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专利名称：用于生物材料的澄清试剂和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于使生物材料透明的澄清试剂(clearing reagent)和其用途。
背景技术：
对于不透明组织的利用光学显微镜的内部观察来说，进行使用澄清试剂的预处理(用于使对象透明的澄清处理)。作为澄清试剂和预处理方法的典型的例子，已经知道(i)在专利文献I和非专利文献I中由Ann-Shyn Chiang描述的Focus Clear(产品名称)溶液以及(ii)在非专利文献2中由Hans-Ulrich Dodt等人描述的组织澄清方法。这些都被用于使组织透明以用于对组织中存在的荧光物质的观察。引用列表[专利文献]美国专利第6472216号(专利授权日2002年10月29日)[非专利文献]非专利文献IAnn-Shyn Chiang 等人Insect NMDA receptors mediate juvenile hormonebiosynthesis. PNAS 99(I)，37-42 (2002)。非专利文献2Hans-Ulrich Dodt 等人Ultramicroscopy !three-dimensional visualizationof neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods 4(4),331-336(2007)。
发明概述技术问题Focus Clear溶液含有ニ甲亚砜(DMSO)和/或类似物作为用于使对象透明的活性组分，难以在活组织上使用。因此，可以对其应用Focus Clear溶液的对象主要地限于固定的样品。此外，Focus Clear溶液具有非常复杂的组成，由此其制备是复杂的，并且其成本是非常高的。此外，虽然提出，Focus Clear溶液将允许使用荧光蛋白的观察，但是FocusClear溶液使神经组织收缩并且不足以使在深的区域的神经组织的混浊澄清。同吋，Dodt等人的组织澄清方法实质上要求在用于使对象透明的步骤中使用大量的有机溶剤。因此，该方法也难以在活组织上使用，并且可以对其应用该方法的对象主要地限于固定的样品。此外，如上文描述的，因为组织澄清方法实质上要求使用大量的有机溶剂，所以该方法破环几乎所有的荧光蛋白。因而，使用该方法，难以进行使用荧光蛋白的组织观察。此外，上文描述的组织澄清方法涉及经历澄清处理的组织的脱水，这是由于它们的组成的本质。然而，该过程导致组织的不可逆收缩。
作出本发明以解决以上的问题，并且本发明的ー个目的是提供新颖的用于使生物材料透明的澄清剂，所述澄清剂含有作为活性组分的具有较高的生物亲和性的组分；以及其用途。问题的解决方案为了解决以上的问题，本发明的发明人进行了努力的研究，得到了新的发现，即在具有优良的生物亲和性的组分中，尿素具有使生物材料透明的能力。基于这一点，本发明的发明人得出本发明。具体地，根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂包含作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少ー种化合物，所述澄清试剂是溶液。本发明还提供用于进行使生物材料透明的澄清处理的体系，该体系包含上文的 澄清试剂中的任何澄清试剂；以及已经被分离的生物材料，澄清试剂已经渗透入生物材料中以使生物材料透明。根据本发明的用于使生物材料透明的方法包括以下步骤使上文的澄清试剂中的任何澄清试剂渗透入已经被分离的生物材料中，目的是使生物材料被制成透明的。根据本发明的用于复原已经通过澄清处理被制成透明的的生物材料的方法包括以下步骤使平衡盐溶液滲透入已经根据上文的方法被制成透明的的生物材料中，目的是使生物材料恢复至生物材料在澄清处理之前具有的状态。本发明还提供用于进行使生物材料透明的澄清处理的试剂盒，该试剂盒包括上文的澄清试剂中的任何澄清试剂。本发明的有益效果本发明提供新颖的用于使生物材料透明的澄清试剂，该澄清试剂含有作为活性组分的具有较高的生物亲和性的组分；以及其用途。附图简述图I图I关于本发明的实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠海马体的视图。图2图2关于本发明的另ー个实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠海马体的视图。图3图3关于本发明的又另ー个实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的整个小鼠大脑的视图。图4图4关于本发明的还又另一个实施例，是图示了(i)根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂和(ii)用澄清试剂处理的生物材料的溶胀之间的关系的图。图5图5关于本发明的又一个实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的整个小鼠大脑的视图。图6
图6关于本发明的还又ー个实施例，是示出了已经用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠脑切片的透光度测量的结果的图。图7图7关于本发明的另外的实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠胎儿的视图。图8图8关于本发明的又另外的实施例，是示出了对用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠海马体中的神经祖细胞的观察的结果的视图。 图9图9是用于在用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂或用常规的技术(BABB法)处理的小鼠大脑样品之间的比较的视图。

图10图10是用于在具有在其中表达的各种荧光蛋白的希拉细胞的结果之间的比较的视图，希拉细胞已经用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂或用常规的技术(BABB法)处理。图11图11关于本发明的还又另外的实施例，是示出了对具有被移植于其的神经祖细胞的大脑皮层的观察的结果的视图，大脑皮层用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理。图12图12关于本发明的又另外的实施例，是示出了在⑴在使用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂的澄清处理之前的生物材料和(ii)在澄清处理之后恢复至它们在澄清处理之前具有的状态的生物材料上的免疫染色的结果的视图。实施方案的描述下文将详细地描述本发明的实施方案。(用于使生物材料透明的澄清试剂的活性组分)根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”是含有作为用于使生物材料透明的主要活性组分的“尿素”的溶液。根据本发明的另ー个方面的“用于使生物材料透明的澄清试剂”是含有作为用于使生物材料透明的主要活性组分的“尿素衍生物”的溶液。尿素衍生物不限于任何具体的类型。具体地，例如，尿素衍生物是各种类型的烷基脲或由以下的式(I)表示的化合物中的任何化合物。注意，由式(I)表示的化合物包括烷基脲的一部分。根据本发明的用于使生物材料透明的澄清剂仅需要含有作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少ー种化合物。在这些中，澄清剂更优选地含有尿素。
权利要求
1.一种用于使生物材料透明的澄清试剂，包含 作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少ー种化合物， 所述澄清试剂是溶液。
2.如权利要求I所述的澄清试剂，其中 尿素作为所述活性组分被包含。
3.如权利要求I或2所述的澄清试剂，其中所述澄清试剂是水溶液。
4.如权利要求I至3中任一项所述的澄清试剂，还包含表面活性剤。
5.如权利要求4所述的澄清试剂，其中 所述表面活性剂是非离子型表面活性剤。
6.如权利要求5所述的澄清试剂，其中 所述非离子型表面活性剂是选自由Triton X(注册商标)、Tween (注册商标)和NP-40 (产品名称)组成的组的至少ー种。
7.如权利要求3至6中任一项所述的澄清试剂，还包含水溶性的大分子化合物。
8.如权利要求7所述的澄清试剂，其中 所述水溶性的大分子化合物是选自由Percoll (注册商标)、Ficoll (注册商标)、聚乙ニ醇和聚こ烯吡咯烷酮组成的组的至少ー种。
9.如权利要求8所述的澄清试剂，其中 所述尿素以IM或更大并且不大于8. 5M的浓度被包含，所述表面活性剂以O. 025 (w/v) %或更大并且不大于5(w/v) %的浓度被包含，并且所述水溶性的大分子化合物以2.5(w/v) %或更大并且不大于40 (w/v) %的浓度被包含。
10.如权利要求I至9中任一项所述的澄清试剂，还包含 选自由甘油、羧基こ烯聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙ニ醇和聚こニ醇组成的组的至少ー种。
11.如权利要求I至10中任一项所述的澄清试剂，其中 所述澄清试剂使(i)来源于多细胞动物的组织或器官或(ii)不是人类的多细胞动物透明。
12.ー种用于进行使生物材料透明的澄清处理的体系，包含 如权利要求I至10中任一项所述的澄清试剂；以及 已经被分离的生物材料， 所述澄清试剂已经渗透入所述生物材料中以使所述生物材料透明。
13.一种用于使生物材料透明的方法，包括以下步骤 使如权利要求I至10中任一项所述的澄清试剂渗透入已经被分离的生物材料中，目的是使所述生物材料被制成透明的。
14.一种用于复原已经通过澄清处理被制成透明的的生物材料的方法，包括以下步骤 使平衡盐溶液滲透入已经根据如权利要求13所述的方法被制成透明的的生物材料中，目的是使所述生物材料恢复至所述生物材料在所述澄清处理之前具有的状态。
15.ー种用于进行使生物材料透明的澄清处理的试剂盒，包括 如权利要求I至10中任一项所述的澄清试剂。
全文摘要
根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂是含有作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少一种化合物，以提供新颖的用于使生物材料透明的澄清试剂的溶液。
文档编号G01N33/48GK102859344SQ20118001335
公开日2013年1月2日 申请日期2011年3月11日 优先权日2010年3月12日
发明者宫胁敦史, 滨裕, 黑川裕, 河野弘幸, 阪上朝子 申请人:独立行政法人理化学研究所