专利名称：甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸
背景技术：
甲型病毒性肝炎(简称甲肝)是由甲肝病毒(HAV)引起的一种病毒性肝炎。甲肝病毒属微小RNA病毒，对各种外界因素有较强的抵抗力而能长期在外界环境中存活，能通过各种污染物品以及水和食物传播，也可经苍蝇携带而传播。人类感染甲肝病毒后，大多表现为亚临床或隐性感染，仅少数表现问急性甲型肝炎。一般可完全恢复，不转为慢性肝炎。甲肝主要通过粪-口途径传播，潜伏期15-45天，病毒常在患者转氨酶升高前的 5-6天就存在于患者的血液和粪便中。感染后血清中抗-HAV IgM抗体很快出现，在两周左右达高峰，然后逐渐下降，在8周之内消失，是HAV急性感染和近期感染的血清学证据； 抗-HAV IgG抗体产生较晚，在急性期后期和恢复期早期出现(IgM开始下降时，IgG逐渐上升)属保护性抗体，在恢复期达高峰，可持久存在，可保护人体不再次感染，对甲肝流行病学调查、健康体检、了解易感人群有重要意义。目前对甲型肝炎病毒检测的主要方法是甲型肝炎病毒特异性抗体检测。检测甲型肝炎病毒IgM判定是否为现症感染，检测IgG判定是否曾经感染过，免于再次感染。检测两种抗体有利于对被检对象的进行全面的判定。目前甲型肝炎病毒抗体的检测方法主要是 RIA、ELISA等检测方法。在胶体金的检测方法中，有单独检测甲型肝炎病毒IgM或IgG的报道，但用胶体金类免疫层析技术同时检测甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体的检测试纸尚未有相关报道。和用两种试剂分别检测IgM和IgG抗体相比，同时检测IgM和IgG抗体能减少检测人员的工作量，节约成本；同时减少采血量，减少患者的痛苦。免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，在抗体检测方面已得到较为广泛运用， 基本原理如下利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗�：脱分信涮逑嘟岷闲纬筛春衔铮缓笤贜C膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T 线，通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、 适合现场检测和经济实用等优点。
发明内容本实用新型的目的是提供一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体检测试纸，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。本实用新型提供一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，其特征在于塑料支撑板(8) —端粘贴上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密压接含有标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VPl或VP3的胶体金垫( ，胶体金垫( 一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(3)， 硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线Tl (5)、检测线T2 (6)和质控C线，检测线Tl (5)为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T2 (6)为包被在NC膜上的抗人IgG抗体，质控C线为包被在NC膜上的抗甲型肝炎病毒VPl或VP3抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫⑷形成试纸。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，其特征在于所述的抗原甲型肝炎病毒特异性的主要抗原VPl或VP3抗原，抗原可以利用基因工程重组表达或在培养病
毒中纯化。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，其特征在于所述的上样垫(1) 为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，所述的抗原的包被方法为以 0. OlM pH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成l_2mg/ml的溶液，以0. OlM pH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBQ将抗人IgG抗体配制成l-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以 1-1. 5ul/cm的参数进行划线，包被T1、T2线，同时在NC膜上部包被抗甲型肝炎病毒VPl抗体作为C线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25°C，湿度小于30%，干燥2_5小时。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，所述的抗原标记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取 IOOml胶体金液放在烧杯内，用0. 2M K2CO3调至pH8. 5，按IOOml胶体金溶液加入0. 5-2mg 甲型肝炎病毒VP1和(或)VP3抗原，室温搅拌2小时，加入1 %牛血清白蛋白BSA，1 %聚乙二醇PEG20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml， 按Iml溶液铺20cm2的比例均勻地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，温度20_25°C， 湿度小于30%，干燥2-5小时，制成胶体金垫。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，所述的试纸的装配方法为在干燥室内，温度20-25 V，湿度小于40 %，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/ 粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/5 ；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10 ； 最后用裁剪机将贴好塑料板切成2-5mm宽的试纸条，切好的试纸条可以再装入塑料卡内， 形成检测卡。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，检测方法为将被检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入5-20ul被检样品，再加入 50-100ul的样品稀释液，使胶体金溶解并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在15分钟内 C、Tl、T2线的出现情况，并判定检测结果。本实用新型的有益效果是提供一种利用免疫层析胶体金技术检测甲型肝炎病毒 IgM和IgG抗体的新型试纸。采用胶体金标记甲型肝炎病毒特异性抗原，包被抗人IgM和 IgG抗体实现对血液中抗甲型肝炎病毒抗体的检测，一次检测获得两种检测指标，节约时间和成本，减轻患者的痛苦。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
图1甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸结构示意图。附图符号说明
4[0017]1 上样垫；2 胶体金垫；3 =NC膜；4 吸样垫5 检测线Tl ；6 检测线T2 ；7 质控C线；8 塑料支撑板
具体实施方式
实施例制备甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸1主要材料1. 1甲型肝炎病毒特异性VPl抗原、VPl抗体深圳市菲鹏生物股份有限公司产品，为重组抗原，VPl抗原用于胶体金标记，VPl抗体用于NC膜质控线包被；鼠抗人IgM和 IgG抗体=Arista公司产品，用于NC膜包被；氯金酸=Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜 Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白=Sigma产品。 其它常用试剂均为分析纯试剂。1.2临床血清由公司在相关医院获得，其中甲型肝炎病毒IgG抗体阳性样本50份， IgM抗体阳性样本15份，其中包括两种抗体均阳性样本8份。两种抗体全为阴性正常人样本60份。1. 3甲型肝炎病毒IgM抗体检测试剂盒(ELISA法)，甲型肝炎病毒IgG抗体检测试剂盒(ELISA法)国内已注册的商用产品。2 方法2. 1甲型肝炎病毒VPl重组抗原的胶体金标记氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0. 2M K2CO3将溶液调到pH7. 5、 pH8. 5和pH9. 5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每IOOml溶液加入0. 5mg、lmg、 1. 5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为
0.的PEG2000和的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液，PH8. 5，含BSA、羊血清，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按Iml溶液铺20cm2的比例加样于无纺布上，在温度 20-25°C，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。2. 2NC 膜包被用 0. OlM pH7. 2PBS 将鼠抗人 IgM 分别稀释成 0. 5mg/ml、lmg/ml、
1.5mg/ml,2mg/ml,鼠抗人 IgG 分别稀释成 0. 5mg/ml、lmg/mlU. 5mg/ml、ang/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按lul/cm进行分别划线包被，同时在NC膜上部包被抗VPl抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在在温度20-25°C，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2_5小时。2.3甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸的组装在干燥室内(温度 20-25°C，相对湿度< 30% )取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/ 粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试剂卡。2. 4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入IOul被检样品，若样品中含抗甲型肝炎病毒IgM或IgG抗体，则和样品垫上的标记VPl抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC
5膜上Tl线处的鼠抗人IgM时，复合物则又和包被抗IgM抗体结合，被捕获在包被处；当遇到包被在NC膜上T2线处IgG时，复合物则又和包被抗体结合，被捕获在包被线T2处；当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的Tl或T2线；若血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5、10、15、20、和30分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。2. 5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。2. 6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有临床血清进行检测，同时用商用检测ELISA试剂进行对照检测。3 结果3. 1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8. 5 ；重组混合抗原的最佳标记量为lmg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为IOmM硼酸酸盐缓冲液，PH8. 5，含0. 5% BSA、10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20 ；最佳包鼠抗人IgM和 IgG包被浓度均为1.5mg/ml。检测结果的最佳判定时间为5_15分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。3. 2临床血清检测以ELISA试剂为对照，对IgG抗体进行检测，本试剂IgG检测出阳性48份，ELISA检测出IgG阳性50份，灵敏度=48/50 = 96% ；本试剂对IgG阴性样本检测为阴性样本数59份，相对特异性=59/60 = 98. 3%。P > 0. 05。以ELISA试剂为对照， 对IgM抗体进行检测，本试剂IgM检测出阳性10份，ELISA检测出IgM阳性10份，灵敏度 =10/10 = 100. 0%;本试剂对IgM阴性样本检测均为阴性，相对特异性100%。P > 0. 05。 IgM和IgG同时为阳性的样本本试剂检测和ELISA试剂完全一致。临床检测表明本试剂的性能和ELISA试剂相比无显著性差异，适合用于临床检测。
权利要求1.一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，其特征在于塑料支撑板(8) —端粘贴上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密压接含有标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VPl或 VP3的胶体金垫O)，胶体金垫( 一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(3)，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线Tl (5)、检测线T2 (6)和质控C线，检测线Tl (5)为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T2 (6)为包被在NC膜上的抗人IgG抗体，质控C线(7)为包被在NC膜上的抗甲型肝炎病毒VPl或VP3抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(4)形成试纸。
2.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，其特征在于所述的抗原为甲型肝炎病毒特异性的主要抗原VPl或VP3抗原，抗原可以利用基因工程重组表达或在培养病毒中纯化。
3.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸，其特征在于所述的上样垫(1)为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。
专利摘要本实用新型公开了一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体联合检测试纸。特征在于塑料支撑板(8)一端粘贴上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密压接含有标记甲型肝炎病毒抗原VP1或VP3的胶体金垫(2)，胶体金垫(2)一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(3)，膜上包被有相互分离的检测线T1(5)、检测线T2(6)和质控C线，检测线T1(5)为抗人IgM抗体，检测线T2(6)为抗人IgG抗体，质控C线(7)为抗甲型肝炎病毒VP或VP1抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(4)形成试纸。检测时将被检样品加在试纸上样垫上，15分钟内肉眼直接观察，判定检测结果。具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/532GK202149901SQ20112018608
公开日2012年2月22日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者刘寅, 岳晓燕, 张有青, 王晶, 罗云萍, 霍五奎, 马雪明 申请人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司
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