专利名称：终点明显的时间温度指示剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用以指示产品的时间-温度历程的指示剂体系。更具体地说，本发明涉及一种改进的新型时间温度综合指示剂，用以监测食品或其它物质冷藏贮存的安全极限。
检测食品是否经历过有害温度条件的必要性已得到公认，在专利文献中已叙述了许多这种指示剂装置。这些指示剂中特别普遍的一类是用来检测冷冻食品是否曾经解冻过的指示剂。通常，这些冷冻指示剂包括一种冷冻物质，它在某个预先选定的温度下融化，从而以化学的或物理的方式使一种指示剂不可逆地活化。这些装置中典型的是在美国专利3，437，010及其它文献所提到的那些装置。大多数冷冻食品指示剂装置只发出解冻的信号，并不试图测量产品的解冻时间或产品正在或曾经解冻时所达到的温度。
另一类已知的食品指示剂采用灯芯或类似的可渗透元件的扩散或毛细作用来划分等级，美国专利3，414，415和3，479，877中提到的那些是其中的几个例子。
现已认识到，各种天然的和合成的物质，即使采取了诸如冷藏贮存、惰性气氛中包装、杀菌和加入防腐剂等预防措施，也会随着时间的推移而变质。例如，食物、薄膜、药物、生物制剂等，即使经过灭菌或保存在足够低的温度下以防止微生物分解作用，也都会随着时间的推移而分解。分解的原因可能各式各样，包括纯粹的化学反应，例如氧化和酶促反应。因此，各类物质的允许保存期限通常都有一极限，超过此期限则某些性质会发生可觉察的变化。在食品包装工业中希望有一种体系能够指示何时超过此时间极限。
在这些过程中涉及的变质动力学可能极其复杂。一般来说，变质是温度的函数，但是，产品变质的速度可以随温度而变，于是，在第一个温度下观察到一个变质速度，而在第二个温度下则观察到不同的变质速度。变质的总量则取决于产品在每个温度下保存的时间，即取决于时间和温度的综合值。例如，由同时包装的两个相同的食物样品可以看出这一点的实际影响。对于这两个样品都可能有一个一定的时间温度综合值，在这之后食物品质将发生可觉察的变化。如果一份包装在其销售或贮存过程中温度升高10°或20°或更高，与在整个贮存期间保持适当的较低冷藏温度的另一包装相比，其品质保存期限将缩短。假如这两个样品都存放在通常的冷藏陈列柜中，打算购买这些包装的消费者将无法判断他们要购买的产品在温度历程上的差别。
曾有人提出过用来监测产品温度历程的各种体系。美国专利2，671，028在指示剂系统中使用一种酶，例如胃蛋白酶。美国专利3，751，382公开了一种酶指示剂，其中脲酶将尿素分解，反应产物使体系的PH改变。酶的活性及由其造成的分解速度依赖于温度，于是由酶活性造成的PH变化可以用常规的酸指示剂监测。美国专利3，768，976描述了另一种体系，其中用氧化还原染料监测透过薄膜的氧而得到时间温度综合值。
最后，在美国专利3，942，467中描述了一种时间温度综合指示剂，其中包括一种产生有机酸的组分，该组分以第一反应速度发生溶剂分解作用，生成已知数量的酸。溶剂或溶剂分解介质含有已知数量的碱性物质，它足以中和在指定时间内和指定的反应温度下由于溶剂分解而产生的酸。溶剂化反应的速度随温度升高而加快。用一种对PH敏感的染料指示何时已产生了数量足以中和所有碱性物质的酸。在一个优选实施方案中，使用两个分开的、碱度不同的碱性物质与一种以上的PH敏感染料相组合。根据这一优选实施方案，指示剂溶液显示第一种颜色，直到第一种碱性物质已被中和到足以使指示剂的PH降至第一中间区的程度，从而使颜色变成第二种中间颜色。第二种颜色保持到第二种碱性物质被中和，指示剂的PH移至酸性范围，此时整个指示剂变成第三种颜色。
根据这一先有技术指示剂，观察到指示剂逐渐改变颜色，产生可觉察的颜色变化的时滞比某些指示剂应用中所希望或所需要的要长。另外，由该专利显然可见，酸性前体物质的溶剂分解需要使用特殊的溶剂组合以增加溶剂化反应的半寿期。在该专利中建议的助溶剂包括二噁烷，这一点现在看来是不理想的。这些助溶剂一般要有节制地使用。
在研制令人满意的时间温度综合指示剂过程中的一个基本问题是，时间温度分解过程的二阶导数(单位温度变化造成的速度变化)随产品而异。因此，某些水果和浆果的单位温度变化造成的变质速度变化与瘦肉的速度变化很不相同。奶制品的数值与浆果和肉类均不相同。因此，一种依赖于单一酶促反应或指定膜的透性的体系只适合作为某些物质的指示剂，这些物质的某种分解反应的速度变化与温度的关系曲线有相似的斜率。
时间温度综合指示剂体系不限于用来在低于室温的温度下长期贮存期间进行监测。同样的考虑也适用于较短的时间间隔和高温。例如，这些体系可以用来确保产品已经充分地加热灭菌。因此该指示剂极其适合于保证高压灭菌的罐装食品的确经历了足够的时间与温度综合值，满足达到必要的微生物杀灭程度的需要。在这种情况下，以指示剂着火作为已达到或超过必要的灭菌参数的信号。类似地，这类指示剂可以用来保证外科器械已经历了适当的灭菌条件，或是药物的贮存时间尚未超过允许期限。同样，这类指示剂可用在乳品工业中指示奶制品已经经过适当的巴氏灭菌处理等。
先有技术时间温度综合指示剂的一个主要问题是它们的时间响应通常不合格。要显现出足以使观察者可区分的颜色，常常要花长达指示剂寿命30%至100%的时间。
目前，随着用于延长新鲜熟食室温存放期限的改良充气包装以及更新、更安全的防腐剂的出现，消费者已经逐渐喜爱许多从前得不到的味道新鲜的高品质食品。不将食品制成冷冻形式或罐装形式，可以将新鲜熟食进行处理，装在改良充气包装中，在冷藏条件下存放足够长的时间，以使消费者可以得到这些较新鲜的食品。一个说明性的实例是午餐盘，包括各种午餐肉，例如火鸡、火腿和奶酪。使这类产品得以出现的改进已经将这些包装内的产品的室温存放稳定性从大约数小时到一天延长到几天至一周。这就使得食品销售网能够在更长的存放时间内向消费者提供食品供其立即消费。
在理论上，对于变质情况处于监测中的贮存制品，它的某种性质在某一温度下的变化速度与在较低温度下的变化速度之比随物质而异。这一比值经常按10°增量表示，用Q10表示摄氏度、a10表示华氏度下的数值。例如，在0°至-20℃范围内生肥肉和熟肥肉的腐败值Q10约为3，而生瘦肉和熟瘦肉的腐败值Q10在5至6之间。蔬菜的腐败值Q10一般在7至8之间，而水果和浆果则约为13。任何指示剂体系的组分配方都应该选择成使单位温度变化引起的信号显现速度的变化与对所监测制品要求的参量相适配。指示剂的Q10值一般应该与所测指定一类食品的某一性质的Q10值接近。为实现这种适配，通常需要根据美国专利3，942，467中所述的方法正确选择指示剂成分并适当控制这些成分的相对浓度，上述专利的方法在本文中专门引用作为参考。
因此，本发明的目的之一是提供一种改进的新型时间温度综合指示剂，用于适合室温或冷藏贮存的食品，此指示剂能对产品的安全性和质量作出即时的可见指示。
本发明的另一目的是提供一种用于食品的时间温度综合指示剂，一旦达到安全存放极限，该指示剂就立即迅速显现出明显的终点信号。
本发明的又一目的是提供一种改进的新型时间温度综合指示剂，它可以用于多种食品和多种包装形式中。
根据这些目的和其它目的，本发明提供了一种改进的新型时间温度综合指示剂，该指示剂含有由一种活性试剂和对该活性试剂有特异性的底物构成的第一特异反应对。第一特异反应对的组元，即，活性试剂及其特异底物，容易发生反应形成第一反应产物。这种第一反应产物会使指示剂的PH值向偏离中性的酸性或碱性第一方向改变或移动。
该指示剂还含有由一种活性试剂和对该活性试剂有特异性的底物构成的第二特异反应对。第二特异反应对的组元也容易发生反应形成第二反应产物。第二反应产物会使指示剂的PH向着与第一方向相反的第二方向改变或移动，最好是超出中性范围。
指示剂组合物另外还含有至少一种对PH敏感的染料，该染料在碱性PH范围内的PH下显示一种颜色，而在酸性PH范围内的PH下显示出不同的第二种颜色。
根据本发明，第一特异反应对中底物的数量在化学计量上超过第二特异反应对中底物的数量。第一反应产物和第二反应产物容易发生反应形成第三反应产物。第三反应产物包含一种稳定的PH缓冲剂，它将指示剂的PH值保持在处于中性的第二方向一边的某个稳定数值，直到第二反应产物不再生成。当第二特异反应对用的底物起始物质已消耗或用尽时，指示剂中的第二反应产物停止生成。在发生这种情况时，PH缓冲剂的缓冲容量很快就被第一反应产物超出，指示剂的PH由缓冲剂的PH值很快变到在中性的第二方向一边的不同PH值。在这一过程中，指示剂显示出从第一种颜色到第二种颜色、或从第二种颜色到第一种颜色的快速而明显的颜色变化。
选择指示剂组合物，使得它在相对恒定的预定温度或温度范围内经过一段预定的时间后发生剧烈的颜色变化。另外，由于第一和第二特异反应对的反应速度依赖于温度，指示剂组合物处在高于预定温度范围的高温时会使两个反应都以更快的速度进行。因此，第三反应产物将以更快的速度形成，第二反应对的底物也将在更短的时间内耗尽。结果是，与处在较低温度下的情形相比，在更短的时间内就超过了缓冲容量而发生颜色变化。
由两个速度依赖于温度但一般是独立的两个特异反应形成一种稳定的缓冲剂，所达到的剧烈而明显的颜色变化比先有技术的指示剂体系要快得多，先有技术的指示剂体系不是象本发明一样从中性底物出发，而是用高酸性或高碱性的起始溶液。在这些先有技术指示剂中，随着指示剂中各反应组分之间反应的进行，产生的反应产物逐渐有效地中和了起始溶液。由于曲线的中和部分造成的滞后时间，任何颜色变化的显现都很缓慢。
相反，本发明的指示剂由PH中性的底物溶液开始，生成一种在中性的指定一边具有适度PH值的稳定PH缓冲剂。第一和第二特异反应同时进行，直到第二特异反应对的底物被耗尽。此时不再形成新的缓冲剂，通常能立即观察到第一反应产物对PH的影响。
根据一种优选的用途，本发明的指示剂用于容易受生物影响而发生品质变化的产品，指示其时间-温度历程。一个典型的例子包括打算冷藏贮存的熟食品，该产品由于细菌或真菌的有害影响而随时间发生生物降解作用。食品品质的变质速度将随其存放时间以及存放期间内的温度历程而变。根据一个优选的实施方案，本发明的指示剂使用选自生物来源的第一和第二特异反应对组分，并且/或选择所用的方法，使指示剂的总Q10值与所监测产品的Q10值相近。
更具体地说，根据一个优选的实施方案，这种改进的新型时间温度综合指示剂含有第一特异反应对，其中包括作为活性试剂的酶或酶活性组分，以及对该酶有特异性的底物，以便反应形成作为第一反应产物的酸。还包含有第二特异反应对，其中包括作为活性试剂的不同的第二种酶或酶活性组分，以及对第二种酶有特异性的第二种不同的底物。第二反应对的组元发生反应形成碱性的第二反应产物。
根据这一优选实施方案的指示剂包括一种对PH敏感的组合染料包装，其中含有间硝基苯酚、对硝基苯酚和石蕊的组合物或混合物。这种PH染料的组合物能使指示剂在中性至碱性PH值(＞7.0)呈绿色，在酸性PH范围(＜7.0)显示截然不同的浅红色。指示剂中第一特异反应对的底物数量在化学计量上超过第二特异反应对的底物数量。根据这一优选实施方案的时间温度综合指示剂，在相对恒定的温度范围内经过一段预定的时间之后，或是在高温下经过较短的一段时间之后，显示出从绿到浅红的明显颜色变化。这里优选这种组合染料包装是因为它采用了或产生了目前通用的标志绿-红来表示前进-停止或使用-不使用这些状态。如果需要，也可以使用产生其它颜色和颜色变化的其它PH染料和染料组合物。
在优选实施方案中，第二种酶/底物特异反应对包含有脲酶/尿素特异反应对，第一种酶/底物特异反应对是脂酶/甘油三乙酸酯反应对。第一种酶/底物特异反应对中的脂酶最好是存在于或来源于对甘油三乙酸酯底物有脂酶活性的微生物源。一种优选的微生物是酵母。已经发现某些消化酶的微生物源可以根据本发明用在指示剂体系中，以便提供在最关心的温度范围内与所测变质情况相象的更准确的温度响应曲线。
微生物作用对产品品质的有害影响可以按本发明的这一优选实施方案来监测，其作法是监测有关人工体系随温度和时间而变的活性，该体系中含有与目前优选的指示剂中所含微生物类似的微生物。换言之，根据本发明掺加了微生物作为试剂的指示剂使用同类物质测量同类物质。另外，使用第一和第二两组酶/底物特异反应对，可以达到比只含一个酶/底物反应对的先有技术指示剂体系更快速、活性更强的温度灵敏性。这是因为，作为指示剂组分使用的酶和/或具有酶活性的微生物，与上述美国专利3，942，467中使用的无机试剂相比，具有更高的Q10值。此外，使用两种中性底物与酶试剂相组合形成的指示剂体系是均匀的溶液，这也有助于缩短指示剂的反应时间。如果食品在高温下的暴露时间超过了安全水平，则要求或希望指示剂在数小时内，最好是在数分钟甚至数秒钟内发生快速而明显的颜色变化，以便指示出腐败状态。
本发明的一个优选实施方案中，改进的新型指示剂依靠脲酶/尿素底物反应对来测量或计算出预定的时间温度综合值中的时间分量。尿素在脲酶存在下于水相介质中分解成铵离子和碳酸根离子的反应速度，在对新鲜的冷藏食品所预期的温度范围内，即约25°F至110°F，比对冷冻食品了解得更清楚。对于指定数量的脲酶，直到尿素底物向终产物氨和二氧化碳的转化完成或消耗光所经历的时间，取决于该温度范围内的反应速度和尿素底物的起始浓度。通过改变指示剂中尿素底物的起始浓度，可以调节耗尽尿素底物所需的时间，以便为这种组合的综合指示剂确立所要求的最大期限或终点。
这种组合指示剂的温度监测组分或热历程监测部分，是由指示剂的酵母或脂酶/甘油三乙酸酯底物竞争性第一特异反应对形成的。酵母/甘油三乙酸酯反应每消化-摩尔甘油三乙酸酯生成-摩尔甘油和三摩尔乙酸。
根据本发明，指示剂可以放在小袋内，小袋可以贴在销售前的贮存和输运期间打算保持在40°F的包装上。一旦指示剂的各组分相互混合，它的两个酶/底物转化反应都分别以第一速度进行，这由40°F的温度决定。如果冷藏过程出了故障，或是产品在炎热的夏天停放在装卸码头上未加以冷藏，该产品的温度在短时间内就会升高若干度。温度每升高10°F，酵母/脂酶甘油三乙酸酯反应速度的增加相当于脲酶/尿素反应速度增加的12倍。结果，当暴露于更高温下时第一和第二反应产物急剧增多。反应产物之间相互反应形成稳定的PH缓冲剂，直到尿素底物被消耗光。在这之后，指示剂溶液的PH很快下降到酸性范围。指示剂或是由于在恒定的40°F温度下经过一段指定的时间而达到其终点，或是在较高温度下经过相对较短的一段时间而达到其终点。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，现已意外地发现，在按照本发明的作法制得的指示剂中包含一种微生物源作为一个特异反应对中的至少一种酶活性试剂，则通过对微生物作休克处理能提高指示剂的温度灵敏性。这种经过休克处理的优选指示剂在不良温度下在较短时间内即发生可见的明显颜色变化。另外，优选的休克指示剂在非应激的冷藏温度下贮存时存放期限延长。
根据本发明的这一方面，在将指示剂装在产品包装上之前对含微生物的指示剂组合物进行休克处理，意外地改进了时间-温度综合指示剂。更具体地说，微生物的休克处理一般是这样一种过程，它改变或部分改变了微生物的细胞结构，但是亚细胞结构或蛋白质不发生改变或变性。处理过的微生物的孢子可以直接使用。这里称为休克处理的用来破坏或改变微生物细胞结构的示例性方法包括热处理、巴氏灭菌法、超声、辐射、用酸或碱化学处理或上述方法的组合。休克处理不应激烈到破坏微生物所提供的酶的生物特异活性，或破坏由微生物亚细胞结构提供的对消化作用或其它反应起决定作用的其它蛋白质结构。
热休克过的微生物在不良温度下的响应更快，为在指示剂的碱性一边使用较高含量的尿素创造了条件。这一令人惊奇的意外发现意味着现在可以提供用来监测存放期限更长的产品的时间-温度敏感性指示剂。虽然不打算讨论任何具体的理论，但与未经休克处理的微生物相比，热休克微生物的性能改进可能是由于微生物的细胞膜限制了溶液效应(例如扩散)，可能会减少底物分子和酶的接触。在休克处理的微生物指示剂中，微生物的细胞膜已被破坏，使酶得以释放到溶液中，底物分子来往于酶的扩散也更完全。
从经济观点看，这类用微生物试剂的指示剂也是很诱人的，因为只要很少量的微生物就能提供令人满意的酶含量。很大数量的微生物可以比较便宜地制得。由于能够对微生物进行休克处理从而得到被破坏的微生物，增加了使用这些材料的安全性而不使成本显著增加。另外，可以使用未处理的微生物得到所要的酶，然后进行休克处理。与分离和纯化酶的成本相比，这在经济上也是诱人的。
本发明的这种改进的新型指示剂可以放在欲监测的产品上或其附近。这种综合指示剂可以带有许多形式之中的任何一种包装。指示剂小袋或封套最好由被批准用于这类产品包装的透明薄膜卷做成。在指示剂小袋内可以放一片滤纸，并可将很少量的预先混合的指示剂滴加到滤纸上形成一个指示剂斑。将小袋封口，然后放在包装上，使得从产品包装外面可以看见上述斑点。制得的指示剂小袋在使用前可以在低温下贮存，最好是在0°以下贮存。使用时可以从低温贮器中取出冷冻的小袋，用压敏胶带或其它合适的固定方法将其固定在产品包装的外面。
或者是，指示剂体系可以做成二份组合物的形式，将其放在有两个隔间的小袋中，固定在产品包装上。独立的两份用易破裂的隔膜彼此分开，该隔膜可以裂开，以使指示剂的各组分在适当的起点混合，开始行使指示剂的功能。另外，可以将较小的一个装有指示剂的密封袋或包装薄膜材料的透明小袋放在产品包装内易观察的位置，或放在包装的外面，以便提供新鲜程度的可见指示。正如上面曾提到的，可以用任何合适的方法，包括用胶粘剂和/或单面和双面胶带，将指示剂小袋固定在产品包装上。当包装品是食品如包装肉时，最好将指示剂小袋放在包装的外表面上以监测在肉或其它食品表面处产品所经受的温度。采用这种方法，指示剂溶液通常与食品外表面处在同样的较高温度下，而外表面通常是产品最早开始腐败的部位。
本发明的其它目的和优点，在以下对本发明和实施例的详细说明中将变得显而易见。
根据一个优选的实施方案，本发明的改进的新型时间-温度综合指示剂含有第一特异反应对，其中包括一种活性试剂和一种对所述活性试剂有特异性的底物。在此优选实施方案中，第一特异反应对能发生反应形成第一反应产物，该产物引起或倾向于引起指示剂组合物的PH值向中性值的酸性一边的酸性第一方向变化。第一特异反应对是为了在指示剂中产生酸。
这里所说的“特异反应对”是指活性试剂及其底物的一种可观察到的生物特异倾向，这种倾向使它们能发生反应形成指定的反应产物，而不管通常会阻碍或不利于非生物特异相互作用的其它因素存在与否，这些因素包括PH(在一定限度内)、溶液效应、反应物的相对浓度、溶液中其它物质存在与否等。作为示例的特异对反应包括酶及其底物之间的反应、酶-辅因子相互作用、抗体抗原反应、免疫反应及其它类型的生物特异相互作用，这里仅举几例。
在优选的第一特异反应对中，活性试剂具有与第一底物反应生成酸性的第一反应产物的活性，该活性试剂最好是一种酶或一种对该底物有酶活性的微生物或实体。特别优选的第一特异反应对包括以单独的形式或以与添加的脂酶相组合的形式作为活性试剂的酵母和作为底物的甘油三乙酸酯。可以作为第一活性试剂使用的其它产酸微生物包括乳酸杆菌，它与葡萄糖反应产生乳酸。能消化各种糖或碳水化合物产生生物酸或有机酸(例如乳酸)的其它产乳酸有机体，包括乳酸杆菌、链球菌和足球菌，也可以与它们各自的碳水化合物底物一起使用而构成第一特异反应对。
作为第一特异反应对使用的活性试剂及其特异底物通常是市售商品，可以从许多途径得到。例如，一种合适的酵母以商品名称REDSTAR销售。乳酸杆菌可以从MicrolifeTechnologies公司(Sarasota，Florida)以LACTACEL的商品名称得到。甘油三乙酸酯和各种葡萄糖及碳水化合物溶液可以从许多商业机构得到。
指示剂中的第二特异反应对用来产生碱，它将指示剂的PH改变或倾向于改变到中性值的碱性一边，并且将PH保持在碱性范围，直到第二对底物被耗尽。
第二特异反应对也含有一种活性试剂和第二底物，活性试剂与底物作用生成碱性的第二反应产物。第二特异反应对中的活性试剂最好也是一种酶或是对选定用来生成碱的底物具有酶活性的生物或实体。在优选的实施方案中，第二特异反应对能发生反应形成包括氨在内的第二反应产物。因此，优选已知能产生氨的酶-底物对。特别优选的第二特异反应对的组元是脲酶和尿素，以及显示出明显的脲酶活性的微生物和尿素底物。其它已知能在蛋白质、氨基酸或含氮碱的消化、代谢或分解代谢中产氨的酶也可以成功地使用。脲酶有很多形式的市售商品。一种商品形式是Sigma化学公司的刀豆粉，其脲酶活性有文献记载。用于脲酶/尿素这种酶/底物对的尿素底物是可以由许多来源得到的标准化学试剂。
脲酶的用量及尿素底物的相对用量可以在合理的限度内变化。例如，脲酶的浓度应当足够高，以使指示剂最初显示的PH缓冲剂特有的绿色足够强。脲酶用量的上限可以用接近报酬递减点的方法确定，即，在该点时加入更多的脲酶不会使指示剂中尿素分解产物的形成速度有明显增加，但却不必要地增加了花费。
加到指示剂中的尿素的相对比例可以改变指示剂功能中的时间分量。例如，对于给定数量的脲酶，改变加到指示剂中的尿素的浓度将会改变非温度应激型指示剂样品达到终点信号所需的时间。例如，在最初的尿素起始浓度下，指示剂可能在80°F下两天后达到其变色时间终点信号，而在更高的起始浓度下，同样的指示剂体系要花3.5天才达到其时间终点信号颜色变化。
本发明的改进的新型时间温度综合指示剂体系包含至少一种对PH敏感的染料。在优选的实施方案中，指示剂包含一种其中含有间硝基苯酚、对硝基苯酚和石蕊的PH敏感型组合染料包装。间硝基苯酚和对硝基苯酚在PH7.0以上的碱性范围显黄色，在PH7.0或更小时急剧地变成无色。石蕊染料在高于PH7.0的碱性范围内显深蓝色，在低于PH7.0的酸性范围则显示截然不同的浅红色。因此，这种优选的组合染料使指示剂溶液显绿色，直到尿素底物与第三反应产物PH缓冲剂完全耗�。甘炯撂逑档腜H已移至酸性范围时，才快速而清晰地显示出浅红色。对PH敏感的染料包装应该在中性区PH＝7.0附近产生明显的颜色变化，而且最好是依靠不易弄错的信号，例如从绿变成红，发出到期警告。虽然上述包装是优选的，但是也可以使用其它组合，例如溴百里酚蓝和中性红组合。如果采用后一种组合，指示剂最初呈绿色，在酸性范围内则变成橙红色。
指示剂溶液最好是水溶液或是所有成分的混合物，可以含有可有可无的其它组分，例如磷酸二氢钠缓冲剂和/或供微生物用的碳水化合物能源(例如，最好可以提供葡萄糖)。指示剂还可以包含一种与水混溶的助溶剂，例如任何极性有机溶剂，包括低级链烷醇(如乙醇)、液态酮(如丙酮或甲乙酮)等。
根据本发明，刚好在食品一起包装之前将指示剂溶液的各组分预混合。这就开始了指示反应的化学过程，因此，在混合后立即由第二酶/底物对稳定地产生出氨，其反应速度由环境温度决定。组成本发明指示剂的各组分的总量由下述考虑决定，例如制造工艺成本、材料的相容性、用途等，这些因素本身又在很大程度上由方便程度或设计选择决定。因为一旦将各组分混合或相互接触，指示剂体系就开始反应，所以显然这些组分可以保持分离，直到希望指示剂被启动为止。因此，构成指示剂的各组分可以封装在与食品包装连接的易破裂的容器内，或是使用一种简单的单囊小袋或封装容器。在一种分成两部分的包装中，指示剂的包装方式可以是，使易破裂隔膜包装的一部分装入酶和负责至少提供第二酶组分的微生物。美国专利3，977，945中叙述了一种分两部分的包装实例。染料和底物可以放在隔膜包装的另一间中。使用时，挤压泡形包装使两部分之间的隔膜破裂，以便混合形成指示剂。产品的包装材料最好是透明的并且由化学上惰性的弹性材料制成，例如聚乙烯薄膜。另外，指示剂小袋的包装最好也由聚乙烯薄膜制成。小袋或封套可以带有粘性背衬或可以以其它方式固定在食品包装上。
另一种方法当然也可以将指示剂的各组分在制造过程中混合在一起装入单室容器中密封起来。在一个优选的实施方案中，将指示剂加到一片湿滤纸上，滤纸放入小袋或封套中，粘贴在食品容器的外表面。根据这种单室法，可以将一卷吸收基底带打开，使其通过一个处理工段。可在处理工段将混合的指示剂组合物涂敷在基底带上形成湿指示剂带。可以将湿带重新卷在卷轴上并冷冻之，直到可以将它切成小片插入小袋封套中。如果愿意，也可以将湿带切割并装入小袋或连续的一串小袋长条中，随后冷冻之。指示剂溶液的冷冻可能有助于防止发生反应，也可以大大减小反应速度，以便使指示剂在冷冻或冷藏时被有效地“固定”或“停住”，直到它们准备使用。
由以下工作实施例可以明显地看出本发明的其它目的和优点。
实施例1一种改进的新型时间-温度综合指示剂制备如下为制得过滤灭菌的2%冷脲酶试剂溶液，将2克具有脲酶活性的刀豆粉(Sigma化学公司)与100毫升去离子水混合，加入硅藻土助滤剂。将混合物经过0.2微米的Millipore滤膜冷过滤，得到约100毫升透明的、基本上无菌的脲酶水溶液。
指示剂的A部分是通过配制以下物质的溶液制得的2.0克0.4M NaH2PO46.0克甘油三乙酸酯1.0克葡萄糖0.4克尿素5.0克以上制得的2%冷过滤脲酶溶液0.1克干酵母用于指示剂组合物B部分的溶液制备如下在装有约50毫升去离子水的100毫升容量瓶中加入0.01克间硝基苯酚、0.01克对硝基苯酚和0.05克石蕊，将混合物搅动，直到每种对PH敏感的染料都完全溶解，形成透明溶液。
然后在容量瓶中的B部分染料溶液中加入10克A部分的溶液，溶液转变成适中的绿色。再加入10克试剂级乙醇，用去离子水将容容量瓶中的混合溶液稀释到体积为100毫升。
为了把指示剂溶液掺加到适用于食品包装的指示剂标签中，先从白滤纸上切下直径1/4英寸的圆片。将圆纸片放在封套或小袋中，封套和小袋由厚度为2密耳的低密度线性聚乙烯薄膜制成，其大小约为1/2英寸见方。小袋的三个边在一台DYNO包装机上热封。将滤纸插入这样做成的小袋的内腔。然后用自动移液器将30微升绿色的指示剂溶液加到滤纸圆片上，用DYNO包装机立即封上小袋的顶部开口。
将装有指示剂的小袋转移到一台保持80°F的控温箱中。在这些条件下，实施例1的指示剂组合物在2.0天内从绿色的圆片变成鲜艳的浅红色圆片。
实施例2用实施例1中的同样方法制备另一种指示剂溶液，但是加到A部分溶液中的尿素数量从0.04克增加到0.1克。
将这种指示剂放在指示剂小袋标签中，按照实施例1的方法在80°F进行试验。实施例2的指示剂在3.5天内从绿色变成浅红色。
实施例3-5以下实施例说明了将掺混到指示剂组合物中的微生物进行休克处理所获得的性能改进。
用含有0.05%石蕊、0.01%对硝基苯酚、0.01%间硝基苯酚和10%试剂乙醇的溶液，将含有0.0011%磷酸钠、6%甘油三乙酸酯、1%葡萄糖、0.4%尿素、0.1%刀豆粉和0.1%酵母的水溶液稀释1到10倍。直接使用干酵母或将它与水混合并在180°F、190°F、200°F的水浴中加热1小时。然后冷却至37°F。
将半英寸的圆纸片(SchleicherandSchnell公司)浸入溶液中，放进聚乙烯小袋里，在-65°F冷冻，真空密封并在80°F贮存。
所得结果列在如下的表1中。
表1热休克处理对指示剂性能的影响实施例处理方式在80°F达到终点的天数A未受热3.343180°F1小时 3.094190°F1小时 2.715200°F1小时 2.22实施例6-13用不同数量的尿素重复实施例3-5的同样溶液制备方法。
将用于试验样品的酵母与水混合，在蒸汽台上加热1/2小时(温度达到165°F)。将指示剂保持在80°F和40°F。
所得结果列在如下的表2中表2在热休克过的指示剂中改变尿素底物浓度的影响实施例6 B7 C8D9E尿素含量(重量％)0.1% 0.1%0.2%0.2% 0.3% 0.3% 0.4% 0.4%到达终点的时间(天)在80°F.0.4 1.04 1.211.831.772.342.63 3.34在40°F.- －－－－－－－
表2(续)实施例10F 11G 12 H 13I尿素含量 0.1% 0.1%0.2%0.2%0.3%0.3%0.4%0.4%(重量％)达到终点的时间(天)在80°F.- - - - --- -在40°F 16.5016.5144.0142.0354.9042.43 88.00 67.14试验样品的平均Q10值(每改变10℃的反应速度变化)约为13.5，而对照样品为9.0。
增加尿素含量延长了指示剂在40°或更低的冷藏温度下的存放期限。但是，在本体系中使用浓度有限的尿素，因为未经处理的微生物在80°F或更高的不良温度下对于产生指示剂的可见变化响应缓慢。“热休克”的微生物在不良温度下响应较快，从而有可能使用较高浓度的尿素。于是，研制出一种对温度敏感的指示剂，它在不良温度下于较短的时间内产生可见的变化，而在冷藏的温度下则在较长的时间内产生可见变化。
微生物的处理可能不限“热休克”。其它的实例可能包括巴氏灭菌、超声、辐射、化学处理、酸度、碱度或它们的任何组合。一般来说，任何能改变或部分改变微生物细胞(但不是孢子)的方法都被认为是适当的。可以采用直接使用纯孢子的方法。
实施例14另一种改进的新型时间-温度综合指示剂制备如下按下述方式制备一种无酸的生物酶活性试剂由MicrolifeTechnologies公司(Sarasota，Florida)得到以商品名称LACTACEL115销售的冷冻的足球菌浆体样品。LACTACEL115是作为制作香肠用的起子培养物出售的。将0.5克冷冻浆体样品解冻。解冻后的细菌溶液的PH约为5.0。将2.5盎司(约75毫升)解冻的LACTACEL置于烧瓶中，用去离子水冲稀至450毫升。稀释过的样品在一台International离心机上以2000转/分离心30分钟。小心地倒掉上层的水。用去离子水将浓细菌再稀释到450毫升，再离心。再次小心地将上清液倒掉。将剩下的细菌残余物重新悬浮在去离子水中至体积为75毫升。洗涤过的LACTACEL产品的PH为7.0。将这75毫升洗涤过的样品冷冻，保持-60°F备用。
根据本发明的另一种指示剂组合物是通过配制以下成分的100毫升溶液而制得的5.0毫升解冻并漂洗过的LACTACEL115;
4.62克APT培养液;
5.0克2%的刀豆粉溶液(制备方法同实施例1);
5.0克葡萄糖(可以用乳糖代替);
0.09克尿素;
0.04克间硝基苯酚;
0.004克中性红;
0.01克溴百里酚蓝。
将以上各成分搅动短时间直到形成透明的绿色溶液。
按照实施例1的方法制备指示剂标签，包括直径1/4英寸的圆滤纸片和1/2英寸见方的聚乙烯薄膜小袋。将30微升实施例14的指示剂溶液加到每个小袋中，在Dyno包装机上密封。
将一部分小袋转移到保持80°F的控温箱中，另一组小袋则放在40°F的冰箱中。在这些条件下，实施例14的指示剂在80°F连续存放2.0天后，从绿色变成浅红橙色的标签。在40°F保存的小袋在至少95天后保持不变。
实施例15根据此实施例，取1000磅新鲜的火鸡胸脯肉用含90%水的盐水溶液注射。每块火鸡胸脯肉的重量为2.5磅至约3.75磅。将它们放在炉内的架子上在高湿度和160°F的干球温度下烧烤2小时，然后在170°F的干球温度下烤至火鸡胸脯肉的内部温度约为160°F。烧烤后，将火鸡胸脯肉从炉中取出进行四分切割，然后涂上防腐液。接着将其冷却到约32°F，真空包装在乙烯乙酸乙烯酯与偏氯纶层压材料的防潮隔氧薄膜中。
按照实施例14的方法制备一种指示剂标签小袋，用压敏胶贴在真空包装胸脯肉的外表面上。先前的试验表明，当这些真空包装火鸡胸脯肉小心地在40°F或更低温度下冷藏贮存时，它们的平均存放期限约为65天。如果样品谨慎地保持在受控的40°F条件下，则指示剂不会变色。但是，如果从40°F的冷藏储器中取出样品并且暴露在80°F的不良条件下，则指示剂一天就要变色。
实施例16根据此实施例，用含90%水的盐水注射若干新鲜的火鸡胸脯肉。每块火鸡胸脯肉约重9，0磅。将火鸡胸脯肉真空包装在市售的乙烯乙酸乙烯酯/偏氯纶层压薄膜中。然后将真空包装的火鸡胸脯肉在高湿度烤箱中烘烤，直到胸脯肉的内部温度达到160°F。然后从烤箱中取出火鸡胸脯肉，令其冷至室温。然后将冷却的包装放在40°F的冷藏器内。根据本发明和实施例15的方法，用胶粘剂将装有实施例13制备的指示剂溶液的指示剂标签小袋贴在外包装上。指示剂标签能有效地监测产品的时间和温度历程，依赖于产品试样的贮存条件，在数天之内发生明显的颜色变化。
实施例17可以以下述的自动化方式大量制备本发明的时间温度指示剂。
装备一台指示剂小袋组装设备，其中包括一个纵向延伸的进料轴，沿此轴安置一个滤纸卷供料器、一对分成上下两部分的包装薄膜卷供料器、低温指示剂溶液槽、滤纸冲切台、密封熔结台(用来将包围着湿指示剂小片的相对两卷薄膜熔结以形成断续分开的指示剂小袋)、打孔台(在长条带上打上相邻标签小袋之间的撕裂线)、以及一个胶带粘贴台(向构成小袋的其中一个薄膜卷的外表面上涂一细条胶粘剂和不干胶薄片。在该设备的下游设一台卷带盘。卷起的带撕裂线的小袋条带可以放在冷冻箱内备用。以后准备使用时可以从冷冻箱中取出卷起的条带。沿孔线撕开，可以从卷起的条带上剩下的小袋中取下单个的指示剂小袋。然后可从胶粘带上撕下防粘片，将胶粘带和小袋对着产品包装压按，使指示剂标签贴在产品包装外面。或者是，各个指示剂标签不用胶粘带和防粘片组合件，而是简单地将它以清楚可见的方式放在产品包装的外面，或者，如果产品有双重包装，放在两个包装层之间。
虽然已参照一些优选实施方案对本发明作了说明，但是本领域技术人员可以作出修改和变化，而不偏离由所附权利要求书限定的本发明的范围和要旨。
权利要求
1.一种时间温度综合指示剂，该指示剂含有第一特异反应对，包括一种活性试剂和对所述活性试剂有特异性的底物，所述第一特异反应对能发生反应形成第一反应产物，第一反应产物会使指示剂的PH值向偏离中性的酸性或碱性第一方向变化；第二特异反应对，包括一种活性试剂和对所述活性试剂有特异性的底物，所述第二特异反应对发生反应形成第二反应产物，所述第二反应，产物会使指示剂的PH值向与所述第一方向相反的第二方向变化并超出中性；所述第一反应产物和所述第二反应产物本身又发生反应形成第三反应产物，所述第三反应产物包括一种稳定的PH缓冲剂，它将指示剂的PH维持在中性值的第二方向一边的某个稳定值，直到所述第二反应产物不再生成，所述第一特异反应对中所述底物的数量在化学计量上超过所述第二特异反应对中底物的数量；至少一种对PH敏感的染料，它在碱性PH范围内的PH下显示一种颜色，在酸性PH范围内的PH下显示第二种不同的颜色，从而使所述时间温度综合指示剂在相对恒定的温度下经过一段预定的时间后，或是在较高温度下经过相对较短的一段时间后，显示出快速而明显的颜色变化，从所述第一种颜色和第二种颜色中的一种颜色变成另一种颜色。
2.权利要求1限定的时间温度综合指示剂，其中所述第一反应产物是酸性的。
3.权利要求2限定的时间温度综合指示剂，其中所述第二反应产物是碱性的。
4.权利要求3限定的时间温度综合指示剂，其中所述第三反应产物含有一种稳定的碱性PH缓冲剂。
5.权利要求1限定的时间温度综合指示剂，其中所述的至少一种PH敏感性染料显示的第一种颜色为绿色，第二种颜色为红色。
6.权利要求1限定的时间温度综合指示剂，其中所述第一特异反应对和所述第二特异反应对都包含有一种作为活性试剂的酶活性试剂，以及一种酶底物作为对所述活性试剂有特异性的所述底物。
7.权利要求6限定的时间温度综合指示剂，其中所述第一特异反应对中的酶由一种微生物源提供。
8.权利要求6限定的指示剂，其中第二特异反应对是脲酶/尿素。
9.权利要求6限定的指示剂，其中所述第一特异反应对由酵母/甘油三乙酸酯构成。
10.权利要求9限定的指示剂，其中在所述第一酶/底物特异反应对中，第一种酶还包括脂酶。
11.权利要求7限定的指示剂，其中所述微生物是酵母。
12.权利要求7限定的指示剂，其中所述微生物是休克处理过的微生物。
13.权利要求6限定的时间温度综合指示剂，其中所述第一特异反应对包括一种具有产乳酸酶活性的微生物作为活性试剂和至少一种碳水化合物作为底物。
14.权利要求1限定的时间温度综合指示剂，其中所述的至少一种PH敏感性染料含有间硝基苯酚、对硝基苯酚和石蕊的混合物。
15.权利要求1限定的时间温度综合指示剂，其中所述的至少一种PH敏感性染料含有间硝基苯酚、溴百里酚蓝和中性红的混合物。
16.一种制备指示敏感产物和组合物贮存的时间-温度历程的指示剂的方法，该方法包括，将用来产生酸的第一特异反应对、用来产生碱的第二特异反应对和至少一种PH敏感性染料混合形成水溶液，所述第一特异反应对含有第一底物，其数量在化学计量上超过所述第二特异反应对中特异底物的数量。
17.权利要求16限定的方法，其中用来产生酸的第一特异反应对包含一种由微生物源提供的酶组分。
18.权利要求17限定的方法，其中所述微生物在加到指示剂溶液中之前先经过休克处理。
19.一种用于食品的室温贮存及冷藏贮存的改进包装，该包装包括一个含有权利要求1限定的指示剂的标签。
20.一种用于固定在包装食品附近监测该包装食品的时间和温度历程的指示剂小袋，所述小袋包括一个热塑性小袋封套，该封套具有容纳指示剂溶液的空腔，空腔中装有肉眼可见数量的权利要求1限定的综合指示剂组合物。
21.权利要求13限定的指示剂小袋，该小袋还包括装在所述含指示剂溶液的小袋空腔内的一个基底片材。
全文摘要
一种改进的新型综合指示剂体系，可用来指示监测产品温度和时间历程的一个或更多个预定时间温度综合值的到达，该体系采用二元的特异反应对体系，它们由两种中性底物同时产生酸和碱。一种底物的含量超过另一种。这种优选的动态指示剂体系生成碱性范围的恒定pH缓冲剂，直到一种底物被消耗光。此时指示剂溶液的pH快速改变到酸性范围，造成pH敏感性染料的十分清晰可见的颜色变化。
文档编号G01N31/22GK1068423SQ9210066
公开日1993年1月27日 申请日期1992年1月30日 优先权日1991年1月31日
发明者T·J·贾林斯基 申请人:奥斯卡迈耶食品公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
