测对象的碱基序列不具有与检测对象微生物以外的生物来源的碱基序列显示同源性的碱基序列。
特别是在样本为人体活检样品的情况下，设计不与人基因互补结合的特定寡核苷酸是很重要的。另外，同样地，在样本为食品的情况下，设计不与食品中所含的检测对象以外的生物来源的碱基序列互补结合的接合用碱基序列、特定碱基序列是很重要的。
在想要研究某个区域中的重复序列的情况下，难以用PubMed等一般的序列检索数据库进行检索，通常使用 Repbase (www. girinst. org/repbase/)、RepeatMasker (www. repeatmasker. org/)等数据库即可。如果设定本发明的特定接合序列和检测用接合序列， 则能够提高检测灵敏度。另外，这些重复序列的测定例如可以作为血液中的游离DNA量的替代标志物来处理，在关注于生物种类特异性的重复序列的情况下，可以用于生物种类的确定等。
本发明方法中的“使用了复合检测寡核苷酸的样本的标记方法”是指，通过结合由多个寡核苷酸互补结合而成的复合检测寡核苷酸来对被测寡核苷酸进行标记的方法。例如，利用检测甲基化DNA作为复合检测寡核苷酸的识别功能的方法的情况下，理论上可以在复合检测寡核苷酸上无上限地设计甲基化DNA，因此，可以期待与复合检测寡核苷酸上设计的甲基化DNA数相关的检测灵敏度的增加。本发明的方法包含通过像这样使用复合检测寡核苷酸来增加检测灵敏度的方法。
检测寡核苷酸可以含有1个甲基化寡核苷酸，此时，可以期待与检测寡核苷酸上设计的甲基化DNA数相关的检测灵敏度的提高。即，本发明的方法中，通过使用甲基化寡核苷酸作为检测寡核苷酸，与所述复合检测寡核苷酸带来的检测灵敏度提高同样地，可以期待与检测寡核苷酸上设计的甲基化DNA数相关的检测灵敏度的提高。
本发明的方法中，“使用复合检测寡核苷酸和能够标记该复合检测寡核苷酸的试剂的样本的标记方法”中，也包含将使用复合检测寡核苷酸的标记方法与复合检测寡核苷酸的识别功能组合的任何方法。例如，在复合检测寡核苷酸的识别功能利用甲基化DNA的情况下、利用甲基化DNA抗体检测复合检测寡核苷酸的情况下，可以列举使用复合检测寡核苷酸和甲基化DNA抗体的标记方法。例如，在使复合检测寡核苷酸与荧光标记的寡核苷酸互补结合而进行标记的情况下，可以列举使用复合检测寡核苷酸和荧光标记的寡核苷酸的标记方法。
实施例 以下，通过实施例详细地说明本发明，但是本发明不限于这些实施例。
实施例1 作为被测寡核苷酸，合成含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸，制备以下的 TE缓冲溶液。
溶液A 被测寡核苷酸Opmol/lO μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 溶液B 被测寡核苷酸0. 001pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液C 被测寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 〈被测寡核苷酸〉 5 ’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列号 1) 作为用于获得被测寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列号2所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列号 2) 为了检测被测寡核苷酸，作为一般的DNA检测中使用的荧光修饰寡核苷酸(对照 1处理组用)，合成1个部位能够结合荧光素抗体的、含有序列号3所示的碱基序列的5’末端FITC化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<5’末端FITC化寡核苷酸> 5，-FITC-TGACATTCTCGATGGTGTCACT-3，(序列号 3) 另外，为了检测被测寡核苷酸，作为一般的DNA检测中使用的荧光修饰寡核苷酸 (对照2处理组用)，合成1个部位能够结合荧光素抗体的、含有序列号4所示的碱基序列的3’末端FLC化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<3 ’末端FLC化寡核苷酸> 5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACACAGACAACGCCTCGTTCTCGG-FLC-3，(序列号4) 作为用于检测被测寡核苷酸的、通过互补性与被测寡核苷酸结合的甲基化寡核苷酸(第1寡核苷酸、X处理组用)，合成1个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号5 所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ1，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<甲基化寡核苷酸Μ1>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACANAGACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列号5) 作为用于检测被测寡核苷酸的、通过互补性与被测寡核苷酸结合的甲基化寡核苷酸(第1寡核苷酸、Y处理组用)，合成12个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号 6所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ12�。票�0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<甲基化寡核苷酸Μ12Α>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTNANANANANANANANANANANANAGACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列号6) 对于上述所得到的被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和甲基化(或荧光修饰)寡核苷酸溶液，进行以下四种处理(对照1处理组、对照2处理组、X处理组、Y处理组)。
<对照1处理组> 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5 μ L、上述的5，末端FITC化寡核苷酸溶液5 μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫苏糖醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100 μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与5’末端FITC化寡核苷酸形成双链(即，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与5’末端FITC化寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟， 迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
<对照2处理组> 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5 μ L、上述的3，末端FLC化寡核苷酸溶液5 μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与3’末端FLC化寡核苷酸形成双链(即，形成被测寡核苷酸、 特定寡核苷酸与3’末端FLC化寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温 10分钟，然后恢复到室温。
〈X处理组> 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5 μ L、上述的甲基化寡核苷酸Ml溶液5 μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫苏糖醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100 μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与甲基化寡核苷酸Ml形成双链(S卩，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与甲基化寡核苷酸Ml的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟，迅速冷却到 700C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟， 然后恢复到室温。
〈Y处理组> 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5口1^、上述的甲基化寡核苷酸机24溶液5 4 1^、缓冲液(3301111 Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与甲基化寡核苷酸M12A形成双链(S卩，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与甲基化寡核苷酸M12A的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得混合物全部转移到经链霉亲和素包被的8孔条板(strip)中，在室温下放置约30分钟，使被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与甲基化(或荧光修饰)寡核苷酸的复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用 200 μ L 洗涤缓冲液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
之后的操作分别对对照1处理组和对照2处理组、及X处理组和Y处理组进行如下的不同处理。
对对照1处理组和对照2处理组(使用5’末端FITC化寡核苷酸和3’末端FLC 化寡核苷酸的情况)进行以下的处理。
在各孔中以100 μ L的比例添加抗体溶液[过氧化物酶标记小鼠抗荧光素IgG单克隆抗体、Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0· 1 μ g/mL 含 0· BSA 的憐酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室温下放置 1 小时。然后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加底物(R&D公司制、#DY999)并混合，使反应开始。
在室温下放置约5分钟，在各孔中以50 μ L的比例添加终止溶液(IN H2SO4水溶液)，使反应停止。反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。
对X处理组和Y处理组(使用甲基化寡核苷酸Ml和甲基化寡核苷酸M12A的情况)进行以下的处理。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗体溶液[甲基胞嘧啶抗体、AVIVA公司制、 1 μ g/mL 含 0. 1% BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室温下放置1小时。然后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，在各孔中以100μ L的比例添加第二抗体溶液[小鼠IgG抗体FITC(山羊来源)、MBL 公司制、2 μ g/mL 含 0· 1 % BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]，然后在室温下放置1小时。放置后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3次。
在各孔中以IOOyL的比例添加第三抗体溶液[过氧化物酶标记小鼠抗荧光素 IgG 单克隆抗体(Peroxidase-conjugated IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Fluorescein)、Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司制、0. 1 μ g/mL 含 0. 1 % BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室温下放置1小时。然后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加底物(R&D公司制、#DY999)并混合，使反应开始。
在室温下放置约5分钟，在各孔中以50 μ L的比例添加终止溶液(IN H2SO4水溶液)，使反应停止。反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。
数据的分析使用以下的方法。为了使阴性对照液的值在所有的组中为一定的值， 用各测定值除以各组的阴性对照液的测定值，再乘以所有组中阴性对照液的最小值。然后， 从各值中减去所有组中阴性对照液的最小值，将其作为校正值使用。
[校正值]=[测定值]X[最小值]/[各组阴性对照液的值]-[最小值] 结果如图1所示。本实施例中，对照1处理组、对照2处理组和X组中的检测灵敏度大致为同等程度。因此可知，如果甲基胞嘧啶抗体所能结合的部位为1个部位(甲基化胞嘧啶为1个)，则与现有检测法的检测灵敏度没有太大差异。在使用具有多个能结合甲基胞嘧啶抗体的部位(12个部位)的甲基化寡核苷酸的Y处理组中，可知与对照1处理组、对照2处理组和X组相比检测灵敏度高。即表明使用具有多个能结合甲基胞嘧啶抗体的部位(存在多个甲基化胞嘧啶)的寡核苷酸时，检测灵敏度提高。
实施例2 作为被测寡核苷酸，合成含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸，制备以下的 TE缓冲溶液。
溶液A 被测寡核苷酸Opmol/lO μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 溶液B 被测寡核苷酸0. 0001pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液C 被测寡核苷酸0. 001pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液D 被测寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 <被测寡核苷酸> 5 ’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列号 1) 作为用于获得被测寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列号2所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列号 2) 作为用于检测被测寡核苷酸的、通过互补性与被测寡核苷酸结合的甲基化寡核苷酸(第1寡核苷酸、X处理组用)，合成含有序列号5所示的碱基序列的、1个部位能够结合荧光素抗体的甲基化寡核苷酸Ml，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<甲基化寡核苷酸Μ1>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACACACACACANAGACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列号5) 作为用于检测被测寡核苷酸的、通过互补性与被测寡核苷酸结合的甲基化寡核苷酸(第1寡核苷酸、Y处理组用)，合成含有序列号6所示的碱基序列的、12个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的甲基化寡核苷酸Μ12�。票�0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<甲基化寡核苷酸Μ12Α>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTNANANANANANANANANANANANAGACAACGCCTCGTTCTCGG-3’(序列号6) 对于所得的被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和甲基化寡核苷酸溶液，进行以下两种处理(X处理组、Y处理组)。
〈X处理组〉 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5 μ L、上述的甲基化寡核苷酸Ml溶液5 μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫苏糖醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100 μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与甲基化寡核苷酸Ml形成双链(S卩，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与甲基化寡核苷酸Ml的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟，迅速冷却到 70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟， 然后恢复到室温。
〈Y处理组> 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液 5μ L、上述的甲基化寡核苷酸Μ12Α溶液5μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与甲基化寡核苷酸M12A形成双链(S卩，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与甲基化寡核苷酸M12A的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得混合物全部转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约30 分钟，使被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与甲基化寡核苷酸的复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP047H20U54mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗体[甲基胞嘧啶抗体、AVIVA公司制、1 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mMNa2HP047H20,154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室温下放置1小时。然后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，在各孔中以IOOyL的比例添加第二抗体[小鼠IgG抗体Eu-Nl、0. 25 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 然后在室温下放置1小时。放置后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
在各孔中以200μ L的比例添加增强溶液并混合，在室温下用板振荡器(plate shaker)振荡5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
数据的分析使用以下的方法。为了使阴性对照液的值在所有的组中为一定的值， 用各测定值除以各组的阴性对照液的测定值，再乘以所有组中阴性对照液的最小值。然后， 从各值中减去所有组中阴性对照液的最小值，将其作为校正值使用。
[校正值]=[测定值]X[最小值]/[各组阴性对照液的值]-[最小值] 结果如图2所示。本实施例中，在使用具有多个能结合甲基胞嘧啶抗体的部位(12 个部位)的甲基化寡核苷酸的Y组中，可知与X组相比检测灵敏度高。即表明使用具有多个能结合甲基胞嘧啶抗体的部位(存在多个甲基化胞嘧啶)的寡核苷酸时，检测灵敏度提尚O 实施例3 作为被测寡核苷酸，合成含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸，制备以下的 TE缓冲溶液。
溶液A 被测寡核苷酸Opmol/lO μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 溶液B 被测寡核苷酸0. 003pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液C 被测寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液D 被测寡核苷酸0. 03pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 <被测寡核苷酸> 5 ’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列号 1) 作为用于获得被测寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列号2所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列号 2) 作为用于检测被测寡核苷酸的、通过互补性与被测寡核苷酸结合的寡核苷酸，合成含有序列号7所示的碱基序列的、3个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的甲基化寡核苷酸 (第1寡核苷酸)，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。该第1寡核苷酸在3’末端具有作为接合碱基序列的第1接合碱基序列。
<第1寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5，-TGACATTCTCGATGGTGTCACTANACANACANATGCGCACCGTGCGCGAGC-3'(序列号 7) 作为用于检测被测寡核苷酸的、具有含有能够与第1接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第1接合碱基序列(通过互补性与第1寡核苷酸结合)的寡核苷酸，合成含有序列号8所示的碱基序列的、未甲基化的寡核苷酸(第2寡核苷酸)，制备0. lpmoL/5 μ L 的TE缓冲溶液。该第2寡核苷酸在5’末端具有作为接合碱基序列的第2接合碱基序列。
<第2寡核苷酸> 5，-ATAGTCTCGTGGTGCGCCGTACACACACACAGCTCGCGCACGGTGCGCA-3，(序列号 8) 作为用于检测被测寡核苷酸的、具有含有能够与第2接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第2接合碱基序列(通过互补性与第2寡核苷酸结合)的寡核苷酸，合成含有序列号9所示的碱基序列的、3个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的甲基化寡核苷酸(第3 寡核苷酸)，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<第3寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5，-ACGGCGCACCACGAGACTATANACANACANACAGACACAGACTGGCAAGTTGGA-3，(序列号 9) 使用所得的被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸、第2寡核苷酸、第3寡核苷酸溶液，进行以下三种处理(处理法1、2和3)。
处理法1 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5yL、上述的第1寡核苷酸溶液5yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA 溶液 10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与第1寡核苷酸形成双链(即，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与第1寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟， 迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
处理法2 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10yL、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、第2寡核苷酸溶液5 μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA 溶液10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100 μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与第1 寡核苷酸形成双链，并且同时使第1寡核苷酸与第2寡核苷酸形成双链(即，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第2寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C加热10 分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
处理法3 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液、第2寡核苷酸溶液、第3寡核苷酸溶液各5 μ L、 缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、 lmg/mLBSA溶液10 μ L、IOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 100 μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与第1寡核苷酸形成双链，并且同时使第1寡核苷酸与第2寡核苷酸形成双链，并且同时使第2寡核苷酸与第3寡核苷酸形成双链(即，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第 1寡核苷酸、第2寡核苷酸和第3寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温 10分钟，然后恢复到室温。
将处理法1、2和3所得的混合物全部转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约30分钟，使被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和第1寡核苷酸、和/或第2寡核苷酸、和/或第3寡核苷酸的复合物固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用 200 μ L 洗涤缓冲液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗体溶液[甲基胞嘧啶抗体、AVIVA公司制、 1 μ g/mL 含 0. 1% BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室温下放置1小时。然后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，在各孔中以100 μ L的比例添加第二抗体[小鼠IgG抗体Eu-NUO. 25 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 然后在室温下放置1小时。放置后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
在各孔中以200 μ L的比例添加增强溶液并混合，在室温下用板振荡器振荡5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
数据的分析使用以下的方法。为了使阴性对照液的值在所有的组中为一定的值， 用各测定值除以各组的阴性对照液的测定值，再乘以所有组中阴性对照液的最小值。然后， 从各值中减去所有组中阴性对照液的最小值，将其作为校正值使用。
[校正值]=[测定值]X[最小值]/[各组阴性对照液的值]-[最小值] 结果如图3所示。在为了检测被测寡核苷酸而仅使用第1寡核苷酸的情况下(处理法1)和使用第1寡核苷酸与第2寡核苷酸的情况下(处理法2)，检测灵敏度未见差异。 认为这是由于使用未甲基化的寡核苷酸作为第2寡核苷酸，S卩，甲基胞嘧啶抗体能结合的部位(甲基化胞嘧啶)数量相同，因而检测灵敏度为同等程度。在为了检测被测寡核苷酸而使用第1寡核苷酸、第2寡核苷酸和第3寡核苷酸的情况下(处理法3)，可知检测灵敏度提高。认为这是由于被测寡核苷酸上连接有第1寡核苷酸、第2寡核苷酸和第3寡核苷酸， 因而具有多个能结合甲基胞嘧啶抗体的部位(甲基化胞嘧啶)。
实施例4 作为被测寡核苷酸，合成含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸，制备以下的TE缓冲溶液。
溶液A 被测寡核苷酸OpmoL/lO μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 溶液B 被测寡核苷酸0. 003pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液C 被测寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液D 被测寡核苷酸0. 03pmol/10 μ L TE缓冲溶液 〈被测寡核苷酸〉 5 ’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列号 1) 作为用于获得被测寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列号2所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列号 2) 作为用于检测被测寡核苷酸的、通过互补性与被测寡核苷酸结合的、未甲基化的寡核苷酸(第1寡核苷酸)，合成含有序列号10所示的碱基序列的寡核苷酸(第1寡核苷酸)，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。该第1寡核苷酸具有作为接合碱基序列的第(1、 1)接合碱基序列和第(1、2)接合碱基序列。
<第1寡核苷酸> 5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACTCGCTTCGCGGGCAGTCAACACACACACACA GACAACGCCTCGTTCTCGG-3，(序列号 10) 作为用于检测被测寡核苷酸的、具有含有能够与第(1、1)接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第(1、1)接合碱基序列(通过互补性与第1寡核苷酸结合)的寡核苷酸 (第(2、1)寡核苷酸)，合成含有序列号11所示的碱基序列的、12个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的甲基化寡核苷酸(第(2、1)寡核苷酸)，制备0. lpmoL/5yL的TE缓冲溶液。
〈第(2、1)寡核苷酸〉N表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -AGCCGACGAAGGGCTTATTAGNANANANANANANANANANANANACCGAGAACGAGGCGTTGTCT-3’(序列号11) 作为用于检测被测寡核苷酸的、具有含有能够与第(1、2)接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第(1、2)接合碱基序列(通过互补性与第1寡核苷酸结合)的寡核苷酸(第(2、2)寡核苷酸)，合成作为甲基化寡核苷酸的、含有序列号16所示的碱基序列的、12个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的甲基化寡核苷酸(第(2、2)寡核苷酸)，制备 0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
〈第(2、2)寡核苷酸〉N表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGOANANANANANANANANANANANATTGACTGCCCGCGAAGCGAG-3’(序列号16) 使用所得的被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸、第(2、1)寡核苷酸、第 (2,2)寡核苷酸溶液，进行以下三种处理(处理法1、2和3)。
处理法1 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第(2、1)寡核苷酸溶液5 μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA溶液IOyLUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 100 μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与第1寡核苷酸形成双链，并且同时使第1寡核苷酸与第(2、1)寡核苷酸形成双链 (即，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第(2、1)寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到 50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
处理法2 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第(2、2)寡核苷酸溶液5 μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mMK0Ac、IOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、lmg/ mL BSA溶液IOyLUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 100 μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与第1寡核苷酸形成双链，并且同时使第1寡核苷酸与第(2、2)寡核苷酸形成双链 (即，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第(2、2)寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到 50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
处理法3 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第(2、1)寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第(2、2)寡核苷酸溶液5μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA 溶液 10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与第1寡核苷酸形成双链，并且同时使第1寡核苷酸与第(2、1)寡核苷酸及第(2、2)寡核苷酸形成双链(即，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸、第(2、1)寡核苷酸和第(2、2)寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C 加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的混合物全部转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约30 分钟，使被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第(2、1)寡核苷酸、和/或第(2、 2)寡核苷酸的复合物固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤3次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗体[甲基胞嘧啶抗体、AVIVA公司制、1 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4、3mMNa2HP04 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室温下放置1小时。然后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，在各孔中以IOOyL的比例添加第二抗体[小鼠IgG抗体Eu-Nl、0. 25 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 然后在室温下放置1小时。放置后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
在各孔中以200 μ L的比例添加增强溶液并混合，在室温下用板振荡器振荡5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
数据的分析使用以下的方法。为了使阴性对照液的值在所有的组中为一定的值， 用各测定值除以各组的阴性对照液的测定值，再乘以所有组中阴性对照液的最小值 。然后， 从各值中减去所有组中阴性对照液的最小值，将其作为校正值使用。
[校正值]=[测定值]X[最小值]/[各组阴性对照液的值]-[最小值] 结果如图4所示。在为了检测被测寡核苷酸而使用第1寡核苷酸与第(2、1)寡核苷酸的情况下(处理法1)和使用第1寡核苷酸与第(2、2)寡核苷酸的情况下(处理法2)， 检测灵敏度未见差异。认为这是由于甲基胞嘧啶抗体能结合的部位(甲基化胞嘧啶)数量相同。在为了检测被测寡核苷酸而使用第1寡核苷酸、第(2、1)寡核苷酸和第(2、2)寡核苷酸的情况下(处理法3)，可知检测灵敏度提高。认为这是由于通过在被测寡核苷酸上形成与第1寡核苷酸、第(2、1)寡核苷酸、第(2、2)寡核苷酸的复合物，而具有多个能结合甲基胞嘧啶抗体的部位(甲基化胞嘧啶)。
实施例5 作为被测寡核苷酸，合成含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸，制备以下的 TE缓冲溶液。
溶液A 被测寡核苷酸OpmoL/lO μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 溶液B 被测寡核苷酸0. 003pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液C 被测寡核苷酸0. 01pmoL/10 μ L TE缓冲溶液 溶液D 被测寡核苷酸0. 03pmol/10 μ L TE缓冲溶液 <被测寡核苷酸> 5’ -AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGA CTACAACATCCAGA-3，(序列号 1) 作为用于获得被测寡核苷酸的特定寡核苷酸，合成含有序列号2所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<5’末端生物素化寡核苷酸> 5，-生物素-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3，(序列号 2) 作为用于检测被测寡核苷酸的、通过互补性与被测寡核苷酸结合的寡核苷酸(第 1寡核苷酸)，合成含有序列号17所示的碱基序列的、3个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的甲基化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。该第1寡核苷酸具有作为接合碱基序列的第1接合碱基序列。
<第1寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -TGACATTCTCGATGGTGTCACTCACACACACACACTCGCTTCGCGGGCAGTCAACANACANACANA GACAACGCCTCGTTCTCGG-3，(序列号 17) 作为用于检测被测寡核苷酸的、具有含有能够与第1接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第1接合碱基序列(通过互补性与第1寡核苷酸结合)的寡核苷酸(第2寡核苷酸)，合成含有序列号16所示的碱基序列的、12个部位能够结合甲基胞嘧啶抗体的甲基化寡核苷酸，制备0. lpmoL/5 μ L的TE缓冲溶液。
<第2寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
5 ’ -GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGOANANANANANANANANANANANATTGACTGCCCGCGAAGCGAG-3’(序列号16) 使用所得的被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸、第2寡核苷酸溶液，进行以下两种处理(处理法1和2)。
处理法1 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10 μ L、上述的特定寡核苷酸溶液5yL、上述的第1寡核苷酸溶液5yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、lmg/mL BSA 溶液 10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与第1寡核苷酸形成双链(即，形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与第1寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在95°C加热10分钟， 迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
处理法2 在PCR管中添加上述制备的被测寡核苷酸溶液10yL、上述的特定寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第1寡核苷酸溶液5 μ L、上述的第2寡核苷酸溶液5 μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mMK0Ac、IOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、lmg/ mL BSA溶液IOyLUOOmM MgCl2溶液20 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 100 μ L，并混合。然后，为了使被测寡核苷酸与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使被测寡核苷酸与第1寡核苷酸形成双链，并且同时使第1寡核苷酸与第2寡核苷酸形成双链(即， 形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸、第1寡核苷酸和第2寡核苷酸的复合物)，将该PCR管在 95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10 分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得混合物全部转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约30分钟，使被测寡核苷酸和特定寡核苷酸和第1寡核苷酸、或者被测寡核苷酸和特定寡核苷酸、 第1寡核苷酸和第2寡核苷酸的复合物固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第一抗体溶液[甲基胞嘧啶抗体、AVIVA公司制、 1 μ g/mL 含 0. 1% BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室温下放置1小时。然后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，在各孔中以100μ L的比例添加第二抗体溶液[小鼠IgG抗体FITC(山羊来源)、MBL 公司制、2 μ g/mL 含 0· 1 % BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]，然后在室温下放置1小时。放置后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3次。
在各孔中以100 μ L的比例添加第三抗体溶液[过氧化物酶标记小鼠抗荧光素IgG 单克隆抗体、Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司帝[J、0. lyg/mL 含 0. 1%BSA 的憐酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]，并在室温下放置 1 小时。然后，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4, 3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
在各孔中以100 μ L的比例添加底物(R&D公司制、#DY999)并混合，使反应开始。
在室温下放置约5分钟，在各孔中以50 μ L的比例添加终止溶液(INH2SO4水溶液)，使反应停止。反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度。
数据的分析使用以下的方法。为了使阴性对照液的值在所有的组中为一定的值， 用各测定值除以各组的阴性对照液的测定值，再乘以所有组中阴性对照液的最小值。然后， 从各值中减去所有组中阴性对照液的最小值，将其作为校正值使用。
[校正值]=[测定值]X[最小值]/[各组阴性对照液的值]-[最小值] 结果如图5所示。在为了检测被测寡核苷酸而仅使用第1寡核苷酸的情况下(处理法1)和使用第1寡核苷酸与第2寡核苷酸的情况下(处理法2、，可知处理法2中检测灵敏度提高。认为这是由于通过在被测寡核苷酸上形成第1寡核苷酸与第2寡核苷酸的复合物，而具有多个能结合甲基胞嘧啶抗体的部位(甲基化胞嘧啶)。
产业实用性 根据本发明，能够提供简便且高灵敏度地定量或检测样本中所含的具有目标DNA 区域的DNA的方法等。
序列表自由文本 序列号1 设计的寡核苷酸 序列号2 为固定化而设计的生物素化寡核苷酸 序列号3 设计的FITC标记的寡核苷酸 序列号4 设计的FLC标记的寡核苷酸 序列号5 设计的寡核苷酸 序列号6 设计的寡核苷酸 序列号7 设计的寡核苷酸 序列号8 设计的寡核苷酸 序列号9 设计的寡核苷酸 序列号10 设计的寡核苷酸 序列号11 设计的寡核苷酸 序列号16 设计的寡核苷酸 序列号17 设计的寡核苷酸
权利要求
1. 一种DNA的定量或检测方法，所述DNA为样本中所含的、具有目标DNA区域的DNA， 其特征在于，包括如下步骤(1)第一步骤，制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有目标DNA区域的 DNA ；(2)第二步骤，将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸和与该被测寡核苷酸互补结合且具有多种识别功能的检测寡核苷酸混合，形成含有该被测寡核苷酸与该检测寡核苷酸的检测复合物，并使该检测复合物固定在支撑体上；和(3)第三步骤，利用检测寡核苷酸的识别功能对第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
2.如权利要求1所述的方法，其中，具有多种识别功能的检测寡核苷酸是由多个寡核苷酸互补结合而成的复合检测寡核苷酸、或含有具有多个甲基化位点的甲基化寡核苷酸的复合检测寡核苷酸。
3.如权利要求2所述的方法，其中，复合检测寡核苷酸含有具有甲基化DNA的寡核苷酸。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中，复合检测寡核苷酸的识别功能为所结合的甲基化DNA抗体的识别功能。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中，甲基化DNA为5-甲基胞嘧啶。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中，甲基化DNA抗体为甲基胞嘧啶抗体。
7.如权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，样本为下述任何一种生物来源样本(a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液或组织裂解液、(b)从由哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液和组织裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的DNA、(c)以从由哺乳动物来源的组织、细胞、组织裂解液和细胞裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的RNA为模板制作的DNA、(d)从细菌、真菌或病毒中抽提的DNA、或(e)以从细菌、真菌或病毒中抽提的RNA为模板制作的DNA。
8.—种样本的标记方法，其中，使用了权利要求2 7中任一项所述的方法中所用的复合检测寡核苷酸。
9.一种样本的标记方法，其中，使用了权利要求2 7中任一项所述的方法中所用的复合检测寡核苷酸和能够标记该复合检测寡核苷酸的试剂。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，标记对象为DNA或蛋白质。
11.如权利要求1 10中任一项所述的方法，其中，第二步骤中，通过不妨碍被测寡核苷酸与检测寡核苷酸的结合且能够与该被测寡核苷酸互补结合的特定寡核苷酸，使检测复合物与支撑体结合。
12.如权利要求1 11中任一项所述的方法，其中，具有目标DNA区域的DNA为下述任意一种具有目标DNA区域的DNA (a)预先用不以目标DNA区域作为识别切割位点的限制性内切酶进行消化处理后得到的 DNA、(b)预先进行纯化后得到的具有目标DNA区域的DNA、(C)血液中的具有目标DNA区域的游离DNA、(d)微生物基因组来源的具有目标DNA区域的DNA、或(e)利用逆转录酶从RNA生成的具有目标DNA区域的DNA。
13.一种DNA的定量或检测方法，所述DNA为样本中所含的、具有目标DNA区域的DNA， 其特征在于，包括如下步骤(1)第一步骤，制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有目标DNA区域的 DNA ；(2)第二步骤，将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸和与该被测寡核苷酸互补结合且含有甲基化寡核苷酸的检测寡核苷酸混合，形成含有该被测寡核苷酸与该检测寡核苷酸的检测复合物，并使该检测复合物固定在支撑体上；和(3)第三步骤，利用检测寡核苷酸的识别功能对第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，识别功能使用甲基化DNA抗体、甲基胞嘧啶抗体。
全文摘要
本发明涉及样本中所含的具有目标DNA区域的DNA的定量或检测方法等。
文档编号G01N33/53GK102186990SQ20098014073
公开日2011年9月14日 申请日期2009年8月18日 优先权日2008年8月19日
发明者冨原祥隆, 佐藤日出夫, 樽井弘和 申请人:住友化学株式会社
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