专利名称：戊型肝炎血清IgM抗体快速诊断试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学和生物学检验领域，涉及用胶体金免疫层析法制备的戊型肝炎血清IgM抗体快速诊断试剂盒。
现有技术
戊型病毒性肝炎是发展中国家的一种主要急性散发型肝炎，全球分布，�：ρ现�。其病原体戊型肝炎病毒(HEV)主要经消化道传播，是大小约27-34nm的单股正链无包膜的RNA病毒，基因组全长约7. 5kb，含3个开放读码框架(0RF1、 0RF2、 0RF3)，其中0RF2为编码660个氨基酸的多肽，是病毒的主要结构蛋白。
随着戊型肝炎病毒分子克隆技术的成功建立，HEV分子生物学的研究取得了极大进展，与之相关的HEV检测方法也正在不断完善。该方法包括两个方面，即采用基因工程重组抗原建立的抗体诊断方法和采用逆转录-聚合酶链反应建立的基因诊断方法，分别检测抗HEV抗体和HEV RNA。
利用体外表达的各种HEV重组蛋白，已建立了多种抗HEV检测方法，包括酶联免疫方法ELISA (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)禾口蛋白印迹技术WB (westernbloting， WB)等用于HEV感染的临床诊断和实验研究。
采用WB法检测血清抗HEV，其特异性要比ELISA法高，可用来作为戊型肝炎的确诊手段。该法是用HEV重组多肽电泳后转移到硝酸纤维素膜上，用于检测血清中的抗HEV抗体。但WB法操作技术相对较为复杂，检测所需时间较长，主要用于戊型肝炎的实验室研究。
早期的ELISA检测试剂只用了0RF3抗原，灵敏度低，不久被包被了0RF3、 0RF2融合抗原的EIA试剂所取代，灵敏度和特异性均较好。该方法虽在一定程度上弥补了过去HEV血清抗体检测方法的缺陷，但仍存在一些出于该方法本身的缺陷而无法解决的问题，如检测时间长(2 — 3小时)，步骤多(2 — 3步)，需特殊仪器(酶联检测仪)，须同时操作多人份血清，病人获得检测结果时间长等。
采用胶体金法，检测戊型肝炎结果直观(肉眼观察)、快速(10 — 20分钟出结果)、操作简便、无需专用仪器和设备、可用于床旁检验，复检极为方便。本发明旨在为临床诊断HEV感染以及HEV感染的流行病学调査提供一种快速、特异的诊断试剂盒。
发明内容
为克服现有戊型肝炎抗体检测技术的不足，本发明提供一种快速检测戊型肝炎血清IgM抗体的试纸条。不需要任何仪器设备辅助的快速检测试剂。本发明根据胶体金免疫层析技术特点和戊型肝炎0RF2/0RF3基因重组抗原系统特点，设计新的原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试纸条检测戊型肝炎血清IgM抗体水平，具有简单，快速，灵敏和特异性好等特点，30分钟以内出结果，并且价格低，适用于基层检测和临床初筛。
本发明所述试纸条是由PVC底板(1)上依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(3)、涂覆胶体金标记戊型肝炎ORF2/ORF3基因重组抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物。检测样品经过样品垫和结合垫再经层析作用在NC膜上出现检测线和质控线，用肉眼判断结果。在NC膜上仅仅出现一条质控线，结果为阴性，在NC膜上同时出现检测线和质控线，结果为阳性性，不出现线条表示试纸条或测试卡失效。30分钟内出结果。
本发明所述试纸条吸水垫为一种滤纸，包括吸水纸和滤油纸，切成要求大小直接使用。贴在底板的末端，起吸水作用。
本发明所述试纸条上特定包被的NC膜是一种专门用于胶体金试纸条的材料，由一层滤膜和胶膜组成，成巻筒装，NC膜上喷2条线，分别为检测线和质控线，检测线喷涂的是鼠抗人-IgM(y链)，质控线喷涂的是兔抗戊型肝炎ORF2/ORF3抗体；NC膜贴在底板的中间，两端分别与结合垫和吸水垫连接。
本发明所述试纸条上结合垫为玻璃纤维纸，喷涂上胶体金标记戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗原，再37。C干燥，结合垫上与样品垫衔接，下与NC膜衔接。
本发明所述试纸条样品垫为玻璃纤维纸，用硼酸缓冲液浸泡处理，缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，37。C干燥过夜，在试剂条中起过滤样品的作用，位于结合垫上，贴在底板上。
本发明还提供上述试纸条在制备戊型肝炎血清IgM抗体诊断试纸条中的应用，诊断试纸条还包括标识条，此标识条为两个带有标识的不干胶纸，分别粘贴在试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。
本发明还提供上述试纸条在制备戊型肝炎ORF2/ORF3血清IgM抗体测试卡中的应用，测试卡还包括塑料卡，此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔、 一个样品孔以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示检测线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。此塑料卡起保护试纸条的作用，并且更美观，减少污染和保护操作者的安全。本发明所述试纸条的制备方法，包括如下步骤
1) 戊型肝炎基因重组0RF2/0RF3抗原自制或购买，分子量35kDa，纯度10ug上样SDS-PAGE—条带。
2) 鼠抗人-IgM(y链)自制或购买。
3) 兔抗戊型肝炎ORF2/ORF3抗体通过戊型肝炎ORF2/ORF3免疫家兔，提取、纯化兔血清制备。
4) 胶体金的制备
a量取一定量的洗液于洁净的烧瓶中，煮沸5分钟；b量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟；
c弃去超纯水，称取适量三蒸水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入适量1%氯金酸，加热至沸腾；
d搅拌下加入6 10毫升1%柠檬酸三钠，沸腾5-10分钟；4)胶体金探针标记
取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值8.0，搅拌加入l毫升戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗原，再缓慢加入1毫升10。/。BSA充分混匀，搅拌，离心弃上清，加入工作液溶解；5 )制备检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条
用喷涂机将标记戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗原的胶体金溶液喷在玻璃纤维膜上，37'C干燥；将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(y链)和质控抗体(兔抗戊型肝炎ORF2/ORF3抗体)，喷完后37。C干燥过夜；将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测戊型肝炎血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条。
上述胶体金制备过程中，优选三蒸水200毫升，氯金酸10毫升，柠檬酸三钠7.5毫升。本发明的有益效果应用本发明提供的试纸条检测人体内戊型肝炎血清IgM抗体水平，成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，不需要特殊检测仪器设备，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展。本发明有益于戊型肝炎血清IgM抗体筛査的普及，对于戊型肝炎的预防和治疗有极为重要的意义。
图l为本发明的结构示意图
1: PVC底板；2:吸水垫；3:特定包被的硝酸纤维膜；4:检测线；5:质控线；6:结合垫；7:样品垫。
图2为本发明的检测结果示意图
a:阳性；b:阴性；C:无效；4:检测线；5:质控线。图3为本发明的试纸条外观示意图
a:样本垫；b:结合垫；C:检测线；d:质控线；e:试纸条名称图4为本发明的测试卡外观示意图
a:样本孔；b:测试孔；T:检测线；C:质控线。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例l:
戊型肝炎血清IgM抗体胶体金免疫试纸条制备方法，它包括如下步骤
1、 胶体金的制备
量取一定量的洗液于洁净的250ml三角烧瓶中，煮沸5分钟；量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟；弃去超纯水，称取200ml超纯水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入1%氯金酸10ml，边煮边搅拌，加热至沸腾；搅拌下加入l。/。柠檬酸三钠10ml，沸水下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色慢慢稳定，呈红色后，继续沸腾5分钟，制成小颗粒胶体金。
2、 制备检测戊型肝炎血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条
用喷涂机将标记戊型肝炎基因重组0RF2/0RF3抗原的胶体金溶液喷涂在玻璃纤维膜上，37'C干燥；将制备好的试剂条板上NC膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(y链)和质控抗体(兔抗戊型肝炎0RF2/0RF3抗体)。喷完后37。C干燥过夜。将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测戊型肝炎血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条。
实施例2:
戊型肝炎血清IgM抗体的胶体金免疫诊断试纸条制备方法，它包括如下步骤将两个带有标识的不干胶纸(标识条)分别粘贴在实施例2中所制备试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。即成一种检测戊型肝炎血清IgM抗体的胶体金免疫诊断试纸条。
见图3。
实施例3:
戊型肝炎血清IgM抗体的胶体金免疫诊断测试卡制备方法，它包括如下步骤将实施例2中所制备试纸条放入塑料卡下片试纸条槽中，与上片嵌合，即成一种检测同型半胱氨酸的胶体金免疫诊断测试卡，见图4。此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔(见图4b)、 一个样品孔(见图4a)以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示检测线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。实施例4:
戊型肝炎血清IgM抗体免疫胶体金诊断层析试纸条使用方法
如图3所示，将试纸条样品垫插入待测液中，浸润后取出，水平放置，约30分钟后，仅在质控线C处出现一条线，结果为阴性；在检测线T和质控线C处分别出现一条线，结果为阳性；不出现线条表示测试条失效。
实施例5:
戊型肝炎血清IgM抗体免疫胶体金诊断层析测试卡使用方法
如图4所示，将样本加入样本孔a，加样量75微升 80微升，水平放置，约30分钟后，仅在测试孔b的质控线C处出现一条线，结果为阴性；在测试孔b的检测线T和质控线C处分别出现一条线，结果为阳性；不出现线条表示测试卡失效。
权利要求
1.一种检测戊型肝炎血清IgM抗体的免疫胶体金层析试纸条，其特征在于所述试纸条是由PVC底板(1)上的依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(NC膜)(3)、NC膜上有检测线(4)和质控线(5)，喷涂胶体金标记戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物。1、所述试纸条，其特征在于所述吸水垫(2)为一种滤纸，包括吸水纸和滤油纸；吸水垫贴在底板的末端。2、所述试纸条，其特征在于所述特定包被的NC膜(3)由一层滤膜和胶膜组成，NC膜上喷涂鼠抗人-IgM(μ链)和兔抗戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗原；NC膜贴在底板的中间，两端分别与结合垫和吸水垫连接。3、所述试纸条，其特征在于所述结合垫(6)为玻璃纤维纸，喷涂上胶体金标记的戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗原，再37℃干燥，结合垫上与样品垫衔接，下与NC膜衔接。4、所述试纸条，其特征在于所述样品垫(7)为玻璃纤维纸，用硼酸缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2，浸泡处理后，37℃干燥过夜；样品垫位于结合垫上。5、所述，在制备戊型肝炎血清IgM抗体诊断试纸条中的应用，其特征在于诊断试纸条还包括标识条，此标识条为两个带有标识的不干胶纸，分别粘贴在试纸条的两端，带有箭头端是贴在样品垫和结合垫上，由此端浸入待测样品，靠另一端的吸水垫的吸水作用，使样品经过NC膜。6、所述，在制备戊型肝炎血清IgM抗体测试卡中的应用，其特征在于测试卡还包括塑料卡，此塑料卡是一个用塑料特制的卡，由上下2片组成，上下片可嵌合在一起，下片主要有一个放试纸条的槽和与上片结合的卡齿，上片主要包括一个检测孔、一个样品孔以及与下片结合的卡齿，检测孔旁边分别印有T和C字样，T表示检测线的位置，C表示质控线的位置，检测孔是观察结果的窗口，样品孔是滴加样品的位置。
2.一种检测戊型肝炎血清IgM抗体的免疫胶体金层析试纸条的制备方法，包括如下步骤，1、 戊型肝炎基因重组0RF2/0RF3抗原自制或购买，分子量约52kDa，纯度10ug上 样SDS-PAGE—条带。，2、 鼠抗人-IgM(y链)自制或购买。，3、 兔抗戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗体制备通过免疫家兔戊型肝炎基因重组 ORF2/ORF3抗原，提取兔抗血清，纯化后得到兔抗戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗体。，4、 胶体金的制备a量取一定量的洗液于洁净的烧瓶中，煮沸5分钟； b量取一定量的超纯水于该烧瓶中，煮沸5分钟；c弃去超纯水，称取适量三蒸水于该烧瓶中，加热至沸腾，加入适量1%氯金酸，加热 至沸腾；d搅拌下加入6 10毫升1%柠檬酸三钠，沸腾5-10分钟；，5、 胶体金探针标记取胶体金100毫升，调节胶体金溶液PH值8.0，搅拌加入l毫升戊型 肝炎基因重组ORF2/ORF3抗原，再缓慢加入1毫升10。/。BSA充分混匀，搅拌，离心弃上清，加入 工作液溶解；，6、 制备检测弓形虫血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条用喷涂机将标记戊型肝炎基因重 组ORF2/ORF3抗原的胶体金溶液喷涂在玻璃纤维膜上，37。C干燥；将制备好的试剂条板上NC 膜用喷膜机分别喷上鼠抗人-IgM(y链)和质控抗体(兔抗戊型肝炎基因重组ORF2/ORF3抗体)，喷完后37'C干燥过夜；将吸水垫、已包被的硝酸纤维膜、玻璃纤维胶体金结合垫、样品 垫依次粘于底板上，裁成细条，即成一种检测戊型肝炎血清IgM抗体的胶体金免疫试纸条。第4项所述制备方法，其特征在于4)步中所述三蒸水为200毫升，所述1%氯金酸为10 毫升，所述柠檬酸三钠为7.5毫升。
全文摘要
本发明属于医学和生物学检验领域，涉及用胶体金免疫层析法制备的戊型肝炎血清IgM抗体快速诊断试剂盒。检测戊型肝炎血清IgM抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法。该试纸条是由PVC底板(1)上的依次接合吸水垫(2)、特定包被的硝酸纤维膜(NC膜)(3)、NC膜上有检测线(4)和质控线(5)，喷涂胶体金标记戊型肝炎病毒基因重组ORF2/ORF3抗原的玻璃纤维胶体金结合垫(6)、样品垫(7)而组成的条形物。应用本发明所提供的试纸条检测人血清中弓形虫IgM抗体水平，具有操作简单、快速、灵敏和特异性好等特点，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作，具有良好的应用前景。
文档编号G01N33/576GK101650367SQ200910304169
公开日2010年2月17日 申请日期2009年7月9日 优先权日2009年7月9日
发明者吕传臣, 晟 周, 马运国 申请人:北京现代高达生物技术有限责任公司
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