专利名称：燃料电池、生产燃料电池的方法、电子设备、酶固定电极、生物传感器、能量转换元件、细胞 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种燃料电池、用于生产燃料电池的方法、电子设备、酶固定电极(固 定有酶的电极)、生物传感器、能量转换元件、细胞、细胞器、和细菌。更具体地，本发明适用 于利用葡萄糖作为燃料或底物(基质)的生物燃料电池、生物传感器、和能量转换元件，以 及使用生物燃料电池作为电源的各种电子设备。
背景技术：
近年来，利用酶的燃料电池(生物燃料电池)已经引人注目(参照，例如专利文献 1至12)。在生物燃料电池中，燃料通过利用酶的分解而分离成质子(H+)和电子，并且已经 开发出利用醇如甲醇、乙醇等，单糖如葡萄糖等，或多糖如淀粉等作为燃料的燃料电池。对于生物燃料电池，已知在电极上固定和布置酶是非常重要的。另外，已经发现， 需要用于传递电子从而与酶一起有效存在的电子介体。存在用于固定酶的各种传统方法， 但是在这些方法中，本发明的发明人已经主要开发了聚离子络合物(polyion complex)方 法以及戊二醛方法，在聚离子络合物方法中，带正电荷的聚合物和带负电荷的聚合物以合 适的比例与酶混合并且施加于由多孔碳构成的电极以稳定化固定膜，同时维持对电极的附 着力。引文列表专利文献PTL 1 日本未审查专利申请公开号2000-133297PTL 2 日本未审查专利申请公开号2003-282124PTL 3 日本未审查专利申请公开号2004-71559PTL 4 日本未审查专利申请公开号2005-13210PTL 5 日本未审查专利申请公开号2005-310613PTL 6 日本未审查专利申请公开号2006-24555PTL 7 日本未审查专利申请公开号2006-49215PTL 8 日本未审查专利申请公开号2006-93090PTL 9 日本未审查专利申请公开号2006-127957PTL 10 日本未审查专利申请公开号2006-156354PTL 11 日本未审查专利申请公开号2007-12281PTL 12 日本未审查专利申请公开号2007-35437非专利文献NPL 1 “ New development of liposome application-toward the development of artificial cells- " supervised by Kazunari AKIY0SHI and Kaoru TSUJII, published by NTS Inc. , June 1,2005NPL 2=Biotechnology and Bioengineering, Vol. 81, No. 6,pp.695-704(2003)
NPL 3 =Biophys. J.，71，pp. 2984-2995(1996)
发明内容
技术问题然而，使用聚离子络合物的上述固定方法主要依赖于酶的物理化学性质，特别是 电荷，并导致固定状态随着外部溶液的变化、工作环境(操作环境)的变化等而变化的担 忧，从而易于导致所固定的酶等的逸散(溶出)。另外，酶通常具有较低的耐热性，但是当为 了生物燃料电池的实际应用而改变酶时，有必要在酶的物理化学性质改变时每次对用于形 成固定化膜的方法进行优化，由此导致复杂性。而且，当期望从燃料中取出更多的电子时， 需要更大量的酶，但是为了优化用于固定酶的固定条件而消耗大量的劳动。因此，本发明所要解决的问题是提供一种燃料电池及其生产方法，其中在微小空 间内封入一种或多种类型的酶或另外的辅酶，使得电子可以通过利用所述微小空间作为反 应场的酶反应而从诸如葡萄糖等的燃料中被有效地取出，由此产生电能，并且其中所述酶 或另外的辅酶可以被容易地固定在电极上。本发明所要解决的另一问题是提供一种利用上述优异的燃料电池的高性能电子 设备(电子装置)。本发明所要解决的另外的问题是提供一种适合应用于燃料电池的酶固定电极、高 效率生物传感器、和能量转换元件。本发明所要解决的另外的问题是提供通过有效地从用作底物的葡萄糖中取出电 子而能够产生电能的细胞、细胞器和细菌。问题的解决方案为了解决上述问题，本发明的发明人进行了深入细致的研究。结果，已经发现，当 酶反应所需的酶或另外的辅酶被封入作为生物燃料电池中的人造细胞的脂质体中时，与其 中使用相同量的没有被封入脂质体中的酶或另外的辅酶的情况相比，可以有效地进行酶反 应从而产生非常高的催化剂电流并且使得易于固定在电极上。另外，该方法的有效性被实 验证实，并且从各种观点对该方法的可适用范围进行了研究，从而完成了本发明。而且，该 方法不仅适用于生物燃料电池而且还适用于各种使用酶或进一步使用辅酶的各种元件或
直ο所建立的传统理论被仅由本发明人获得的发现而推翻，即，当酶反应所需的酶或 另外的辅酶被封入脂质体中时，酶反应可以更有效地进行从而产生非常高的催化剂电流。 即，传统认为当封入脂质体中的酶被视为生物催化剂时，因为底物(基质)对构成脂质体的 双分子脂质膜(液体双层)的渗透速度被限制，反应速度很低。例如，在非专利文献1中， 在第妨4页右栏的第2行至第6行中描述了当封入脂质体中的酶被用作生物催化剂时，存 在这样的问题，即，因为脂质膜的高选择渗透性而过度限制封入到脂质体内的酶对加入到 脂质体外的水相中的亲水性或高分子量底物(基质)的反应性。另外，在非专利文献2中， 在第695页右栏之下倒数第8行至倒数第5行中描述了封入脂质体中的酶对外部添加的底 物(基质)的反应性显著依赖于脂质体双层的横向上的底物(基质)渗透性。另一方面，当使用葡萄糖作为生物燃料电池中的燃料时，如已经已知的，因为葡萄 糖对构成脂质体的双分子脂质膜具有非常低的渗透性，因此甚至通过将脂质体放入含葡萄
5糖的燃料溶液中也非常难以从燃料溶液将葡萄糖截留在脂质体中(参照图36)。由于对这 方面的深入细致研究，本发明人发现，可以通过在构成脂质体的双分子脂质膜中形成能渗 透葡萄糖的孔来解决该问题，从而完成了本发明。S卩，为了解决上述问题，本发明提供了一种燃料电池，其被构造成具有其中正极和 负极通过设置在其间的质子导体而彼此面对的结构，并利用酶从燃料中取出电子，其中，至少一种类型的酶被封入脂质体中；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。另外，在生产具有其中正极和负极通过设置在其间的质子导体而相互面对的结 构，利用酶从燃料中取出电子的燃料电池时，本发明提供了一种用于生产燃料电池的方法， 该方法包括以下步骤在至少一种类型的酶被封入所述脂质体中之后，在构成脂质体的双 分子脂质膜中形成一个或多个能渗透葡萄糖的孔。在上述发明中，典型地，燃料电池被构造成使得利用酶和辅酶从燃料中取出电子， 其中至少一种类型的酶和至少一种类型的辅酶被封入所述脂质体中。脂质体是一种由磷脂等构成的双分子脂质膜制成的封闭囊泡(闭合囊泡，closed vesicle)，其内部包括水相。脂质体不仅包括由单层双分子脂质膜构成的单层脂质体(SUV 小单层脂质体，GUV:大单层脂质体)，而且还包括具有包含截留在大脂质体(GUV)中的小脂 质体(SUV)的巢(nest)的多层脂质体(MUV)。例如，可以形成具有约IOOnm至大到IOym 直径的脂质体。该直径根据需要进行选择，但是具体实例为2至7μπι。基本上可以使用任 何磷脂，并且可以使用甘油脂(glycerolipid)或鞘脂。甘油脂的实例包括但不限于，磷脂 酸、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷 脂)等。鞘脂的实例包括但不限于，神经鞘磷脂等。磷脂酰胆碱的典型实例是二(十四酰 磷脂酰)胆碱(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)(DMPC)。可以使用传统的已知方法进行脂质体的 形成和酶与辅酶在脂质体中的封入，并且根据需要选择该方法。为了在构成脂质体的双分子脂质膜中形成一个或多个能渗透葡萄糖的孔，通常， 将抗生素(antibiotic)结合至双分子脂质膜。结果，穿过双分子脂质膜的孔以用抗生素加 边的形式形成。作为抗生素，可以使用各种传统已知的抗生素中的任何一种并根据需要进 行选择。孔被形成为具有这样的尺寸使得被封入脂质体中的酶或另外的辅酶至少不易于渗 透。可以在不使用抗生素的情况下形成孔。例如，可以通过插入具有足够小内径的微管如 碳纳米管等，穿过构成脂质体的双分子脂质膜来形成孔。在酶反应所需的酶或另外的辅酶中，至少一种类型的酶或另外的至少一种类型的 辅酶被封入脂质体中，但是酶反应所需的所有酶或另外的辅酶可以被封入脂质体中，或者 不需要均封入脂质体中，部分的酶或辅酶可以并入或固定在构成脂质体的双分子脂质膜中 或可以存在于脂质体之外。当酶或辅酶固定在构成脂质体的双分子脂质膜上时，可以使用 锚形体(锚，anchor)，例如，聚乙二醇链等。脂质体优选固定在负极上但并非必需固定，并且当含有缓冲溶液(缓冲物质)的 电解质被用作质子导体时，脂质体可以被包含在缓冲溶液中。脂质体可以通过例如用于固 定细胞的各种传统已知的固定方法进行固定。另外，在这种情况下，可以在负极与脂质体之 间形成中间层以便稳定脂质体在负极上的固定。作为中间层，可以使用生物聚合物如蛋白、 DNA等，既具有亲水性又具有疏水性的聚合物电解质，可以形成诸如胶束、反向胶束、层等的结构的物质，以及具有纳米结构、一种或多种性质和高生物相容性的化合物。蛋白的有用实 例包括由白蛋白，如醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、卵清蛋白、和肌激酶等为代表的酸性蛋白；以及 在碱侧(alkali side)上具有等电点的溶菌酶、细胞色素C、肌红蛋白、胰蛋白酶原等。由这 样的蛋白构成的中间层被物理地吸附在电极的表面上，使得可以通过将脂质体固定在中间 层上而使脂质体稳定地固定在负极上。作为用于将脂质体稳定地固定在负极上的方法，采用以下方法是有效的S卩，可以 通过将第一物质固定在负极上，将第二物质结合至脂质体并将固定在负极上的第一物质和 结合至脂质体的第二物质结合在一起，使脂质体稳定地固定在负极上。作为第一物质和第 二物质的优选的组合，可以使用特异性结合对，但是该组合不必仅限于此。第一物质和第二 物质的组合的具体实例包括以下 抗生物素蛋白和生物素抗生物素蛋白是一种特异性结合至生物素的糖蛋白。例如，脂质体可以通过将抗 生物素蛋白固定在负极上，将生物素结合至脂质体并将固定在负极上的抗生物素蛋白和结 合至脂质体的生物素结合在一起，而固定在负极上。生物素可以被固定在负极上，而抗生物 素蛋白可以结合至脂质体。作为抗生物素蛋白，可以使用诸如抗生蛋白链菌素、中性链亲合 素(neutroavidin)等的各种类型，并且也可以使用其突变体。·抗原和抗体抗体是特异性结合至抗原的免疫球蛋白。例如，脂质体可以通过利用抗原改性 (修饰)的脂质形成脂质体，将抗体固定在负极上，并将固定在负极上的抗体和结合至脂质 体的抗原结合，而固定在负极上。抗原可以被固定在负极上，而抗体可以结合至脂质体。 蛋白A或蛋白G和免疫球蛋白IgG蛋白A或蛋白G是一种对免疫球蛋白IgG具有强亲和力(亲和性)的蛋白。例如， 免疫球蛋白IgG固定在负极上，而蛋白A或蛋白G结合至脂质体。脂质体可以通过使固定 在负极上的免疫球蛋白IgG和结合至脂质体的蛋白A或蛋白G结合而固定在负极上。蛋白 A或蛋白G可以固定在负极上，而免疫球蛋白IgG可以结合至脂质体。·糖分子(或含糖链的化合物)和凝集素凝集素是糖结合蛋白的通用名。例如，脂质体通过与跨膜凝集素混合而形成，而糖 分子(或含糖链的化合物)被固定在负极上。脂质体可以通过使固定在负极上的糖分子 (或含糖链的化合物)的糖链和结合至脂质体的凝集素结合而固定在负极上。凝集素可以 固定在负极上，而糖分子(或含糖链的化合物)可以结合至脂质体。· DNA 和互补链 DNA例如，脂质体利用结合了 DNA的水溶性脂质而形成，并且互补链DNA固定在负极 上。于是，脂质体可以通过固定在负极上的互补链DNA和结合至脂质体的DNA杂交结合而 固定在负极上。·谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶(GST)例如，脂质体通过与GST-融合的跨膜蛋白混合而形成，并且将谷胱甘肽固定在负 极上。于是，脂质体可以通过使固定在负极上的谷胱甘肽和结合至脂质体的GST结合而固 定在负极上。·肝素和肝素-结合分子
例如，构成脂质体的双分子脂质膜用肝素-结合分子改性，并且负极用肝素改性。 于是，脂质体可以通过使肝素改性的负极的肝素和结合至脂质体的肝素结合分子结合而固 定在负极上。·激素和激素受体激素受体是一种特异性接受激素分子的蛋白分子或分子络合物(分子配合物)。 例如，激素受体固定在负极，激素结合至脂质体，而脂质体可以通过使固定在负极上的激素 受体和结合至脂质体的激素结合而固定在负极上。·羧酸和酰亚胺例如，羧酸结合至负极，而胺结合至脂质体。于是，脂质体可以通过使结合至负极 的羧酸和通过利用酰亚胺如碳二酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺等的酰胺偶合而结合至脂质体 的胺结合而固定在负极上。胺可以结合至负极，而羧酸可以结合至脂质体。另外，当负极的电极材料是碳时，作为用于使羧酸结合至负极的方法，例如，可以 利用在含硝酸、硫酸、过氧化氢等的溶液中回流或电化学氧化重氮盐的方法。作为燃料，可以使用各种燃料如葡萄糖等中的任何一种，并且根据需要进行选择。 除了葡萄糖外的燃料的实例包括各种参与(涉及)柠檬酸循环的有机酸、参与戊糖磷酸循 环和糖酵解系统的糖和有机酸等。参与柠檬酸循环的各种有机酸包括乳酸、丙酮酸、乙酰基 CoA、柠檬酸、异柠檬酸、α -酮戊二酸、琥珀酰基CoA、琥珀酸、富马酸、苹果酸、草酰乙酸等 等。参与戊糖磷酸循环和糖酵解系统的糖和有机酸包括葡萄糖6-磷酸、6-磷酸葡糖酸内 酯、6-磷酸葡糖酸、核酮糖-5-磷酸、甘油醛(glyceryl aldehyde) _3_磷酸、果糖6_磷酸、 木糖5-磷酸、景天庚酮糖7-磷酸、赤藓糖4-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、1，3_ 二磷酸甘油酸、核 糖5-磷酸等。这些燃料中的任何一种可以渗透通过一个或多个构成脂质体的双分子脂质 膜所拥有的能渗透葡萄糖的孔。这些燃料典型地以燃料溶液的形式使用，其中燃料溶解在传统已知的缓冲溶液如 磷酸盐缓冲溶液、tris-缓冲溶液等中。封入脂质体中的酶典型地包含通过促进氧化使燃料如葡萄糖等分解的氧化酶，并 且进一步包含辅酶氧化酶，其使伴随燃料的氧化而还原的辅酶回到氧化形式并将电子通过 电子介体传递至负极。具体地，封入脂质体中的酶优选包含通过促进氧化使燃料如葡萄糖 等分解的氧化酶以及使用氧化酶还原的辅酶回到氧化形式的辅酶氧化酶。当通过辅酶氧化 酶的作用而使辅酶回到氧化形式时，产生电子，并且将电子通过电子介体从辅酶氧化酶传 递至负极。例如，当使用葡萄糖作为燃料时，例如，葡萄糖脱氢酶(GDH)(尤其是NAD-依赖 性葡萄糖脱氢酶)被用作氧化酶，并且例如，NAD+或NADP+被用作辅酶，并且例如，心肌黄酶 (DI)被用作辅酶氧化酶。作为电子介体，基本上可以使用任何介体，但是优选使用具有醌骨架的化合物。具 体地，例如，可以使用2，3_二甲氧基-5-甲基-1，4-苯并醌OiO)和具有萘醌骨架的化合物， 例如，各种萘醌衍生物如1-氨基-1，4-萘醌(ANQ)、2_氨基-3-甲基_1，4_萘醌(AMNQ)、 2-甲基-1，4-萘醌作1(3)、2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌(ACNQ)、维生素Kl等。作为具有醌 骨架的化合物，例如，也可以使用蒽醌及其衍生物。如果需要，除了具有醌骨架的化合物之 外，电子介体还可以包含用作电子介体的一种或两种或多种类型的其它化合物。电子介体 可以与其中封入了酶和辅酶的脂质体一起固定在负极上，可以封入脂质体中，可以固定在脂质体上，或可以包含在燃料溶液中。当酶被固定在正极上时，酶典型地包括还原氧的酶。作为还原氧的酶，例如， 可以使用胆红素氧化酶、漆酶、抗坏血酸氧化酶等。在这种情况下，除了酶之外，电子 介体优选也固定在正极上。作为电子介体，例如，可以使用亚铁氰化钾(potassium hexacyanoferrate) > A^tS^St^P (potassium octacyanotungstate)等。电〒 本itife 以足够高的浓度，例如，平均0. 64X 10_6mol/mm2以上的浓度被固定。作为质子导体，可以使用各种导体中的任何一种，并且根据需要进行选择。具体实 例包括玻璃纸、全氟碳磺酸(pre)树脂膜、三氟苯乙烯衍生物共聚物膜、磷酸浸渍的聚苯并 咪唑膜、芳香族聚醚酮磺酸膜、PSSA-PVA(聚苯乙烯磺酸聚乙烯醇共聚物)、PSSA-EV0H(聚 苯乙烯磺酸乙烯乙烯醇(ethylenevinyl alcohol)共聚物)、具有含氟碳磺酸基团的离子 交换树脂(Nafion(商品名，美国杜邦公司)等)，等等。当含缓冲溶液(缓冲物质)的电 解质被用作质子导体时，优选可以在高输出操作期间充分实现酶的固有缓冲能力，并且使 得酶充分呈现出其固有能力。为此目的，将电解质中包含的缓冲物质的浓度控制为0.2M以 上且2. 5M以下，优选0. 2M以上且2M以下，更优选0. 4M以上且2M以下，还更优选0. 8M以 上且1.2M以下是有效的。可以使用任何缓冲物质，只要？&为6以上且9以下。具体实例 包括磷酸二氢根离子(H2P04_)、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(缩写，tris)、2-(N-吗啉 基)乙磺酸(乙烷磺酸)(MEQ、卡可基酸(二甲次胂酸)、碳酸(H2CO3)、柠檬酸氢根离子、 N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N' - 二 乙磺酸)(PIPES) ,N-(2-乙酰 胺基)-2-氨基乙磺酸(ACEQ、3-(N-吗啉基)丙磺酸(M0PQ、N_2_羟乙基哌嗪-N' -2-乙 磺酸(HEPES)、N-2-羟乙基哌嗪-N' -3-丙磺酸(HEPPS)、N_[三(羟甲基)甲基]甘氨酸 (缩写，tricine)、双甘氨肽、N, N- 二(2-羟乙基)甘氨酸(缩写，vicine)，等等。产生磷 酸二氢根离子(H2PO4-)的物质的实例包括磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)等。 作为缓冲物质，含咪唑环的化合物也是优选的。含咪唑环的化合物的具体实例包括咪唑、三 唑、吡啶衍生物、二吡啶衍生物、咪唑衍生物(组氨酸、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪 唑、2-乙基咪唑、乙基咪唑-2-羧酸盐、咪唑-2-甲醛(imidazole-2-carboxaldehyde)、咪 唑-4-羧酸、咪唑-4，5- 二羧酸、咪唑-1-基-乙酸、2-乙酰苯并咪唑、1-乙酰咪唑、N-乙酰 咪唑、2-氨基苯并咪唑、N-(3-氨基丙基)咪唑、5-氨基-2-(三氟甲基)苯并咪唑、4-氮杂 苯并咪唑、4-氮杂-2-巯基苯并咪唑、苯并咪唑、1-苄基咪唑、以及1-丁基咪唑)等。如果 需要，除了缓冲物质之外，例如，可以加入选自由盐酸(HCl)、乙酸(CH3COOH)、磷酸(H3PO4) 和硫酸(H2SO4)组成的组中的至少一种酸作为中和剂。这可以将酶的活性维持在较高的水 平。含缓冲物质的电解质的PH优选接近7但通�？梢晕�1至14中的任意一个。可以使用各种物质作为正极和负极的电极材料，并且例如，可以使用碳材料如多 孔碳、碳颗粒、碳毡、碳纸等。作为电极材料，还可以使用包括由多孔材料构成的骨架的多 孔导电材料和覆盖至少一部分骨架并包含碳基材料作为主要成分的材料(参加专利文献 12)。燃料电池可以被用于几乎所有需要电力(电功率)的应用，例如，电子设备、移动 体(汽车、双轮车、飞机、火箭、宇宙飞船等)、发动机组(动力单元)、建筑机械、机械工具、 动力系统、热电联产系统等，而不管尺寸如何，并且根据应用来确定输出、尺寸、形状、燃料 类型等。
而且，本发明提供了一种电子设备，包括一个或多个燃料电池；所述燃料电池中的至少一个被构造成具有其中正极和负极通过设置在其间的质子导体而相互面对的结构，并且利用酶 从燃料中取出电子，其中至少一种类型的酶被封入脂质体中；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。电子设备可以基本上是包括便携式类型和固定类型的类型中的任何一种，但是其 具体实例包括便携式电话、移动设备(便携式数字助理(PAD)等)、机器人、个人计算机(包 括台式型和笔记本型)、游戏机、摄像机(磁带录像机)、汽车安装的设备、家用电器、工业制
P AjV PF[寸 ο以上关于燃料电池和用于生产本发明的燃料电池的方法的描述适用于本发明的 电子设备，只要其并不相悖于这些性质。另外，本发明提供了一种酶固定电极，其中固定了封入有至少一种类型的酶的脂质体；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。以上关于燃料电池和用于生产本发明的燃料电池的方法的描述适用于本发明的 酶固定电极，只要其并不相悖于这些性质。另外，本发明提供了一种包含酶的生物传感器，其中至少一种类型的酶被封入脂质体中；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。以上关于燃料电池和用于生产本发明的燃料电池的方法的描述适用于本发明的 生物传感器，只要其并不相悖于这些性质。另外，本发明提供了一种能量转换元件，其中至少一种类型的酶被封入脂质体中；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。这里，能量转换元件是一种通过酶反应将燃料或基质所拥有的化学能转化成电能 的元件，并且上述燃料电池，即生物燃料电池是能量转换元件的一种类型。关于燃料电池和用于生产本发明的燃料电池的方法的以上描述适用于本发明的 能量转换元件，只要其并不相悖于这些性质。另外，本发明提供了细胞，其中构成细胞膜的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。另外，本发明提供了细胞器，其中构成细胞膜的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。另外，本发明提供了细菌，其中构成细胞膜的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。细胞、细胞器和细菌没有特别限制，只要它们具有燃料或基质如葡萄糖等的代谢 系统，并且包括传统已知的各种细胞、细胞器和细菌。如果需要，与在上述燃料电池中一样， 燃料或基质如葡萄糖等的分解所需的酶或另外的辅酶可以被封入细胞、细胞器和细菌中。
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在如上所述构造的本发明中，参与酶反应的至少一种类型的酶或另外的至少一种 类型的辅酶被封入脂质体中，同时维持高活性，并且因此酶反应利用脂质体中的微小空间 作为反应场而有效地进行，从而允许从燃料或底物(基质)如葡萄糖等中有效取出电子。 在这种情况下，封入脂质体中的酶和辅酶的浓度非常高，并且由此酶与辅酶之间的距离非 常�。佣捎诿负透付市泶呋裂芬苑浅８叩乃俾式胁⑹姑阜从σ愿叩乃俣冉� 行。另外，通过将脂质体固定在负极或电极上，酶或另外的辅酶可以通过脂质体而容易地固 定在负极或电极上。因此，从燃料或基质如葡萄糖等取出的电子可以可靠地传递至负极或 电极。在这种情况下，与用聚离子络合物等固定酶和辅酶相比，脂质体可以被简单固定。在细胞、细胞器和细菌中，酶反应利用细胞、细胞器和细菌中的微小空间作为反应 场而有效进行，并且由此电子可以从燃料或基质如葡萄糖等中被有效地取出。在这种情况 下，酶反应通过细胞、细胞器和细菌中提供的代谢系统进行，但是当燃料或底物(基质)的 分解所需的酶或另外的辅酶被封入细胞、细胞器和细菌中时，酶反应可以利用酶和辅酶进 行。本发明的有益效果根据本发明，可以实现这样的高效率燃料电池，其中酶反应可以利用其中封入了 酶或另外的辅酶的脂质体中的微小空间作为反应场来进行，并且由此电能可以通过从燃料 或底物(基质)如葡萄糖等中有效地取出电子而产生，并且其中酶或另外的辅酶可以被容 易地固定在电极上。而且，使用这样的高效率燃料电池可以实现高性能电子设备。另外，类 似地，可以实现高效率生物传感器和能量转换元件。另外，可以实现通过有效地从燃料或基质，如葡萄糖等中取出电子能够产生电能 的细胞、细胞器和细菌。
图1是示出了根据本发明第一实施方式的酶固定电极的示意图。图2是示出了其中封入了根据本发明第一实施方式的酶固定电极中所使用的酶 和辅酶的脂质体的示意图。图3是示意性示出了通过封入根据本发明的第一实施方式的酶固定电极中的脂 质体中的酶和辅酶的电子转移反应的示意图。图4是用于说明通过在脂质体中封入酶组(enzyme group)和辅酶而进行的酶反 应的优点的示意图。图5是示出了其中封入了荧光标记的醇脱氢酶、荧光标记的心肌黄酶和NADH的脂 质体的荧光显微图像的代替绘图的照片。图6是示出了其中封入了荧光标记的醇脱氢酶、荧光标记的心肌黄酶和NADH的脂 质体的荧光显微图像的代替绘图的照片。图7是示出了其中封入了荧光标记的醇脱氢酶、荧光标记的心肌黄酶和NADH的脂 质体的荧光显微图像的代替绘图的照片。图8是示出了其中封入了荧光标记的醇脱氢酶、荧光标记的心肌黄酶和NADH的脂 质体的荧光监控的结果的示意图。图9是示出了其中封入了荧光标记的醇脱氢酶、荧光标记的心肌黄酶和NADH的脂质体的荧光监控的结果的示意图。图10是示出了其中封入了荧光标记的醇脱氢酶、荧光标记的心肌黄酶和NADH的 脂质体的荧光监控的结果的示意图。图11是用于说明脂质体的稳定性的示意图。图12是示出了对脂质体在预定溶液中的分散实施的计时电流法的结果，在所述 脂质体中封入醇脱氢酶、心肌黄酶和NADH，以及对醇脱氢酶、心肌黄酶和NADH在预定溶液 中的简单分散实施的计时电流法的结果的示意图。图13是示出了其中封入醇脱氢酶、心肌黄酶和NADH的脂质体在缓冲溶液中的分 散状态的示意图。图14是示出了醇脱氢酶、心肌黄酶和NADH在缓冲溶液中的简单分散状态的示意 图。图15是示出了对其中封入了葡萄糖脱氢酶、心肌黄酶和NADH的脂质体在本发明 的实施例1中的测定溶液中的分散实施的计时电流法结果的示意图。图16是示出了对其中封入了葡萄糖脱氢酶、心肌黄酶和NADH的脂质体在本发明 的实施例1中的测定溶液中的分散实施的计时电流法结果的示意图。图17是示出了用作本发明的实施例1中的抗生素的两性霉素B的结构式的示意 图。图18是示出了其中两性霉素B结合至构成脂质体的双分子脂质膜以形成本发明 的实施例1中的孔的状态的截面图。图19是示出了其中两性霉素B结合至构成脂质体的双分子脂质膜以形成本发明 的实施例1中的孔的状态的平面图。图20是示出了根据本发明的第二实施方式的生物燃料电池的示意图。图21是示意性地示出了生物燃料电池的负极构造的细节、封入固定在负极上的 脂质体中的酶组和辅酶的实例、以及酶组和辅酶的电子转移反应的示意图。图22是示出了根据本发明的第二实施方式的生物燃料电池的构造的具体实例的 示意图。图23是用于说明被用作根据本发明的第三实施方式的生物燃料电池中的负极的 电极材料的多孔导电性材料的结构的示意图和截面图。图M是用于说明生产用作根据本发明的第三实施方式的生物燃料电池中的负极 的电极材料的多孔导电性材料的方法的示意图。图25是示出了根据本发明的第四实施方式的细胞的主要部分的示意图。图沈是示出了根据本发明的第五实施方式的线粒体的示意图。图27是示出了根据本发明的第六实施方式的细菌的示意图。图观是示出了用作根据本发明的第七实施方式的生物燃料电池中的负极的电极 的多孔电极的透视图和截面图。图四是示出了根据本发明的第八实施方式的酶固定电极的示意图。图30是示出了对于本发明的实施例2中的计时电流法测定所形成的样品的示意 图。图31是示出了相比于本发明的实施例2所形成的第一样品的示意图。
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图32是示出了相比于本发明的实施例2所形成的第二样品的示意图。图33是示出了相比于本发明的实施例2所形成的第三样品的示意图。图34是示出了本发明的实施例2中计时电流法的结果以及比较例的结果的示意 图。图35是示出了根据本发明的第九实施方式的酶固定电极的示意图。图36是示出了各种分子对双分子脂质膜的渗透性的示意图。
具体实施例方式下面将描述用于实施本发明的模式(在下文中，称为“实施方式”)。另外，以以下 次序进行描述。1.第—-实施方式(酶固定电极及其生产方法)
2.第二实施方式(生物燃料电池)
3.第三实施方式(生物燃料电池)
4.第四实施方式(细胞)
5.第五实施方式(线粒体)
6.第六实施方式(细菌)
7.第七实施方式(生物燃料电池)
8.第八实施方式(酶固定电极及其生产方法)
9.第九实施方式(酶固定电极及其生产方法)
(1 第-一实施方式)[酶固定电极]图1示出了根据本发明的第一实施方式的酶固定电极。在该酶固定电极中，使用 葡萄糖作为底物(基质)。如图1中所示，在该酶固定电极中，由磷脂等的双分子脂质膜构成的脂质体12通 过物理吸附而固定在由多孔碳等构成的电极11的表面上。参与预期的酶反应的至少一种 类型的酶和至少一种类型的辅酶被封入脂质体12中的水相中。图2示出了脂质体12的结构的细节。在图2中，两种类型的酶13和14以及一种 类型的辅酶15被封入脂质体12中的水相12a中。除此之外，这些酶13和14以及辅酶15， 例如，电子介体可以被封入脂质体12中的水相12a中。电子介体可以与脂质体12 —起被 固定在电极11上。酶13是促进用作底物(基质)的葡萄糖的氧化以使葡萄糖分解的氧化 酶，而酶14是使利用葡萄糖的氧化而还原的辅酶15回到氧化形式并将电子通过电子介体 转移至电极11的辅酶氧化酶。如图2所示，一种或多种抗生素16结合至构成所述脂质体12的双分子脂质膜，从 而形成用抗生素16加边的形式的穿过双分子脂质膜的孔17。虽然图2仅示出了一个孔17， 但是孔17的数目和布置是任意的。孔17的尺寸被选择成使得葡萄糖的渗透是可能的，但 是酶13和14以及辅酶15的渗透是不可能的或困难的。作为抗生素16，例如，可以使用作为多烯类抗生素的两性霉素B、离子载体等，但 是抗生素16并不仅限于这些。离子载体的实例包括缬氨霉素、离子霉素(ionomycin)、尼日 利亚菌素、短杆菌肽A、莫能菌素、羰基氰化物间氯苯腙(carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone)、MS1 化物对氣甲氧基￥月宗(carbonylcyanide-p-f Iuoromethoxyphenylhyd razone)等。[用于生产酶固定电极的方法]例如，可以如下来生产酶固定电极。首先，形成其中封入了酶13和14以及辅酶15 的脂质体12。接着，使抗生素16结合至构成所述脂质体12的双分子脂质膜，形成孔17。接 着，将具有由此形成的孔17的脂质体12固定在电极11上。结果，生产了酶固定电极。孔 17可以通过在封入酶13和14以及辅酶15之前，将抗生素16结合至构成所述脂质体12的 双分子脂质膜而形成。可替换地，孔17可以通过在脂质体12固定在电极11上之后，将抗 生素16结合至构成所述脂质体12的双分子脂质膜而形成。更具体地，例如，如下来生产酶固定电极。首先，制备包含酶13的缓冲溶液、包含 酶14的缓冲溶液、包含辅酶15的缓冲溶液以及包含脂质体12 (其中没有封入酶13和14 以及辅酶1 的缓冲溶液中的每一种。接着，将这些缓冲溶液混合，并且使混合的溶液通过 凝胶过滤柱从而除去脂质体12外部的酶13和14以及辅酶15。接着，将其中封入了酶13 和14以及辅酶15的脂质体12置于缓冲溶液中，并向该缓冲溶液中加入抗生素16从而使 抗生素16结合至构成脂质体12的双分子脂质膜，形成孔17。图3示意性地示出了酶固定电极中的酶、辅酶和电子介体的电子转移反应的实 例。在该实例中，参与葡萄糖的分解的酶是葡萄糖脱氢酶(GDH)。另外，伴随在葡萄糖的分 解过程中的氧化反应产生还原形式的辅酶是NAD+。另外，氧化作为辅酶的还原形式的NADH 的辅酶氧化酶是心肌黄酶(DI)。而且，电子介体从辅酶氧化酶接收伴随辅酶的氧化而产生 的电子并将电子传递至电极11。在这种情况下，葡萄糖渗透通过在构成脂质体12的双分子 脂质膜中形成的孔17并进入脂质体12中，通过用葡萄糖脱氢酶分解葡萄糖而产生葡糖酸 内酯，并且葡糖酸内酯被释放到脂质体12的外部。电子介体进入并离开构成脂质体12的 双分子脂质膜从而传递电子。在描述实施例之前，描述了使用其中封入有酶和辅酶的脂质体作为酶反应的反应 场的有效性(效率)的详细检查的结果。然而，这里，考虑了其中使用具有其中未形成能渗 透葡萄糖的孔的双分子脂质膜的脂质体，并且使用乙醇作为酶反应的底物(基质)的情况。如图4中所示，酶固定电极通过在电极18上固定具有其中未形成能渗透葡萄糖的 孔的双分子脂质膜的脂质体19而形成，参与乙醇(EtOH)的分解的酶和辅酶被封入脂质体 19中。作为电极18，使用了与电极11相同的电极。图4示意性示出了酶固定电极中的酶、 辅酶和电子介体的电子传递反应的实例。在该实例中，参与乙醇(EtOH)的分解的酶是醇脱 氢酶(ADH)。另外，伴随在乙醇的分解过程中的氧化反应产生还原形式的辅酶是NAD+。另 外，氧化作为辅酶的还原形式的NADH的辅酶氧化酶是心肌黄酶(DI)。另外，电子介体从辅 酶氧化酶接收伴随辅酶的氧化而产生的电子并将电子传递至电极18。在这种情况下，乙醇 渗透通过构成脂质体19的双分子脂质膜并进入脂质体19，并且通过用醇脱氢酶分解乙醇 而产生乙醛(CH3CHO)，乙醛被释放到脂质体19的外部。电子介体进入并离开构成脂质体19 的双分子脂质膜从而传递电子。实际上形成了图4所示的酶固定电极，并进行实验。首先，如下形成酶固定电极。称取5mg的心肌黄酶(DI) (EC 1. 8. 1. 4，由Amano Enzyme Inc.制造)并溶解在
14ImL的缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备DI酶缓冲溶液(1)。称取5mg 的醇脱氢酶(ADH) (NAD-依赖性，EC 1. 1. 1. 1，由 AmanoEnzyme Inc.制
造)并溶解在ImL的缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备ADH酶缓冲溶液 ⑵。其中溶解有每一种酶的缓冲溶液优选被冷冻直至刚好溶解之前，并且酶缓冲溶液 也优选尽可能地被冷冻。称取!35mg的 NADH(由 Sigma-Aldrich Ltd.，制造，N-8129)并溶解在 ImL 的缓冲 溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备NADH酶缓冲溶液(3)。称取15至300mg的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯并醌0)0)并溶解在ImL的 缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备QO缓冲溶液0)。称取IOOmg的卵黄卵磷脂(由Wako制造)并溶解在IOmL的缓冲溶液(IOmM磷酸 盐缓冲溶液，PH 7)中并利用均化器均质化从而制备脂质体缓冲溶液(5)。从如上述制备的每一溶液中取样下面描述的量，并将样品进行混合，接着重复冷 冻解冻3次。DI 酶缓冲溶液(1) :50μ LADH 酶缓冲溶液(2) :50 μ LNADH 缓冲溶液(3) :50 μ L脂质体缓冲溶液(5) :50 μ L使上述混合溶液通过凝胶过滤柱从而除去脂质体外部的酶和NADH。所得的脂质体 溶液被认为是封入ADH/DI/NADH的脂质体溶液(6)。图5、图6和图7分别是用氰染料Cy2荧光标记的ADH、用氰染料Cy3荧光标记的 DI和封入NADH的脂质体的荧光显微照片。在图5、图6和图7中，Ex(激发)表示具有在 Ex的右侧描述的波长的激发光，而DM(分色镜(二向色镜))表示用于分离激发光和荧光的 镜子，其仅传输在MD的右侧上描述的波长或更长波长的光，并且BA (阻挡滤光片)表示用 于分离荧光和散射光的滤光片，其传输在BA的右侧上描述的波长或更长波长的光。在荧光 显微镜中，染料用激发光激发，并且所得的光连续穿过DM和BA从而除去不必要的光并且仅 检测来自染料的荧光。图5示出了其中Cy2用450至490nm的波长的激发光激发以产生荧 光的ADH的分布。图6示出了其中Cy3用510至560nm的波长的激发光激发以产生荧光的 DI的分布。图7示出了其中NADH用380至420nm的波长的激发光激发以产生荧光的NADH 的分布。根据图5、图6和图7，脂质体的平均直径为4.6 μ m，并且标准偏差为2. 0 μ m。然 而，在图5、图6和图7中，通过测量30个脂质体并平均测定结果来确定脂质体的平均直径。图8、图9和图10分别是示出了用Cy2荧光标记的ADH、用Cy3荧光标记的DI和 封入NADH的脂质体的荧光监测结果的曲线。图8示出了来自用Cy2荧光标记的ADH的荧 光强度，图9示出了来自用Cy3荧光标记的DI的荧光强度，而图10示出了来自NADH的荧 光强度。在图8、图9和图10中，Em(发射)表示通过用激发光Ex激发染料而发射的光，其 具有在Em的右侧上描述的波长，并且在Ex和Em中的每一个的波长的右侧括号内的值表示 半宽度(half-value width，半值宽度)。如从图8、图9和图10中看到的，在任何这些情况 下，荧光强度都并未变化高达IOOmM的乙醇浓度。即，可以发现，脂质体在高达IOOmM的乙醇浓度下是稳定的，并且ADH、DI和NADH被牢固地封入脂质体内。另外，当加入作为表面活 性剂的0.3^WTriton X时，荧光强度升高。这表示脂质体被0. 3%的Triton X破坏，并 且脂质体中的ADH、DI和NADH释放到脂质体的外部，由此提高了荧光强度。通过采用NADH 作为一个实例而在图11中示出了这种状态。如图11中所示，在其中NADH被封入脂质体内 的状态下，NADH的荧光强度较低，而当脂质体被破坏从而将封入脂质体中的NADH释放至脂 质体的外部时，NADH的荧光强度增加。使由此形成的封入ADH/DI/NADH的脂质体溶液(6)与QO缓冲溶液(4)混合从而 制备100 μ L总体积的测定溶液，并且在溶液的搅拌下使用碳毡作为工作电极，在相对于参 比电极Ag I AgCl设定成0. 3V的电位(其足以高于电子介体的氧化还原电位)下实施计时 电流法。在计时电流法期间，乙醇被连续加入使得最终浓度为ImMUOmM和100mM。在图12中，曲线(a)示出了计时电流法的结果，其中乙醇被加入到含有如上所述 的封入ADH、DI、NADH的脂质体的测定溶液中。如从曲线(a)中所看到的，当ADH、DI和NADH 被封入脂质体中时，观察到由于乙醇的催化剂电流，并且催化剂电流随着乙醇的浓度增大 而增大。即，观察到了由于作为人造细胞的封入ADH/DI/NADH的脂质体的电化学催化剂活 性。另一方面，计时电流法以与如上所述的针对以下情况相同的方式进行，其中ADH、DI和 NADH被简单地分散在QO缓冲溶液中而没有被封入脂质体中，ADH、DI和NADH的量与 其中ADH、DI和NADH被封入脂质体中的情况相同。结果由图12中的曲线(b)示出。如从 曲线(b)所看到的，当ADH、DI和NADH被简单地分散在QO缓冲溶液(4)中而没有被封入脂 质体中时，基本上没有观察到由于乙醇的催化剂电流。例如，相比于IOOmM的乙醇浓度，当 ADH、DI和NADH被简单地分散在QO缓冲溶液(4)中而没有被封入脂质体中时，所产生的催 化剂电流仅为其中ADH、DI和NADH被封入脂质体中的情况的催化剂电流的约1/30。这表 明当ADH、DI和NADH被封入脂质体中时，与其中ADH、DI和NADH没有被封入脂质体中的情 况相比，可以获得极高的催化剂电流。对当ADH、DI和NADH被封入脂质体中时，与其中ADH、DI和NADH没有被封入脂质 体中的情况相比，可以获得极高的催化剂电流的原因进行描述。如图13中所示，考虑了其 中封入ADH(由具有水平线的圆圈表示)、DI (由具有垂直线的圆圈表示)和NADH(由空白 圆圈表示)的脂质体19在缓冲溶液S中以四方晶格图案布置的情况。另一方面，考虑了其 中如图14所示，以与图13所示的情况相同的量的ADH(由具有水平线的圆圈表示)、DI (由 具有垂直线的圆圈表示)和NADH(由空白圆圈表示)，在以与图13所示的情况中相同的 体积的缓冲溶液S中，以四方晶格图案布置的情况。缓冲溶液S的体积例如为100 μ L，而 脂质体19的内部体积为例如约0. 17μ L。然而，构成脂质体19的双分子脂质膜的磷脂以 5. 5 X ΙΟ"3 μ mol存在于缓冲溶液S中，并且脂质体19的总内部体积根据每μ mol脂质体19 的体积为30 μ L/ μ mol。如图14所示，当ADH、DI和NADH如图13所示被封入脂质体19中 时，这些ADH、DI和NADH的局部浓度约为当ADH、DI和NADH被简单地分散在缓冲溶液S中 时的高达约600倍，如图14所示。S卩，通过将ADH、DI和NADH封入到脂质体19中而可以显 著提高这些ADH、DI和NADH的浓度，并可以显著减小ADH、DI和NADH之间的距离。因此，可 以使ADH、DI和NADH的催化剂循环在脂质体19内以高的速度进行，由此获得图12中所示 的结果。由以上第一实施方式可以发现，当酶反应所需的酶13和14以及辅酶15被封入脂
16质体12中时，酶反应可以利用脂质体中的微小空间作为反应场而有效进行，并且电子可以 从底物(基质)中被有效地取出。(实施例1)如下形成酶固定电极。称取1 至 IOmg 的心肌黄酶(DI) (EC 1. 8. 1. 4，由 Amano Enzyme Inc.制造)并溶 解在ImL的缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备DI酶缓冲溶液(11)。称取10至50mg的葡萄糖脱氢酶(⑶H) (NAD-依赖型，EC 1. 1. 1. 47，由Amano Enzyme Inc.制造)并溶解在ImL的缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备 GDH酶缓冲溶液(12)。其中溶解有每一种酶的缓冲溶液优选进行冷冻直至刚好溶解之前，并且酶缓冲溶 液也优选尽可能地进行冷冻。称取10 至 50mg 的 NADH(由 Sigma-Aldrich Ltd.制造，N-8129)并溶解在 ImL 的 缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备NADH酶缓冲溶液(13)。称取100至200mg的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯并醌0)0)并溶解在ImL的 缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备QO缓冲溶液(14)。称取10至IOOmg卵黄卵磷脂(由Wako制造)并溶解在IOmL的缓冲溶液(IOmM 磷酸盐缓冲溶液，PH 7)中并利用均化器均化从而制备脂质体缓冲溶液(15)。从如上述制备的每一溶液中取样下面描述的量，并将样品进行混合，接着重复冷 冻解冻3次。DI 酶缓冲溶液(11) :50uLGDH 酶缓冲溶液(12) :50 μ LNADH 缓冲溶液(13) :50 μ L脂质体缓冲溶液(15) 50 μ L使上述混合溶液通过凝胶过滤柱从而除去脂质体外部的酶和NADH。所得的脂质体 溶液被认为是封入GDH/DI/NADH的脂质体溶液(16)。将由此形成的封入⑶H/DI/NADH的脂质体溶液(16)与QO缓冲溶液(14)混合从 而制备总体积100 μ L的测定溶液。然后，在溶液的搅拌之下使用葡萄糖作为燃料，碳毡作 为工作电极，AglAgCl作为参比电极，以及钼丝作为对电极在相对于参比电极AglAgCl设定 成+0. IV的电位下实施计时电流法。计时电流法的结果在图15中示出。如图15中所示，首先，当在计时电流法期间将葡萄糖加入到测定溶液中使得最终 浓度为IOOmM时，基本上未发生反应，并且所获得的电流值几乎没有变化。这是由于葡萄糖 以极低的速度渗透通过构成所述脂质体的双分子脂质膜以及基本上没有渗透的事实。接着，向测定溶液中加入作为抗生素16的两性霉素B(AmB)使得最终浓度为 IOOuM0因此，观察到由于葡萄糖的催化剂电流。即，可以发现，葡萄糖渗透通过构成所述 脂质体的双分子脂质膜，由此使一系列酶反应在脂质体中进行。据本发明人所知，首次观察 到如上所述的由于封入脂质体中的葡萄糖的催化剂电流。接着，当将作为可以破坏脂质体的表面活性剂的0. 3%的Triton X加入到测定溶 液中时，显著降低了催化剂电流。这表明脂质体被0.3%的Triton X破坏，由此将⑶H、DI 和NADH释放到脂质体的外部。
图16示出了通过将加入如上所述的包含IOOmM葡萄糖的相同测定溶液的两性霉 素B的最终浓度改变至1、10和100 μ M而进行的计时电流法的结果。如图16中所示，催化 剂电流随着加入的两性霉素B的最终浓度在1至100 μ M的浓度范围内增加而增加，但是催 化剂电流在100 μ M的两性霉素B的最终浓度时呈现出达到升高顶峰的趋势。图17示出了两性霉素B的结构式。另外，图18示出了显示其中两性霉素B结合 至构成脂质体12的双分子脂质膜的状态的截面图。而且，图19示出了显示其中两性霉素 B结合至双分子脂质膜(未示出)的状态的平面图。如图19中所示，以环形式结合至双分 子脂质膜的多个两性霉素B分子形成了以两性霉素B加边并穿过双分子脂质膜的孔。已经 报道了，通过两性霉素B可以在脂质体中形成孔(参照，例如非专利文献幻。孔具有这样的 尺寸使得葡萄糖可以渗透，而酶⑶H和DI以及辅酶NADH不能渗透。如上所述，根据第一实施方式，用于使葡萄糖分解的酶反应所需的酶13和14以及 辅酶15被封入其中通过使抗生素16结合至双分子脂质膜而形成孔17的脂质体12中。另 外，脂质体12被固定在电极11上。因此，酶反应可以利用脂质体12中的微小空间作为反 应场而有效地进行，并且电子可以从用作基质的葡萄糖中有效地取出并传递至电极11。另 外，与传统的酶等通过聚离子络合物等直接固定在电极11上相比，可以简单地进行固定。(2.第二实施方式)[生物燃料电池]接着，描述本发明的第二实施方式。在第二实施方式中，使用根据第一实施方式的 酶固定电极作为生物燃料电池的负极。图20示意性地示出了该生物燃料电池。该生物燃料电池使用葡萄糖作为燃料。图 21示意性地示出了该生物燃料电池的负极的详细构造，封入固定在负极上的脂质体12内 的酶组和辅酶的实例，以及酶组和辅酶的电子传递反应。如图20和图21所示，该生物燃料电池具有其中负极21和正极22通过设置在其 间的电解质层23而相互面对的结构。在负极21上，利用酶分解作为燃料供给的葡萄糖从 而取出电子，并产生质子(H+)。在正极22上，由从负极21穿过电解质层23而传递的质子、 从负极21通过外电路传递的电子、以及空气中的氧来产生水。作为负极21，使用了根据第一实施方式的酶固定电极。具体地，该酶固定电极包 括其上固定了具有能渗透葡萄糖并在双分子脂质膜中形成的孔17的脂质体12的电极11。 在脂质体12中，封闭了参与葡萄糖的分解的酶、伴随葡萄糖分解过程的氧化反应产生还原 形式的辅酶、以及氧化辅酶的还原形式的辅酶氧化酶。如果需要，除了脂质体12外，从辅酶 氧化酶接收伴随辅酶的氧化而产生的电子并将电子传递至电极11的电子介体也被固定在 电极11上。作为参与葡萄糖的分解的酶，例如，可以使用葡萄糖脱氢酶(GDH)、优选NAD-依 赖型葡萄糖脱氢酶。在氧化酶存在的情况下，例如，β-D-葡萄糖可以被氧化成D-葡萄糖 酸-S -内酯。而且，该D-葡萄糖酸-δ -内酯可以在葡糖酸激酶和磷酸葡糖酸脱氢酶(W1OTH) 这两种酶存在的情况下被分解成2-酮-6-磷酸-D葡萄糖酸盐。S卩，D-葡萄糖酸-δ -内 酯通过水解而转化成D-葡萄糖酸盐，而D-葡萄糖酸盐在葡萄糖酸激酶存在的情况下通过 使三磷酸腺苷(ATP)水解成二磷酸腺苷(ADP)和磷酸而磷酸化成6-磷酸-D葡萄糖酸盐。
18这种6-磷酸-D-葡萄糖酸盐通过氧化酶Wi⑶H的作用而被氧化成2-酮-6-磷酸-D-葡萄
糖酸盐。另外，除了上述分解过程外，可以通过使用糖代谢，将葡萄糖分解成C02。利用糖代 谢的分解过程大致分成通过糖解系统的葡萄糖分解，丙酮酸的形成，以及TCA循环，但是这 些都是众所周知的反应体系。在单糖分解过程中的氧化反应伴随辅酶的还原反应而进行。辅酶基本上根据酶作 用而确定，并且在⑶H的情况下，NAD+被用作辅酶。S卩，当β -D-葡萄糖通过⑶H的作用被 氧化成D-葡萄糖酸-δ -内酯时，NAD+被还原成NADH从而产生H+。产生的NADH在心肌黄酶(DI)存在的情况下立即氧化成NAD+从而产生两个电子 和H+。因此，两个电子和两个H+通过每分子葡萄糖的一个步骤(一个阶段)的氧化反应而 产生。在两个步骤的氧化反应中，总共产生四个电子和四个H+。在上述过程中产生的电子从心肌黄酶通过电子介体被传递至电极11，并且H+通过 电解质层23被传递至正极22。优选用包含在电解质层23中的缓冲溶液，例如，磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲溶液 等，将其中封入了酶和辅酶的脂质体12以及电子介体保持在对于酶来说最佳的ρΗ，例如， 接近PH 7，以便允许有效和恒定的电极反应。作为磷酸盐缓冲溶液，例如，使用NaH2PO4或 KH2PO40而且，过高或过低的离子强度(I. S.)均不利地影响酶活性，但是考虑到电化学反应 性，适当的离子强度，例如，约0. 3，是优选的。然而，对于每一种所用的酶存在最佳的ρΗ值 和离子强度值，并且PH和离子强度并不限于上述值。作为一个实例，图21示出了这样的情况在葡萄糖的分解中涉及的酶是葡萄糖脱 氢酶(GDH)，与葡萄糖的分解过程中的氧化反应一起产生还原形式的辅酶是NAD+，氧化作为 辅酶的还原形式的NADH的辅酶氧化酶是心肌黄酶(DI)，并且，从辅酶氧化酶接收伴随辅酶 的氧化而产生的电子并将电子传递至电极11的电子介体是ACNQ。正极22包括由电极材料，例如多孔碳等，以及分解氧的酶，例如，胆红素氧化酶、 漆酶、抗坏血酸氧化酶等构成的电极，所述酶被固定在电极上。正极22的外侧部分(与电 解质层23相对的部分)通常是由多孔碳构成的气体扩散层制成，但是外侧部分不限于此。 除了酶之外，优选地，将电子传递至正极22的电子介体也被固定在正极22上。在正极22上，空气中的氧在分解氧的酶存在的情况下被还原，由于来自电解质层 23的H+和来自负极21的电子而生成水。电解质层23适于将在负极21上产生的H+传递至正极22，并且由不具有电子传导 性且可以传递H+的材料构成。作为电解质层23，具体地，例如，可以使用上述材料如玻璃纸寸。在如上所述构造的生物燃料电池中，当葡萄糖被供给至负极21时，葡萄糖利用包 括氧化酶的分解代谢酶(异化酶，catabolic enzyme)而分解。因为氧化酶参与单糖的分 解过程，所以可以在负极21侧生成电子和H+，并且可以在负极21与正极22之间产生电流。接着，描述了生物燃料电池的结构的具体实例。如图22A和图22B中所示，生物燃料电池具有其中负极21和正极22通过设置在 其间的电解质层23而相互面对的构造。在这种情况下，Ti集电极41和42分别设置在正极 22和负极21的下方，使得电流可以被容易地收集。参考数字43和44均表示固定板。固定板43和44用螺丝45紧固从而使所有正极22、负极21、电解质层23、以及Ti集电极41和 42保持在其间。在固定板43的侧面之一(外侧面)上设置进气圆形凹部43a，并且在凹部 43a的底部设置许多孔43b以便穿过另一侧。这些孔4 用作向正极22供给空气的通道 (空气供给通道)。另一方面，装填燃料的圆形凹部4 设置在固定板44的侧面之一(外 侧)中，并且在凹部44a的底部设置许多孔44b以便穿过另一侧。这些孔44b用作向负极 21供给燃料的通道(燃料供给通道)。隔板(spacer) 46设置在固定板44的另一侧的周边 部分中，使得当用螺丝45将固定板43和44紧固在一起时，在固定板43与44之间形成预 定的空间。如图22B中所示，负载47连接在Ti集电极41与42之间，使得通过将含有溶解在 磷酸盐缓冲溶液中的葡萄糖的葡萄糖溶液作为燃料置于固定板44的凹部44a中来产生电 力。根据第二实施方式，使用包括电极11的酶固定电极作为负极21，在所述电极上固 定了具有通过结合抗生素16而在双分子脂质膜中形成的孔17的脂质体12，酶反应所需的 酶组和辅酶被封入脂质体12中。因此，酶反应可以利用脂质体12中的微小空间作为反应 场有效进行，电子可以从作为燃料的葡萄糖中有效地取出并传递至电极11，并且与使用聚 离子络合物等直接固定在电极11上相比，酶等可以被简单地固定。因为用作负极21的酶 固定电极具有高效率，所以可以实现高效率的生物燃料电池。另外，为了实现生物燃料电池 的更高输出，有必要从用作燃料的葡萄糖中取出两个或更多个电子，由此导致需要使用三 种以上类型的酶固定在其上的适当位置的酶固定电极作为负极21。然而，这种需要也可以 通过在脂质体12中封入三种以上类型的酶来满足。另外，通过将其中分别封入了三种或更 多种不同类型的酶的许多类型的脂质体混合而易于实现各种类型的燃料的应用。而且，也 可以实现其中布置有负极脂质体和正极脂质体的微型生物燃料电池。(3.第三实施方式)[生物燃料电池]根据第三实施方式的生物燃料电池具有与根据第二实施方式的生物燃料电池相 同的构造，不同之处在于，如图23A和图23B中所示的多孔导电性材料被用作负极21的电 极材料。图23A示意性地示出了多孔导电性材料的结构，并且图23B是多孔导电性材料的 骨架部分的截面图。如图23A和图23B中所示，多孔导电性材料包括由具有三维网络结构 的多孔材料构成的骨架79a和覆盖骨架79a的表面的碳基材料79b，与在第二实施方式中相 同的脂质体12被固定在碳基材料79b的表面上。多孔导电性材料具有三维网络结构，其中 被碳基材料79b包围的许多孔80对应于网格(网目，meshes)。在这种情况下，孔80彼此 连通。碳基材料79b的形式并无限制并且可以是纤维形式(针状)，颗粒形式等中的任何一 种。作为由多孔材料构成的骨架79a，可以使用发泡金属或发泡合金，例如，发泡镍。 骨架79a的孔隙率通常为85%以上或90%以上，并且孔径通常为，例如，IOnm至1mm，IOnm 至600 μ m，或1至600 μ m,典型地50至300 μ m,更典型地为100至250 μ m。作为碳基材料 79b，例如，优选高导电性材料如科琴黑(Ketjenblack)等，但是可以使用功能性碳材料如
碳纳米管、富勒烯等。
多孔导电性材料的孔隙率通常为80%以上或90%以上，并且孔80的直径通常为， 例如，9nm至1mm，9nm至600 μ m，或1至600 μ m，典型地为30至400 μ m，更典型地为80至 230 μ m0接着，描述用于生产多孔导电性材料的方法。如图24Α中所示，首先制备由发泡金属或发泡合金(例如，发泡镍)构成的骨架 79a。接着，如图MB中所示，用碳基材料79b涂敷由发泡金属或发泡合金构成的骨架 79a的表面。作为涂敷方法，可以使用传统的已知方法。例如，通过利用喷雾器对含有碳粉 末、适当的粘结剂等的乳状液进行喷雾而用碳基材料79b涂敷骨架79a的表面。考虑由发 泡金属或发泡合金构成的骨架79a的孔隙率和孔径，根据多孔导电性材料所需的孔隙率和 孔径，来确定该碳基材料79b的涂敷厚度。在涂敷期间，被碳基材料79b包围的许多孔80 彼此相通。结果，生产了预想的多孔导电性材料。然后，将脂质体12固定在多孔导电性材料 的碳基材料79b的表面上。除了上述以外的条件与第二实施方式中的相同。根据第三实施方式，除了第二实施方式的优点之外，可以获得以下描述的优点。 即，包含由发泡金属或发泡合金构成的骨架79a并具有用碳基材料79b覆盖的表面的多孔 导电性材料具有足够大直径的孔80，并且在保持粗糙的三维网络结构的同时具有高强度和 高电导率，并可以获得必需的且足够的表面积。因此，包括通过将酶、辅酶和电子介体固定 在用作电极材料的多孔导电性材料上而生产的酶/辅酶/电子介体固定的电极的负极21 在其上能够进行高效率的酶代谢反应，并且有效地捕捉在电极附近出现的酶反应现象作为 电信号，并且不管使用环境如何都是稳定的，并可以实现高性能的生物燃料电池。(4.第四实施方式)[细胞]在第四实施方式中，在构成从生物收集的细胞或通过培养从生物收集的细胞而获 得的细胞的细胞膜的双分子脂质膜中形成一个或多个能渗透葡萄糖的孔。图25示出了由细胞的外周的双分子脂质膜构成的细胞膜81的一部分。虽然本 文中考虑了其中细胞是动物细胞的情况，但是细胞也可以是植物细胞。细胞主要包含细胞 核，如线粒体、内质网、高尔基体的细胞器，溶酶体等，以及其中溶解有各种离子、营养物、酶 等的水。如图25所示，各种蛋白82、83和84包埋在细胞膜81中。例如，蛋白82是将离子 等从细胞的外部传输至内部的泵蛋白(pump protein)，蛋白83是膜内在蛋白质(膜整合蛋 白)，而蛋白84是具有在细胞的内部与外部之间传输指定分子的功能的通道蛋白。除了上 述各种蛋白82、83和84外，抗生素16还结合至细胞膜81从而形成一个或多个能渗透葡萄 糖的孔17。如所描述构造的细胞通过传统已知的方法固定在由多孔碳等构成的电极上。根据第四实施方式，当细胞置于包含葡萄糖的缓冲溶液中时，葡萄糖可以通过渗 透通过细胞膜81的孔17而被截留。截留在细胞内的葡萄糖通过代谢系统如柠檬酸循环、 糖解系统、戊糖磷酸盐循环等分解以释放电子。释放的电子最终通过电子介体或无需电子 介体直接传递至其上固定有细胞的电极，并向外部发送。因此，可以由葡萄糖产生电能。
(5.第五实施方式)[线粒体]在第五实施方式中，在构成包含在从生物收集的细胞或通过培养从生物收集的细 胞而获得的细胞中的作为细胞器的线粒体的双分子脂质膜中形成一个或多个能渗透葡萄 糖的孔。线粒体用作真核细胞的能量生产�。⑶依猛ü澄锏姆肿友趸从Χ竦玫� 能量产生ATP。图沈示出了线粒体。如图沈所示，线粒体具有外膜85和内膜86。这些外膜85 和内膜86是均包含双分子脂质膜的细胞膜。内膜86形成折叠的鸡冠状突起(crista)。许 多类型的酶集中在内膜86内的基质空间(matrix spaCe)87中。分子氧化的最终阶段发生 在内膜86中。抗生素16结合至构成该线粒体的外膜85和内膜86的细胞膜从而形成一个 或多个能渗透葡萄糖的孔17。如以上描述构造的线粒体通过传统已知的方法固定在由多孔碳构成的电极上。根据第五实施方式，当线粒体被置于含有葡萄糖的缓冲溶液中时，葡萄糖可以通 过渗透通过外膜85和内膜86的孔17而被截留。截留在线粒体内的葡萄糖通过线粒体所 拥有的氧化系统，如柠檬酸循环、糖解系统、戊糖磷酸盐循环等分解从而释放电子。释放的 电子最终通过电子介体或无需电子介体直接传递至其上固定有线粒体的电极，并向外部发 送。因此，可以由葡萄糖产生电能。(6.第六实施方式)[细菌]在第六实施方式中，在构成细菌的细胞膜的双分子脂质膜中形成一个或多个能渗 透葡萄糖的孔。图27示出了一种细菌。这里，考虑了其中细菌是固有细胞(intrinsic cell)的 情况。如图27中所示，细菌由囊88、细胞壁89和细胞膜90从外部按该次序包围，并且其 中含有细胞质91。鞭毛92和纤毛93结合至细菌的外部。然而，一些类型的细菌并不具有 囊88、鞭毛92和纤毛93。例如，大肠杆菌并不具有囊88、鞭毛92和纤毛93。虽然在图中 没有示出，但是在细胞质中存在类核、核糖体等。在细胞质91中，电子转移系统和蛋白如各 种运载子(transporters)分布在细胞膜90内。抗生素16结合至包含双分子脂质膜的细 胞膜90从而形成一个或多个能渗透葡萄糖的孔。如以上描述构造的细菌通过传统已知的方法固定在由多孔碳构成的电极上。根据第六实施方式，当细菌被置于含有葡萄糖的缓冲溶液中时，葡萄糖可以通过 渗透通过细菌的细胞膜90的孔17而被截留。截留在细菌中的葡萄糖通过细菌所拥有的代 谢系统，如柠檬酸循环、糖解系统、戊糖磷酸盐循环等分解从而释放电子。释放的电子最终 通过电子介体或无需电子介体直接传递至其上固定有细菌的电极，并向外部发送。因此，可 以由葡萄糖产生电能。(7.第七实施方式)[生物燃料电池]根据第七实施方式的生物燃料电池具有与根据第二实施方式的生物燃料电池相 同的构造，不同之处在于，使用如图28A和图28B所示的多孔电极作为负极21的电极11。图^A示出了包括多孔电极的电极11的整个构造，而图28B示意性地示出了电极11的截面结构。如图^B中所示，包括多孔电极的电极11具有许多孔11a。与第二实施方 式中相同的脂质体12(在图中没有示出封入内部水相中的酶和辅酶、结合至双分子脂质膜 的抗生素、以及用抗生素加边的孔)固定在孔Ila的内表面上。在这种情况下，孔Ila彼此 连通。作为多孔电极的材料，优选使用碳基材料，但是该材料并不限于此。多孔电极典型地 是碳糊电极。脂质体12可以通过使包含脂质体12的溶液渗透到电极11中而固定在包括多孔 电极的电极11的孔Ila的内表面上。除了上述之外的条件与第二实施方式中的相同。 根据第七实施方式，可以获得与第三实施方式中相同的优点。(8.第八实施方式)[酶固定电极]图四示出了根据本发明的第八实施方式的酶固定电极。在该酶固定电极中，使用 葡萄糖作为基质。如图四中所示，在该酶固定电极中，抗生物素蛋白101固定在由多孔碳等构成的 电极11的表面(包括电极11中的孔的内表面)上。另一方面，生物素102结合至与第一 实施方式中相同的脂质体12。另外，固定在电极11的表面上的抗生物素蛋白101不可逆地 特异性结合至结合于脂质体12的生物素102。虽然图四示出了其中生物素102结合至一 个脂质体12的情况，但是多个生物素102分子可以结合至一个脂质体12。参与目标酶反应的酶13和14以及辅酶15被封入脂质体12中的水相12a内。除 此之外，这些酶13和14以及辅酶15，例如，电子介体可以被封入脂质体12中的水相1 内。电子介体可以与脂质体12—起被固定在电极11上。酶13是促进用作基质的葡萄糖 氧化从而使葡萄糖分解的氧化酶，而酶14是使利用葡萄糖的氧化而还原的辅酶15回到氧 化形式并通过电子介体将电子传递至电极11的辅酶氧化酶。虽然在图中未示出，但是像在图2所示的脂质体12中一样，一种或多种抗生素16 结合至构成脂质体12的双分子脂质膜，形成穿透双分子脂质膜的用抗生素16加边形式的 孔。[用于生产酶固定电极的方法]例如，可以如下来生产酶固定电极。首先，形成脂质体12，在该脂质体12中，封入 酶13和14以及辅酶15，并且其中生物素102结合至外周面。为了将生物素102结合至脂 质体12，例如，使用用NHS酯改性的生物素102，并且用例如，磷脂酰乙醇胺脱水-稠合从而 形成酰胺键。接着，抗生素结合至构成脂质体12的双分子脂质膜，形成孔。另一方面，将抗 生物素蛋白101固定在电极11的表面上。为了将抗生物素蛋白101固定在电极11上，例 如，使用与其上结合了抗生物素蛋白101的琼脂糖珠混合的碳糊电极作为电极11，或将抗 生物素蛋白101包埋在电极11的表面上的聚合物如聚-L-枸杞碱(甜菜碱)(PLL)等中。 接着，通过使固定在电极11的表面上的抗生物素蛋白101和结合至其中形成有孔17的脂 质体12的生物素102结合，将脂质体12固定在电极11上。因此，生产了酶固定电极。可 以在封入酶13和14以及辅酶15之前，使抗生素结合至构成脂质体12的双分子脂质膜从 而形成孔。另外，可以在将脂质体12固定在电极11上之后，使抗生素结合至构成脂质体12 的双分子脂质膜从而形成孔。
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(实施例2)如下来形成酶固定电极。称取5mg的心肌黄酶(DI) (EC 1. 8. 1. 4，由Amano Enzyme Inc.制造)并溶解在 ImL的缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备5mg/mL的DI酶缓冲溶液。称取25mg 的葡萄糖脱氢酶(GDH) (NAD-依赖型，EC 1. 1. 1. 47，由 Amano Enzyme Inc.制造)并溶解在ImL的缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液，pH 7)中从而制备25mg/mL 的GDH酶缓冲溶液。其中溶解有每一种酶的缓冲溶液优选进行冷冻直至刚好溶解之前，并且酶缓冲溶 液也优选尽可能地进行冷冻。将NADH (由Sigma-Aldrich Ltd.制造)溶解在缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲溶液， PH 7)中从而制备50mM的NADH酶缓冲溶液。将2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯并醌0)0)溶解在缓冲溶液(IOmM磷酸盐缓冲 溶液，PH 7)中从而制备IOmM的QO缓冲溶液。使用卵黄卵磷脂(由Wako制造)和生物素改性的磷脂酰乙醇胺(1，2_ 二棕榈 酰-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇胺-N-(帽生物素基，cap biotinyl)作为磷脂。生物素改性的脂质体如下形成将卵磷脂溶解在乙醇中从而制备lOOmg/mL的卵磷脂溶液。另外，将生物素改性的 磷脂酰乙醇胺溶解在CHCl3、甲醇和水(CHCl3 甲醇水=65 35 8)的混合溶液中从 而制备lOmg/mL的生物素改性的磷脂酰乙醇胺溶液。向20mL的乙醇中加入ImL的卵磷脂溶液和50 μ L的生物素改性的磷脂酰乙醇胺 溶液，接着充分混合。通过用旋转蒸发器在40°C浴中在真空下处理由此获得的混合溶液Ih 以上而在减压下除去溶剂。接着，向所得的产品中加入50μ L的25mg/mL⑶H酶缓冲溶液，50 μ L的5mg/mL DI 酶缓冲溶液和50 μ L的50mM NADH缓冲溶液的混合物，并且将所得的混合物浸没在超声浴 中30至60秒。在该处理期间，磷脂膜通过用聚四氟乙烯刮刀刮研而进行混合。接着，将如上述制备的脂质体溶液转移至1. 5mL的管中，并且剩余的脂质体溶液 用50 μ L的IOOmM磷酸盐缓冲溶液回收，接着在1500g和4分钟的条件下，用ImL的IOOmM 磷酸盐缓冲溶液离心冲洗2次。将所得的封入⑶H/DI/NADH的生物素改性的脂质体悬浮于在600 μ L的0. IM磷酸 盐缓冲溶液中，并加入两性霉素B，使得最终浓度为ImM并用涡流混合。因此，形成了其中封入⑶H、DI和NADH并且其上结合了两性霉素B的生物素改性 的脂质体。抗生物素蛋白改性的电极如下形成向通过将具有均一粒径的石墨粉末和用作粘合剂的石蜡油混合而生产的200mg 碳糊(由B.A.S Co. , Ltd.制造)中，加入100 μ L的抗生物素蛋白琼脂糖珠悬浮液并在玛 瑙研钵上用轻的力量捏合。接着，由此获得的含抗生物素蛋白的碳糊在干燥器中干燥Ih以 上，然后捏合成其上表面中具有袋状部(pocket)(凹部)的电极的袋状部。然后，将电极的 上表面侧以圆周运动压在复写纸上从而压平表面。如以上描述的来形成抗生物素蛋白改性的电极。
接着，将其中封入了⑶H、DI和NADH并且其上结合有两性霉素B的生物素改性的 脂质体如下固定在抗生物素蛋白改性的电极上首先，将如上所述形成的抗生物素蛋白改性的电极浸没在300 μ L的如上述形成 的生物素改性的脂质体中。然后，在室温下培养Ih之后，用500 μ L的0. IM磷酸盐缓冲溶 液冲洗电极2次。图30示出了其上固定有生物素改性的脂质体的抗生物素蛋白改性的电极，GDH、 DI和NADH被封入脂质体中而两性霉素B结合至该脂质体。如图30所示，碳糊电极104包 埋在设置在电极103的上表面中的袋状部103a中，而抗生物素蛋白101固定在碳糊电极 104上。另外，脂质体12通过将抗生物素蛋白101结合至脂质体12的生物素102而结合 至碳糊电极104。封入脂质体12内的水相12a中的酶13和14以及辅酶15分别是⑶H、DI 禾口 NADH。测量如上述形成的脂质体固定的电极(在下文中，根据需要缩写为 "AviCPE-BioLipo“)的电化学响应。作为第一比较例，如图31所示，除了抗生物素蛋白101 没有被固定在碳糊电极104上之外，通过与上述相同的方法来形成相同的脂质体固定的电 极(在下文中，根据需要缩写为“CPE-BioLipo”)。作为第二比较例，如图32所示，除了生 物素102没有被结合至脂质体12外，通过与上述相同的方法来形成相同的脂质体固定的电 极(在下文中，根据需要缩写为“AviCPE-Lipo”)。作为第三比较例，如图33所示，除了抗 生物素蛋白101没有被固定在碳糊电极104上并且生物素102没有被结合至脂质体12之 外，通过与上述相同的方法来形成相同的脂质体固定的电极(在下文中，根据需要缩写为 “CPE-Lipo”)。在2mL管中，加入180 μ L的0. IM磷酸盐缓冲溶液和20 μ L的IOmMQO缓冲溶液，使 得QO缓冲溶液的最终浓度为ImM，并且将作为对电极的钼丝、AglAgCl参比电极、以及上述 4 种类型的脂质体固定的电极(AviCPE-BioLipo、CPE-BioLipo, AviCPE-Lipo 和 CPE-Lipo) 中的每一个浸没在管中，并且在相对于Ag I AgCl设定成+0. 3V的电位下进行计时电流法。在 测定开始之后，加入20μ L的IM葡萄糖溶液，使得最终浓度为100mM。计时电流法的结果在 图34中示出。在图34中，对所示的每一电流(I)-时间曲线加上0. 03 μ A的偏移量，但是 基线电流值基本上是相同的。由图34可以发现，与其它脂质体固定的电极(CPE-BioLipo、 AviCPE-Lipo和CPE-Lipo)相比，仅当使用脂质体固定的电极(AviCPE-BioLipo)时，其中抗 生物素蛋白101固定在碳糊电极104上而生物素102结合至脂质体12，观察到了对加入葡 萄糖的0. 015 μ A — 0. 023 μ A的相对高的电流值响应。如上所述，根据第八实施方式，用于分解葡萄糖的酶反应所需的酶13和14以及辅 酶15被封入具有通过结合抗生素16而在双分子脂质膜中形成的孔17的脂质体12中。另 外，抗生物素蛋白101被固定在电极11上，生物素102结合至脂质体12，并且脂质体12通 过使固定在电极11上的抗生物素蛋白101和结合至脂质体12的生物素102结合而固定在 电极11上。因此，除了与第一实施方式中相同的优点外，可以获得允许脂质体容易地、可靠 地、牢固地固定在电极11上的优点。脂质体固定的电极适用于，例如，作为生物燃料电池的 负极。(9.第九实施方式)[酶固定电极]
图35示出了根据第九实施方式的酶固定电极。在该酶固定电极中，使用葡萄糖作 为基质。如图35所示，在酶固定电极中，多层脂质体12利用抗生物素蛋白101具有4个生 物素结合袋状部而固定在电极11的表面上。即，如同在第八实施方式中的一样，脂质体12 通过固定在电极11的表面上的抗生物素蛋白101与结合至脂质体12的生物素102之间不 可逆的特异性结合而固定在电极11上。另外，在这种情况下，多个生物素102的分子(在 如图35所示的实例中，2个)结合至固定在电极11的表面上的脂质体12。并不用于固定 在电极11的表面上固定的脂质体12的生物素102结合至并未固定在电极11的表面上的 抗生物素蛋白101。并未固定的抗生物素蛋白101结合至结合于其它脂质体12的一个或 两个或多个生物素102，从而使脂质体12彼此结合。因此，多层脂质体12被固定在电极11 的表面上。其它条件与第八实施方式中的相同。[用于生产酶固定电极的方法]为了生产酶固定电极，通过与用于根据第八实施方式的酶固定电极相同的方法， 将脂质体12固定在电极11上，然后，通过例如加入抗生物素蛋白101或抗生物素蛋白琼脂 糖对脂质体12进行层压。在这种情况下，脂质体12的层压层的厚度和脂质体12的密度可 以通过调节加入的抗生物素蛋白的量和构成脂质体12的双分子脂质膜中生物素改性的脂 质的比例来进行控制。根据第九实施方式，可以获得与第八实施方式中相同的优点。虽然上面具体地描述了本发明的实施方式和实施例，但是本发明并不仅限于上述 实施方式和实施例，并且基于本发明的技术构思可以进行各种修改。例如，在上述实施方式和实施例中描述的数值、结构、构造、形状、材料等仅仅是实 例，并且根据需要可以使用与这些不同的数值、结构、构造、形状、材料等。另外，根据本发明的利用抗生物素蛋白与生物素之间的特异性结合在电极上固定 脂质体的方法是一种对于其中构成脂质体的双分子脂质膜并不具有能渗透葡萄糖的孔的 情况有效的方法。例如，当该电极作为燃料电池的负极时，燃料不限于葡萄糖，并且可以使 用各种燃料如醇类。参考符号列表11电极12脂质体13、14 酶15辅酶16抗生素17孔21负极22正极23电解质层41,42 Ti 集电极43、44 固定板47负载
81,90细胞膜85外膜86内膜101抗生物素蛋白102生物素。
权利要求
1.一种燃料电池，被构造成具有正极和负极通过设置在其间的质子导体而彼此面对的 结构，并利用酶从燃料中取出电子，其中，至少一种类型的酶被封入脂质体中；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。
2.根据权利要求1所述的燃料电池，被构造成利用所述酶和辅酶从所述燃料中取出电 子，其中至少一种类型的酶和至少一种类型的辅酶被封入所述脂质体中。
3.根据权利要求2所述的燃料电池，其中，所述孔通过结合至所述双分子脂质膜的抗 生素而形成。
4.根据权利要求3所述的燃料电池，其中，所述抗生素是两性霉素B。
5.根据权利要求3所述的燃料电池，其中，所述抗生素是离子载体。
6.根据权利要求1所述的燃料电池，其中，所述脂质体被固定在所述负极上。
7.根据权利要求6所述的燃料电池，其中，被固定在所述负极上的第一物质以及结合 至所述脂质体的第二物质彼此结合。
8.根据权利要求7所述的燃料电池，其中，所述第一物质和所述第二物质的组合是抗 生物素蛋白和生物素、抗原和抗体、蛋白A和免疫球蛋白IgG、蛋白G和免疫球蛋白IgG、糖分 子和凝集素、DNA和互补链DNA、谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶、肝素和肝素_结合分子、激 素和激素受体、或羧酸和酰亚胺。
9.根据权利要求7所述的燃料电池，其中，至少两种脂质体彼此结合。
10.一种用于生产燃料电池的方法，所述燃料电池具有正极和负极通过设置在其间的 质子导体而彼此面对的结构，使得利用酶从燃料中取出电子，所述方法包括以下步骤在至 少一种类型的酶被封入脂质体中之后，在构成所述脂质体的双分子脂质膜中形成一个或多 个能渗透葡萄糖的孔。
11.根据权利要求10所述的用于生产燃料电池的方法，其中，所述燃料电池利用所述 酶和辅酶从燃料中取出电子，并且至少一种类型的酶和至少一种类型的辅酶被封入所述脂 质体中。
12.一种包括一个或多个燃料电池的电子设备，其中所述燃料电池中的至少一个被构造成具有正极和负极通过设置在其间的质子导 体而彼此面对的结构，并利用酶从燃料中取出电子；至少一种类型的酶被封入脂质体中；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。
13.根据权利要求12所述的电子设备，其中，所述燃料电池被构造成利用所述酶和辅 酶从所述燃料中取出电子，并且至少一种类型的酶和至少一种类型的辅酶被封入所述脂质 体中。
14.一种酶固定电极，其中，固定了封入有至少一种类型的酶的脂质体；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。
15.根据权利要求14所述的酶固定电极，其中，至少一种类型的酶和至少一种类型的 辅酶被封入所述脂质体中。
16.一种利用酶的生物传感器，其中至少一种类型的酶被封入脂质体中；并且构成所述脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。
17.一种能量转换元件，使用其中封入了至少一种类型的酶的脂质体，其中，构成所述 脂质体的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。
18.一种细胞，其中，构成细胞膜的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。
19.一种细胞器，其中，构成细胞膜的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。
20.一种细菌，其中，构成细胞膜的双分子脂质膜具有一个或多个能渗透葡萄糖的孔。
全文摘要
本发明提供了一种燃料电池及其生产方法，其中在微小空间内封入一种或多种类型的酶或另外的辅酶使得电子可以通过酶反应利用该微小空间作为反应场而有效地从燃料如葡萄糖等中取出，由此产生电能，并且其中所述酶或另外的辅酶可以易于被固定在电极上。酶反应所需的酶(13)和(14)以及辅酶(15)被封入脂质体(12)中，并且该脂质体(12)固定在由多孔碳等构成的电极的表面上从而形成酶固定电极。抗生素(16)被结合至构成脂质体(12)的双分子脂质膜从而形成一个或多个能渗透葡萄糖的孔(17)。该酶固定电极被用作例如生物燃料电池的负极。
文档编号G01N27/327GK102124598SQ201080002363
公开日2011年7月13日 申请日期2010年6月4日 优先权日2009年6月8日
发明者户木田裕一, 松本隆平, 藤田修二, 酒井秀树 申请人:索尼公司
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