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专利名称：红细胞免疫功能检测方法
技术领域：
本发明属于医学检测技术领域，涉及一种红细胞免疫功能的检测方法，具体涉及一种红细胞C3bR花环试验及红细胞IC花环试验的检测方法。
技术背景自1658年红细胞被发现后， 一直认为其是氧气和二氧化碳的运输者。随着 300多年的科技进步，人们逐渐认识到了红细胞的更多功能，其中的红细胞免疫功能是一个主要方面。1981年，美国生殖免疫学家Siegel在前人研究成果的基础上，发现了红细胞的多种免疫功能，首先提出了红细胞是免疫细胞，而且是免疫系统的一个子 系统，并提出了 "红细胞免疫系统"的新概念，更新了人们对红细胞功能的认 识。随着天然免疫研究的升温，1990年，Paccaud对红细胞膜补体受体进行了 比较研究，发现了其簇状分布的结合位点。2004年郭峰提出"红细胞天然免疫 主干道理论"，认为抗原进入血液中，首先被补体系统识别，抗原旁路激活补体 黏附补体成份，然后绝大部分附有补体成份的抗原被红细胞天然免疫黏附，最 终由红细胞递交给白细胞，引发白细胞产生一系列免疫反应。红细胞免疫已成 为多学科研究的桥梁与工具。红细胞数目众多，其免疫功能是其他免疫细胞所无法替代的。红细胞免疫 的基础是红细胞表面具有C3b受体(C3bR)，红细胞膜上的C3bR具有免疫黏附、携带及清除循环液相中抗原异物的功能，尤其清除循环免疫复合物(CIC)是红细 胞最主要的免疫功能。通过C3bR与C3b调理过的CIC结合，将其运送到肝脾等网 状内皮系统加以清除，防止CIC在体内沉积，从而避免血管或组织的损伤。而这 种免疫能力主要取决于红细胞膜上的C3bR数量，是衡量红细胞免疫功能状态的 主要指标。'Siegel等指出，血液循环中95M的C3bR存在于红细胞表面，因此红细胞C3bR是红细胞免疫黏附作用的关键部位，并在运送和清除免疫复合物(ic)方面起着重要作用。判断红细胞免疫功能的主要指标为C3bR和IC，目前通常釆用酵母 菌花环试验来测定红细胞膜上C3bR和吸附的IC情况。红细胞C3bR花环率和IC花环率可作为红细胞免疫黏附功能的指标，如二 项指标都低下，判为原发性细胞免疫功能低下，为红细胞C3bR受到破坏和影响 所致；如果红细胞C3bR花环率低，而IC花环率高，为继发性红细胞免疫功能 低下，是由于CIC增加，红细胞黏附IC过多引起。各国学者都在努力将红细胞免疫研究成果应用于临床诊断，Siegel的红细 胞免疫黏附试验原理为当今医学研究所推崇，但其试验中釆用的红细胞免疫检 测试剂配制和制备繁杂，价格昂贵，试验需要一定的高档精密仪器，不易普及 推广使用。中国人民解放军第二军医大学第一附属医院郭峰等人根据Siegel的 红细胞免疫黏附试验原理，建立了简易的红细胞C3bR花环试验与红细胞IC花 环试验(郭峰改良法)。该试验方法釆用致敏和未致敏的酵母菌试剂作为红细胞 免疫功能检测试剂，C3b致敏酵母菌试剂用于红细胞C3bR花环试验，未致敏酵 母菌试剂用于红细胞IC花环试验。其具体试验方法是将lg活性干酵母溶于99mL 蒸馏水中制成1°/。酵母菌悬液，经定性滤纸或纱布过滤，煮沸20min,用生理盐 水洗涤2次，使在低倍显微镜下呈单个细胞分散状态，配制成1 x 107mL未致敏 酵母菌溶液。取一部分未致敏酵母菌使用液，加入等量的补体小白鼠血清，于 3rC水洛15min，生理盐水洗涤2次，配制成1 x 108/mL致敏酵母菌溶液。将红细胞分离后配制成红细胞悬液，分别加入致敏和未致敏的酵母菌溶液，37。C水 浴30min后，以戊二醛溶液固定，涂片，干燥，甲醛固定，染色，显微镜下计 数，以黏附2个或以上酵母菌的红细胞为l个阳性花环，分别求出红细胞C3bR 花环率和IC花环率。郭峰改良法检测红细胞免疫黏附功能方法简单易行，检测结果可靠，成为 了目前开展红细胞免疫黏附功能检测的主要方法。但是在检测试验和临床应用中发现，郭峰改良法还存在以下几点不足1、补体失活现象严重，试剂保存期 短，影响检测结果的可靠性；2、检测试剂的制备方法繁瑣，原料浪费较大，制 备成本大；3、检测试验的搡作也比较繁瑣。CN1035215C专利提供了一种检测红细胞免疫功能的试剂及其制备方法，该 专利对郭峰改良法中的检测试剂进行了改进，釆用豚鼠血清或人AB型血清代替 小白鼠血清作为补体血清制备致敏酵母菌使用液，并对酵母菌使用液的制备方 法进行了简化。该专利与郭峰改良法比较的优势在于豚鼠血清较小白鼠血清 容易获得，补体无失活，试剂制备成本低，保存期长，检测结果容易判断，易 于普及推广。 发明内容本发明的目的是对现有红细胞免疫酵母菌花环试验进行改进，提供一种方 法更加简单，效果更加明显的检测方法。本发明的红细胞免疫功能检测方法包括以下步骤1) 、取动物肝素抗凝血，离心分离，提取血浆备用，将红细胞配制成 1.25xl07mL的细胞悬液；2) 、将酵母菌配制成1. 0xl07mL的酵母菌溶液；3) 、取等体积的细胞悬液与酵母菌溶液混匀，37。C水洛30min后，以0. 25% 戊二醛溶液固定，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆萨氏染色液染色，显微镜下计 数100个红细胞，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，求出红 细胞IC花环率RBC-ICR;4) 、取等体积的细胞悬液、血浆和酵母菌溶液一起混匀，37。C水洛30min 后，以0.25%戊二醛溶液固定，涂片，干燥，甲醛固定，以姬姆萨氏染色液进行 染色，显微镜下计数100个红细胞，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个 阳性花环，求出红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。国内通用的红细胞免疫功能检测方法为郭峰改良免疫酵母菌花环试验，该方法是将红细胞分离后配制成悬浮红细胞，对红细胞C3bR花环率(RBC-C3bRR) 和IC花环率(RBC-ICR)的检测分别需要致敏和未致敏的酵母菌。其中的致敏 酵母菌是利用小嚴血清中补体致敏后备用，制备成本高、工艺繁杂。本发明根 据免疫学原理，直接利用自身血浆中的补体进行酵母菌致敏，省略了致敏酵母 菌的加入，使得实验成本明显下降，实验步骤更加简明。其原理是红细胞膜上 具有C3bR,酵母菌经煮沸后，暴露的表面多糖能激活血浆(加入自身血浆)中 的补体，吸附红细胞补体大片段(C3b)成为致敏的酵母菌。在二者比例合适的 条件下，红细胞可通过膜表面的C3bR黏附C3b致敏的酵母菌形成花环。 本发明的优势在于1、 自身血浆较异体血浆更容易获得，绝无异体血液成份干扰。且血浆即取 即用，补体无失活。无需致敏酵母菌试剂的制备，检测结果更加准确可靠，容 易判断，易于普及推广。2、 本发明使用的细胞悬液是提取血浆后的全血细胞配制成的红细胞计数为 1.25xl07mL的全血细胞悬液，更加真实地反应了体内环境的情况，使检测结 果更加真实可靠。
具体实施方式
1、 细胞悬液的配制取观察对象空腹静脉血1 2mL,肝素抗凝，与生理盐水平衡后，2500r/min 离心分离5min,提取血浆加入一支试管中，并作标记备用。将约4mL生理盐水注入另一支试管，于分离后的全血细胞中间层提取10uL 全血细胞，加入生理盐水试管中，吹打均匀，镜下计数红细胞，配制成红细胞 计数为1.25xl07mL的全血细胞悬液，并作标记备用。2、 酵母菌溶液的配制1. OxlOVmL的酵母菌溶液由上海第二军医大学长海医院血液免疫研究室提供。将冷冻的酵母菌溶液剪开，常温解冻，吹打至均匀即可使用。 3、检测试验1) 、取2支试管，编号为IC和C3bR，分别加入红细胞计数为1.25xl07/mL 的细胞悬液和酵母菌溶液(1. Ox 10VmL)各50U1，混匀；2) 、在C3bR标记的试管中再加入50uL血浆；3) 、 二试管同时于37t:水洛箱中加盖水洛30min;4) 、将试管从水浴箱中取出，各加入50uL生理盐水，以0.25。/。戊二醛溶液 50uL固定，轻轻摇均；5) 、取二张玻片，分别作与试管相匹配的标记；6) 、从对应编号的试管中取出一滴试液，滴于对应的玻片上进行涂片，吹 干或自然凉干；7) 、甲醛固定，1~2滴/片，凉干；8) 、在玻片上先滴l滴生理盐水，再滴l-2滴姬姆萨氏染色液，均匀铺开 进行染色，约lmin时，细水轻轻冲洗；9) 、以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为l个阳性花环，显微镜下计数IOO 个红细胞的花环，分别计算出红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR和红细胞IC花环 率RBC-ICR。
权利要求
1、红细胞免疫功能检测方法，包括以下步骤1)、取动物肝素抗凝血，离心分离，提取血浆备用，将红细胞配制成1.25×107/mL的细胞悬液；2)、将酵母菌配制成1.0×108/mL的酵母菌溶液；3)、取等体积的细胞悬液与酵母菌溶液混匀，37℃水浴30min后，以0.25％戊二醛溶液固定，涂片，干燥，甲醛固定，染色，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，显微镜下计数100个红细胞，求出红细胞IC花环率RBC-ICR；4)、取等体积的细胞悬液、血浆和酵母菌溶液一起混匀，37℃水浴30min后，以0.25％戊二醛溶液固定，涂片，干燥，甲醛固定，染色，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，显微镜下计数100个红细胞，求出红细胞C3bR花环率RBC-C3bRR。
2、 根据权利要求l所述的红细胞免疫功能检测方法，其特征是所述的细胞 悬液是在分离血浆后的全血细胞中间层提取全血细胞，配制成红细胞计数为 1.25xl07mL的全血细胞悬液。
3、 根据权利要求l所述的红细胞免疫功能检测方法，其特征是采用姬姆萨 氏染色液进行染色。
全文摘要
一种红细胞免疫功能的检测方法，包括1)取肝素抗凝血离心分离，提取血浆备用，红细胞配制成1.25×10⁷/mL的细胞悬液；2)酵母菌配制成1.0×10⁸/mL的酵母菌溶液；3)取等体积的细胞悬液与酵母菌溶液混匀，加入和不加血浆，37℃水浴30min，戊二醛固定，涂片，干燥，染色，计数100个红细胞，以黏附二个或以上酵母菌的红细胞为1个阳性花环，分别求出红细胞C3bR花环率和IC花环率。本发明利用自身血浆进行酵母菌致敏，即取即用，补体无失活，无异体血液成份干扰，无需制备致敏酵母菌试剂，使用提取血浆后的全血细胞配制细胞悬液，真实反应了体内环境情况，使得实验成本明显下降，检测结果更加准确可靠。
文档编号G01N33/554GK101294959SQ20081005524
公开日2008年10月29日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者常国良 申请人:常国良