专利名称：二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明是涉及生物学免疫方法的测定技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
二亚甲基双氧安非他明俗称摇头丸(MDMA) (3,4-methylenedioxymethamphetami ne)，是安非他明类衍生物，是亚甲二氧基甲基苯丙胺的片剂，属中枢神经兴奋剂，是中国规定管制的精神药品。继鸦片、度冷丁、吗啡、海洛因、大麻等毒品在中国贩卖后，服用者大多是涉足舞厅的青少年。引发的社会问题极为严重。摇头丸是90年代初流行于欧美，是一种致幻性苯丙胺类毒品、是一类人工合成的兴奋剂，对中枢神经系统有很强的兴奋作用，服用后表现为活动过度、情感冲动、性欲亢进、嗜舞、偏执、妄想、自我约束力下降以及有幻觉和暴力倾向，具有很大的社会�：π裕蝗衔俏蠢词兰妥罹呶Ｏ盏亩酒�。像海洛因一样，MDMA给人造成的�：Γ似渥陨硗猓蔷褪撬锉吆械母髦衷又始安灰坏囊┢亮�。以我国市面上出现的“摇头丸”为例，经检测发现多数含有MDMA，或亚甲二氧基苯丙胺(MDA)，或甲基苯丙胺，掺杂物有兴奋剂咖啡因、麻黄素；麻醉药氯胺酮； 有的含有抗过敏药本海拉明；镇痛药非那西丁、扑热息痛、氨基比林、咪达唑仑；镇静催眠药苯巴比妥。再说剂量，欧洲的真正的MDMA的片剂，每片重量有的20mg，有的高达150mg。 我国的"摇头丸"的重量从200mg到300mg不等。滥用这样的药物，一旦出了问题，抢救起来也很困难。国内外有关MDMA的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效薄层色谱法(HPTLC)、酶联免疫法等方法，这些方法虽然检测的灵敏度较高，检测结果准确，但是需要昂贵的仪器设备，对检测材料的要求也高，需要提纯处理后才能进行，且需要培训专门的实验人员，另外这些方法均不适合高通量、现场的快速检测。因此研究具有快速、便携等优点的检测方法具有现实意义。本发明采用胶体金免疫层析技术，制备一种快速检测二亚甲基双氧安非他明的试剂盒。这种方法开始于上个世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的，是免疫亲和技术、印刷技术、免疫标记技术和层析技术的结合。这种方法不仅具有敏感、特异、便捷、快速等特点，而且适合基层和现场使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种便携、快速、适合于现场检测二亚甲基双氧安非他明的试剂盒，用于检测尿液中二亚甲基双氧安非他明的含量。本发明提供了一种二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒。包括样品垫(1)、紧密连接于样品垫一端的含有标记二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体的胶体金垫O)，与胶体金垫的另一端紧密相连的硝酸纤维素膜C3)和紧密连接于硝酸纤维素膜另一端的吸样垫G)。 硝酸纤维素膜包被了两条线，其中一条包被了二亚甲基双氧安非他明偶联抗原的检测线(T线)，一条包被了羊抗鼠IgG抗体的质控线(C线)。样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫粘贴在PVC支撑板( 上形成试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中形成卡型包装。本发明还提供了一种二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤(1)制备二亚甲基双氧安非他明偶联抗原将二亚甲基双氧安非他明与牛血清蛋白分子进行偶联，作为二亚甲基双氧安非他明偶联抗原。(2)制备二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体用二亚甲基双氧安非他明偶联抗原采用常规方法免疫制得二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体。(3)制备胶体金颗粒取0. 01%的氯金酸水溶液IOOmL,加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三钠水溶液0. 75mL,继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。(4)制备胶体金垫取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液6ml，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH 值调至8. 5，室温放置10分钟；逐滴加入蛋白浓度为4. 8mg/ml的二亚甲基双氧安非他明单抗0. 03ml，混合均勻，室温放置30分钟；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室温放置10分钟；11000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，用含5%蔗糖的 0. 002mol/LpH 8. 5的硼酸盐缓冲液6mL复溶，重复2次；最后用硼酸盐缓冲液溶解至3mL， 得到二亚甲基双氧安非他明单抗-胶体金标记物；将二亚甲基双氧安非他明单抗-胶体金标记物按ImL铺56cm2的比例均勻铺在无纺布上，再置干燥间，在温度38°C，湿度小于30% 的条件下干燥2-4小时，制成胶体金垫。(5)包被二亚甲基双氧安非他明偶联抗原、羊抗鼠IgG设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取0. 2mL浓度为1. Omg/ml的二亚甲基双氧安非他明偶联抗原、浓度为0. 8mg/ml的羊抗鼠IgG，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆二亚甲基双氧安非他明偶联抗原(T线)、羊抗鼠IgG(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥M小时，备用。(6)试剂盒的组装将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫由一端依次黏附在PVC支撑板上，即可形成检测二亚甲基双氧安非他明的试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中形成卡型包装。本发明采用层析式一步竞争法，运用二亚甲基双氧安非他明偶联抗原与被测样品中可能含有的二亚甲基双氧安非他明竞争结合金标二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体的原理检测二亚甲基双氧安非他明。检测样品时，样品因毛细管作用向吸样垫一端层析。若被测样品中含有二亚甲基双氧安非他明，它们将和检测线(T线)上包被的二亚甲基双氧安非他明偶联抗原竞争有限的抗体结合位点，当样品中的二亚甲基双氧安非他明达到一定浓度时，与胶体金标记的二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体发生免疫反应并完全饱和，此时胶体金复合物已无空余的位点和检测线上包被的二亚甲基双氧安非他明偶联抗原结合，此时T线不显色，此为阳性结果。若被测样品中不含二亚甲基双氧安非他明，标记了二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体的胶体金颗粒将随同样品层析至T线位置后，与T线上包被的二亚甲基双氧安非他明偶联抗原发生免疫结合反应，胶体金颗粒在T线位置堆积使得T线呈现出一条肉眼可见的红色条带，此为阴性结果。无论被测样品中是否含有二亚甲基双氧安非他明，胶体金标记物均会与包被在质控线(C线)上的羊抗鼠IgG结合而显色，C线显色是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。本发明所述试剂盒的检测方法为将被检样品平衡至室温；取出二亚甲基双氧安非他明检测装置，水平放置；在样品垫中加入2-3滴样品，10分钟时观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果。本发明所述的试剂盒采用胶体金免疫层析技术测定二亚甲基双氧安非他明，检测时，将被测样品加在试纸条(卡)上的样品垫上，可以直接观察到免疫反应的结果，完成样品检测。本发明可用于检测样本中可能存在的二亚甲基双氧安非他明，具有使用方便、操作简单、反应迅速、经济实用等特点。
图1 二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒结构示意图；附图符号说明1 样品垫；2 含有标记二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体的胶体金垫；3 硝酸纤维素膜(T 包被了二亚甲基双氧安非他明偶联抗原的检测线；C 包被了羊抗鼠IgG的质控线)；4 吸样垫；5 =PVC 支撑板；图2本发明试剂盒的检测结果示意图。自左至右依次为C 一条线阳性检测结果；T、C两条线阴性检测结果；无效。
具体实施例方式实施例1 二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒的制备(1)制备二亚甲基双氧安非他明偶联抗原将二亚甲基双氧安非他明与牛血清蛋白分子进行偶联，作为二亚甲基双氧安非他明偶联抗原。(2)制备二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体用二亚甲基双氧安非他明偶联抗原采用常规方法免疫制得二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体。(3)制备胶体金颗粒取0. 01 %的氯金酸水溶液IOOmL,加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三钠水溶液1. OmL，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。(4)制备胶体金垫 取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液6ml，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH 值调至8. 5，室温放置10分钟；逐滴加入蛋白浓度为4. 8mg/ml的二亚甲基双氧安非他明
5单抗0. 03ml，混合均勻，室温放置30分钟；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室温放置10分钟；11000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，用含5%蔗糖的 0. 002mol/LpH 8. 5的硼酸盐缓冲液6mL复溶，重复2次；最后用硼酸盐缓冲液溶解至3mL， 得到二亚甲基双氧安非他明单抗-胶体金标记物；将二亚甲基双氧安非他明单抗-胶体金标记物按ImL铺56cm2的比例均勻铺在无纺布上，再置干燥间，在温度38°C，湿度小于30% 的条件下干燥2-4小时，制成胶体金垫。(5)包被二亚甲基双氧安非他明偶联抗原、羊抗鼠IgG设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取0. 2mL浓度为1. Omg/ml的二亚甲基双氧安非他明偶联抗原、浓度为0. 8mg/ml的羊抗鼠IgG，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆二亚甲基双氧安非他明偶联抗原(T线)、羊抗鼠IgG(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥M小时，备用。(6)试剂盒的组装将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫由一端依次黏附在PVC支撑板上，即可形成检测二亚甲基双氧安非他明的试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中形成卡型包装。实施例2 二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒的要求(1)阴性参考品符合率用磷酸缓冲溶液(PBS 0. Olmol/L、pH 7. 5)配制浓度为100 μ g/mL的苯丙胺标准溶液进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，T、C线均呈现红色条带且显色度均一，结果为阴性。用磷酸缓冲溶液(PBS 0. Olmol/L、pH 7. 5)配制浓度为100 μ g/mL的美沙酮标准溶液进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，T、C线均呈现红色条带且显色度均一，结果为阴性。(2)阳性参考品符合率用磷酸缓冲溶液(PBS0. 01mol/L、pH 7. 5)配制浓度为 500ng/mL、1000ng/mL、 1500ng/mL的二亚甲基双氧安非他明标准品，各浓度分别进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，T线不显色，C线均呈现红色，结果为阳性。(3)最低检出量用磷酸缓冲溶液(PBS0. 01mol/L,pH 7. 5)配制浓度为 0、300、500、1000、1500ng/ mL的二亚甲基双氧安非他明标准品，各浓度分别进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，本试剂盒最低检出量不高于500ng/mL。(4)重复性用磷酸缓冲溶液(PBS 0. 01mol/L、pH 7. 5)配制浓度为500ng/mL的二亚甲基双氧安非他明标准品，进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，结果均为阳性，显色度均一。(5)稳定性37°C放置10天后，各项指标均符合以上要求。实施例3 二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒的检测方法(1)样品制备
尿液用尿液直接进行测试，若尿液呈可见的混浊状，需先离心、过滤或待其沉淀后取上清液检测。(2)操作取出二亚甲基双氧安非他明检测装置，水平放置；在样品垫上滴入2-3滴样品，10 分钟时观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果。(3)结果判定阳性T线不显色，C线呈现红色条带，判定为阳性结果，说明被测样品中二亚甲基双氧安非他明的含量高于500ng/mL ；阴性T线、C线都呈现红色条带，判定为阴性结果，说明样品中二亚甲基双氧安非他明的含量低于500ng/mL。无效C线不显色，说明不正确操作或试剂盒已经变质损坏。
权利要求
1.一种二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法，其特征在于由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板组成，样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫依次粘贴在PVC支撑板上，胶体金垫为胶体金标记的二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体玻璃纤维或无纺布，硝酸纤维素膜上依次包被了二亚甲基双氧安非他明偶联抗原作为检测线 (T线)，羊抗鼠IgG抗体作为质控线(C线)。
2.一种权利要求1所述的二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。
3.一种权利要求1所述的二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的二亚甲基双氧安非他明偶联抗原为二亚甲基双氧安非他明与牛血清蛋白的偶联物，二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体由二亚甲基双氧安非他明偶联抗原免疫获得。
4.一种权利要求1所述的二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂枸橼酸三钠作用下制成大小为20-40nm的胶体金颗粒。
5.一种权利要求1所述的二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金垫的制备方法为取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液6ml，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至8. 5，室温放置10分钟；逐滴加入蛋白浓度为4. 8mg/ml的二亚甲基双氧安非他明单抗0. 03ml，混合均勻，室温放置30分钟；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室温放置10分钟；11000转离心30分钟，仔细吸取上清液， 弃去，用含5%蔗糖的0.002mol/L pH 8. 5的硼酸盐缓冲液6mL复溶，重复2次；最后用硼酸盐缓冲液溶解至3mL，得到二亚甲基双氧安非他明单抗-胶体金标记物；将二亚甲基双氧安非他明单抗-胶体金标记物按ImL铺56cm2的比例均勻铺在无纺布上，再置干燥间，在温度38°C，湿度小于30%的条件下干燥2-4小时，制成胶体金垫。
6.一种权利要求1所述的二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上的两条线的包被方法为设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取0. 2mL浓度为1. Omg/ml的二亚甲基双氧安非他明偶联抗原、浓度为0. 8mg/ml 的羊抗鼠IgG，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆二亚甲基双氧安非他明偶联抗原(T线)、羊抗鼠IgG(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥M小时，
7. —种权利要求1所述的二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒的组装方法为将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫由一端依次黏附在PVC支撑板上，即可形成检测二亚甲基双氧安非他明的试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中形成卡型包装。
全文摘要
本发明属于生物学免疫方法的测定技术领域，特别涉及一种二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒及其制备方法。试剂盒包括样品垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)和PVC支撑板(5)。胶体金垫为胶体金标记的二亚甲基双氧安非他明单克隆抗体玻璃纤维(或无纺布)，硝酸纤维素膜上依次包被了二亚甲基双氧安非他明偶联抗原作为检测线(T线)，羊抗鼠IgG抗体作为质控线(C线)。本发明采用胶体金免疫层析技术制备二亚甲基双氧安非他明检测试剂盒，制备方法简单，可用于检测样本中可能存在的二亚甲基双氧安非他明，具有使用方便、操作简单、反应迅速、经济实用等特点。
文档编号G01N33/558GK102288760SQ20101020279
公开日2011年12月21日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者李峰, 杨利, 陈立柱 申请人:北京库尔科技有限公司
专业数控铣床产品供应商
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