专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及能容易地对试样中的基质进行迅速而高精度定量的生物传感器。
背景技术：
作为对蔗糖和葡萄糖等糖类的定量分析方法，近年来开发了利用酶具有的特殊催化作用的各种类型生物传感器。这里作为对试样液中基质定量方法的一个例子，对于葡萄糖的定量方法进行说明。作为电化学的葡萄糖定量方法，众所周知的是使用葡糖氧化酶(EC1.1.3.4，以下简称为GOD)和氧电极或过氧化氢电极进行定量的方法。
GOD，是以氧作为电子传递体，有选择性地对基质β-D-葡萄糖进行氧化，形成D-葡萄糖酸δ-内酯。在氧存在的条件下，在由GOD引起的氧化反应过程中，氧被还原成过氧化氢。通过氧电极测定氧的减少量，或者通过过氧化氢电极测定过氧化氢的增加量。氧的减少量和过氧化氢的增加量与试样液中的葡萄糖含量成比例，所以通过氧的减少量或过氧化氢的增加量就可以对葡萄糖进行定量。
在上述方法中，正如从反应过程可以推断的那样，存在有测定结果受试样液中所含氧浓度影响大的缺点，此外，当试样液中不存在氧时，就不可能进行测定。于是，开发了不使用氧作为电子传递体，而以铁氰化钾、二茂铁衍生物和苯醌衍生物等有机化合物和金属络合物作为电子传递体使用的新型葡萄糖传感器。
在这种类型的传感器中，通过使酶反应结果生成的电子传递体的还原体在电极上氧化，从其氧化电流的量，求出试样液中所含的葡萄糖浓度。使用这样的有机化合物和金属络合物替代氧作为电子传递体，有可能在稳定的状态下准确地使电极担载已知量的GOD及其电子传递体，形成试剂层。这时，也可以在接近干燥的状态下使试剂层与电极体系形成一个整体。
例如，如专利文献1中所述，近年来以这种技术为基础的一次性使用的葡萄糖传感器受到很大关注。在一次性使用的葡萄糖传感器中，传感器可以安装在测试仪器上，并可以从测试仪器上拆卸下来，仅通过向传感器中导入试样液，就可以很容易地用测试仪器测定葡萄糖的浓度。用这种方法，不仅可以对葡萄糖进行定量，而且还可以用于对试样液中所含的其它基质进行定量。
使用上述传感器进行测定时，可以在工作电极(作用極)上对还原型电子传递体进行氧化，根据该过程中流过的氧化电流的值求出基质浓度。但是，以血液和果汁等作为试样使用时，在工作电极上，试样中所含的抗坏血酸和尿酸等易氧化性干扰物质和还原型电子传递体同时被氧化。并且，这种易氧化性干扰物质的氧化反应有时会对测定结果产生正误差。同时，有时由于氧化型电子传递体和易氧化性干扰物质接触，会生成和酶反应毫无关系的还原型电子传递体，从而对测定结果产生正误差。
用生物传感器进行测定的测试试样中，多数情况下含有对测定特定成分有影响的干扰物质。为了降低由该干扰物质产生的影响，例如在专利文献2中提出了在生物传感器的上游，通过酶使干扰物质氧化的技术。另外专利文献3中提出了在传感器的上游，通过电极使干扰物质氧化的技术。但是即使通过这些技术，也不能完全消除对测定结果的误差。
美国专利第5120420号的说明书[专利文献2]日本专利第3102613号的说明书[专利文献3]美国专利第6340428号的说明书发明内容于是，本发明的研究目的在于提供不受试样中所含易氧化性干扰物质的影响，并能够迅速、高精度而且容易地对试样中的基质进行定量的生物传感器。
为了解决上述问题，本发明在具备有电绝缘基板、测定体系、至少含有氧化还原酶和电子传递体的试剂层的生物传感器上，设置干扰物质处理部件，该处理部件含有对测试试样中所含干扰物质具有作为氧化剂作用的氧化还原物质和对前述氧化还原物质进行固定的载体。
在前述生物传感器中，优选设置由前述基板，隔片部件和遮盖部件构成的试样供给通路。
而且前述干扰物质处理部件，在把测试试样供给到生物传感器的过程中，只要将其设置在能与该测试试样接触的部位即可。具体讲，也就是可以把前述试剂层和前述干扰物质处理部件都设置在前述试样供给通路内。并且在这种情况下，优选将前述干扰物质处理部件设置在距离前述试剂层的上游侧位置。
优选前述测试试样为生物试样，前述干扰物质为易氧化性物质。
优选前述氧化还原物质为铁氰化物。
还优选前述载体含有离子交换性高分子。
还优选前述测定体系含有在前述基板上形成的工作电极和对电极。
如上所述，如果按照本发明的生物传感器，则可以在不受干扰物质影响的情况下，很容易对测试试样中的基质进行迅速而高精度的定量。
附图的简单说明[
图1]是本发明一个实施例中使用的葡萄糖传感器的分解斜视图。
是图1所示葡萄糖传感器的X-X线断面图。
符号的说明1基板2、3 引线4工作电极5绝缘层6对电极7隔片8遮盖层实施本发明的最佳方案为了解决上述问题，本发明的特征是在具备有电绝缘基板、至少含有氧化还原酶和电子传递体的试剂层的生物传感器上，设置干扰物质处理部件，该处理部件含有对测试试样中所含干扰物质具有作为氧化剂作用的氧化还原物质和对前述氧化还原物质进行固定的载体。
这里本发明中所说的干扰物质是指在测试试样中，与测试对象化合物共同存在的、并对测定对象化合物的传感器响应信号产生影响的物质。例如使用血液作为测试试样，通过对电子传递体进行氧化来对测定对象化合物进行定量时，血液中所含的抗坏血酸、尿酸、乙酰胺基苯酮等成为主要干扰物质。这些物质是易氧化性化合物。
在本发明涉及的生物传感器中，通过含有对于这类干扰物质起氧化剂作用的氧化还原物质和对此氧化还原物质进行固定的载体的干扰物质处理部件，可以对含有抗坏血酸和尿酸等易氧化性干扰物质的生物试样和果汁等试样液进行处理，并抑制干扰物质对传感器响应的影响。
如上所述，通过传感器电极体系上担载的氧化型电子传递体与易氧化性干扰物质接触，有时还会生成与酶反应没有关系的还原型电子传递体。本发明就是利用这一特性来抑制干扰物质的影响。例如，如果有含抗坏血酸的溶液接触，则在铁氰化离子和抗坏血酸之间发生氧化还原反应，铁氰化离子被还原成亚铁氰化离子，抗坏血酸被氧化成不可逆的生成物。并且，如果该亚铁氰化离子扩散到传感器电极体系上，则会对传感器的响应值造成正误差。
与此相比，本发明的生物传感器，干扰物质处理部件中，在对干扰物质具有氧化剂作用的氧化还原物质中所含的亚铁氰化离子等被静电固定(固定方法的一种，参照Oyamaetal.Anal.Chem.，58(4)，979-981(1986)。)在构成载体的阳离子性高分子膜上因此可以抑制上述易氧化性物质的影响。同时，关于抗坏血酸，一旦受到氧化就被稳定，所以其还原能大幅度降低，可以大幅度减轻对一系列传感器电极反应的影响。
此外，根据试样液中所含的基质，可以适当选择试剂层中所含的氧化还原酶。作为氧化还原酶，可以使用果糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、乳酸氧化酶、胆甾醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶等。
作为电子传递体，可以列举铁氰化钾、p-苯醌、吩嗪甲硫酸盐、亚甲蓝、二茂铁衍生物等。同时以氧作为电子传递体时，也可以得到电流响应。电子传递体可以使用这些物质中的一种或两种或两种以上。在本说明书中，把能与氧进行电子交换的物质称为电子传递体。
特别是在测定体系中使用光学方式时，可以使用色素体(色素体)作为电子传递体。而且上面叙述的铁氰化钾和吩嗪甲硫酸盐也可以作为色素使用。
这里，最具有本发明特征的干扰物质处理部件含有对干扰物质起氧化剂作用的氧化还原物质和对前述氧化还原物质进行固定的载体。当干扰物质是抗坏血酸时，与抗坏血酸相比，作为对干扰物质起氧化剂作用的氧化还原物质，优选其具有正侧的标准氧化还原电位(抗坏血酸的标准氧化还原电位为0.058V)的物质。
此外，还优选对于干扰物质起氧化剂作用的氧化还原物质与电子传递体属于同一种类的化合物。这时，可以使传感器具有结构简单，使用方便的特点。
作为对前述氧化还原物质进行固定的载体，优选使用离子交换性高分子。通过静电相互作用，前述氧化还原物质被固定在离子交换性高分子上。因此，当使用阴离子氧化还原性物质时，优选使用阳离子性离子交换性高分子。例如作为对铁氰化物离子进行固定的载体，可以使用聚乙烯基吡啶。另一方面，当使用阳离子氧化还原性物质时，优选使用阴离子性离子交换性高分子。其具体例子可以列举铁噻吩甲基三甲基铵(Pc-CH2-NMe3)向全氟碳磺酸(美国杜邦公司制造的那菲昂(ナフイオン))的固定。
对前述氧化还原物质进行固定的载体，也可以是能够对前述氧化还原物质进行共价键或配位键固定的载体。例如，聚赖氨酸具有氨基残基，所以如果使用戊二醛作为交联剂，则可以使具有氨基的氧化还原物质形成共价键而固定。聚乙烯基咪唑的咪唑基可以起到配位基的作用，所以可以对例如锇络合物(Os(bpy)2Cl)等的金属络合物进行固定。
也可以通过把试剂层固定在工作电极上，而使酶或电子传递体不溶解。进行固定时，优选使用交联固定法或吸附法。还可以使其混合在电极材料中。
作为构成工作电极的材料，可以是在对电子传递体进行氧化的过程中，其自身不被氧化的导电性物质。同时作为电极体系的制作方法，优选采用丝网印刷法、溅射法、蒸镀法等方法。
以下通过实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例《实施例1》作为生物传感器的一例，制作具有图1和图2所示结构葡萄糖传感器。图1是除去试剂层等的葡萄糖传感器的分解斜视图。图2是图1的X-X线的断面图。
在由聚对苯二甲酸乙二醇酯制成的电绝缘基板1上，通过丝网印刷印上银糊，形成引线2和3。接着在基板1上，印刷含有树脂粘合剂的导电性碳糊，形成工作电极4。使工作电极4与引线2接触。
接着，在基板1上，印刷绝缘糊形成绝缘层5。用绝缘层5覆盖工作电极4的外周部分，通过这种方法，保证工作电极4露出部分的面积一定。而且用绝缘层5覆盖引线2和3的一部分。再在基板1上印刷含有树脂粘合剂的导电性碳糊，并使碳糊与引线3接触，形成对电极6。
接着在具有工作电极4和对电极6的电极体系上，滴下羧甲基纤维素(CMC)水溶液，使其干燥后形成CMC层。再于CMC层上滴下含有作为酶的GOD、含铁氰化钾作为电子传递体的水溶液，使其干燥形成试剂层9。
接着，为了更顺利地把试样液供给到前述试剂层，使卵磷脂的甲苯溶液从试样液的供给口扩散到试剂层上、并使其干燥，在前述试剂层上形成卵磷脂层(图中没有示出)。为了形成卵磷脂层使用了甲苯，也可以使用其它有机溶剂。
然后，于通过在遮盖部件8上贴附隔片部件7而划分出的部分表面设置干扰物质处理部件。在前述划分部分的表面滴下适量的聚乙烯基吡啶(阳离子性高分子)溶液(水/甲醇/2-丙醇三元溶剂体系)，风干，形成作为载体的高分子层。把该高分子层在含有0.2mM铁氰化钾的水溶液中浸渍1小时左右，在使其进行离子交换反应的同时，将铁氰化物离子浓缩固定在前述高分子层内。用这种方法形成干扰物质处理部件10。
与溶液浓度相比，通过循环伏安谱计算出的高分子层内的铁氰化物离子浓度是其2000-3000倍。把用上述方法制作的含有干扰物质处理部件的隔片/遮盖部件按照图1中点划线所示的位置关系接合，制成本发明的葡萄糖传感器。
把该葡萄糖传感器安装在测试仪器上，供给葡萄糖水溶液(360mg/dl)。经过规定时间后，对工作电极4-对电极6之间施加500mV的电压，测定5秒钟后的电流值。液体中的铁氰化物离子、葡萄糖、GOD发生反应，其结果葡萄糖被氧化成葡萄糖酸内酯，铁氰化物离子被还原成亚铁氰化物离子，通过对该亚铁氰化物离子进行氧化可以得到电流响应。这种电流响应与试样液中的葡萄糖浓度有依赖关系。
接着，供给含有10mg/dl抗坏血酸的葡萄糖水溶液(360mg/dl)，进行同样的测定。与除了不含干扰物质处理部件以外其它条件完全相同的葡萄糖传感器，在响应方面进行比较，结果表明在具有干扰物质处理部件的传感器中，可以大幅度抑制伴随添加抗坏血酸而引起的响应增大。
在上述实施例中，采用了相同的物质作为对于干扰物质起氧化剂作用的氧化还原物质和电子传递体，但是并不局限于此，也可以采用各自不同的物质。
此外在本实施例中，为得到电流响应，把对电极体系施加的电压定为500mV，但并不局限于此，也可以是能观察到电信号变化的电压，还可以是使电子传递体产生氧化的电压。
在本实施例中，示出了电极体系、引线/端子的一个例子，但是其形状、设置等情况不受本实施例的限制。
《实施例2》本实施例中，使用玻璃制的基板1和遮盖部件8。按照与实施例1相同的方法制作生物传感器。但是没有进行通过印刷绝缘糊而形成电极和引线。
在基板1上滴下羧甲基纤维素(CMC)水溶液，使其干燥形成CMC层，再于CMC层上，作为酶，滴下含有作为酶的GOD和含有作为电子传递体的1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓(1-メトキシ-5-メチルフエナジウム)的水溶液，使其干燥形成试剂层。
接着，为了更顺利地把试样液供给到前述试剂层上，使卵磷脂的甲苯溶液从试样液的供给口扩散到试剂层、并使其干燥，在前述试剂层上形成卵磷脂层。
然后，于通过在遮盖部件8上贴附隔片部件7而划分出的部分表面设置干扰物质处理部件。在前述划分部分的表面滴下适量的那菲昂(阴离子性高分子)溶液，风干，形成作为载体的高分子层。对该高分子层进行0.2mM1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓离子的浓缩固定。
把用上述方法制作的含有干扰物质处理部件的隔片/遮盖部件按照图1中点划线所示位置关系接合，制成本发明的葡萄糖传感器。
向该葡萄糖传感器中供给葡萄糖水溶液(360mg/dl)。经过规定时间后，用620nm的光对基板1和遮盖部件8的面进行垂直照射，使用吸光光度计测定它的吸光度。经过规定时间后，再次测定吸光度。可以确认由于1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓、葡萄糖和GOD发生反应，葡萄糖被氧化，1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓被还原，所以随着时间的经过，吸光度降低。该吸光度的降低程度与测试试样中的葡萄糖浓度有依赖关系。
接着，供给含有10mg/l抗坏血酸的葡萄糖水溶液(360mg/dl)，进行同样的测定。可以确认吸光度的降低程度与使用不含抗坏血酸的葡萄糖水溶液时相同。
为了进一步进行比较，除了不设置干扰物质处理部件以外，其它按照与上述相同的操作制作比较用传感器，并进行同样的测定。如果对于吸光度降低程度进行比较，则可以确认在比较用传感器中，可以看到更大的吸光度降低。一般认为这是由于作为电子传递体而使用的1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓不通过与葡萄糖的酶反应，而直接被抗坏血酸还原的结果。这样可以了解到，即使在光学式的传感器中，在具有干扰物质处理部件的传感器中，也可以大幅度抑制伴随添加抗坏血酸而引起的误差。
权利要求
1.生物传感器，其特征是具备电绝缘基板、测定体系和至少含有氧化还原酶和电子传递体的试剂层，并且包括有干扰物质处理部件，该处理部件含有对测试试样中所含干扰物质起氧化剂作用的氧化还原物质和对前述氧化还原物质进行固定的载体。
2.根据权利要求1中所述的生物传感器，其中，具有由前述基板、隔片部件和遮盖部件构成的试样供给通路。
3.根据权利要求1或2中所述的生物传感器，其中，把前述干扰物质处理部件设置在距离前述试剂层的上游侧。
4.根据权利要求1～3任意一项中所述的生物传感器，其中，前述测试试样为生物试样，前述干扰物质为易氧化性物质。
5.根据权利要求1～4任意一项中所述的生物传感器，其中，前述氧化还原物质为铁氰化物。
6.根据权利要求1～5任意一项中所述的生物传感器，其中，前述载体含有离子交换性高分子。
7.根据权利要求1～6任意一项中所述的生物传感器，其中，前述测定体系包括在前述基板上形成的工作电极和对电极。
8.根据权利要求1～7任意一项中所述的生物传感器，其中，前述电子传递体和前述氧化还原物质是同一种类的化合物。
全文摘要
提供可以对基质进行更高精度定量的生物传感器。在具备电绝缘基板、在前述基板上形成的工作电极、对电极和至少含有氧化还原酶和电子传递体的试剂层的生物传感器中，设置由对干扰物质起氧化剂作用的氧化还原物质和对前述氧化还原物质进行固定的载体构成的干扰物质处理部件。
文档编号G01N33/487GK1573322SQ20041004577
公开日2005年2月2日 申请日期2004年5月28日 优先权日2003年5月28日
发明者池田信, 中南贵裕, 吉冈俊彦, 桑畑进 申请人:松下电器产业株式会社
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