专利名称：抗骨桥蛋白抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人抗骨桥蛋白抗体以及使用该抗体治疗自身免疫病、风湿病和风湿性关节炎的方法。
背景技术：
骨桥蛋白(以下称为“OPN”)是骨中大量含有的酸性钙结合糖蛋白，已知在人体中，由于mRNA剪接的不同，至少可产生3种同种型骨桥蛋白-a(以下称为“OPN-a”)、骨桥蛋白-b(以下称为“OPN-b”)和骨桥蛋白-c(以下称为“OPN-c”)(Y.Saitoh等，(1995)LaboratoryInvestigation，72，55-63)，其中，OPN-a的前体具有后附序列表中SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列，认为是通过分泌时，信号肽被切除，得到I17-N314的成熟OPN-a。另外，成熟OPN在第168号精氨酸残基的C末端一侧被生物体内的凝血酶切割，成为N末端片段和C末端片段2部分。
上述OPN承担着多种生理学、病理学的重要机能，例如，具有细胞粘附、细胞迁移、致瘤、免疫应答和抑制补体介导的细胞溶解等机能。上述各种机能是通过各种细胞表面受体介导的。OPN内部具有RGD序列(例如OPN-a中的第159～161号残基)，识别该RGD序列的αVβ3、αVβ1和αVβ5等整联蛋白是OPN的主要受体，其中αVβ3、αVβ1和αVβ5整联蛋白在血管的平滑肌细胞中介导细胞粘附，并且αVβ3与巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等的迁移有关。
以往的研究已阐明，OPN经由SVVYGLR序列与α9β1、α4β1和α4β7整联蛋白结合，但其中也发现下述的差异α4β1与未经凝血酶切割的OPN(未经切割型OPN)和被凝血酶切割的N末端片段(切割型OPN)两者都结合，α9β1只与凝血酶切割型OPN结合。(Y.Yokosaki等，(1999)The Journal of Biological Chemistry 274，36328-36334/P.M.Green等，(2001)FEBS Letters 503，75-79/S.T.Barry等，(2000)Experimental Cell Research 258，342-351)。这些α9和α4、β1和β7整联蛋白亚基其相互的氨基酸序列之间具有高相似性。α4β1和α4β7整联蛋白主要在淋巴细胞和单核细胞中发现，但在中性粒细胞中只是极少表达。而α9β1则在中性粒细胞中选择性地高表达，经由VCAM-1和Tenascin-C等在中性粒细胞迁移中承担必需机能。另外，在肌细胞、上皮细胞和肝细胞等中广泛表达。如上所述，人们认为整联蛋白亚基α4和α9的细胞质域通过各有微妙不同的细胞信号传导途径，互相协同，促进白细胞向炎症部位迁移和聚集，增强其浸润活性，从而参与各种炎症反应。
如上所述，各种种类的整联蛋白促进白细胞的迁移、参与炎症反应，因此认为抑制这些整联蛋白活性的药物应具有作为潜在的抗炎药的可能性。例如，整联蛋白αVβ3在破骨细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞等中表达，通过抑制αVβ3整联蛋白与各种结合配体的结合，例如在关节中，可望具有抑制关节破坏的作用，抗αVβ3抗体的开发已实际进行。
但是，属于整联蛋白家族的受体在广泛的组织中普遍地表达，承担维持生命活动所必需的机能，因此，如果在风湿性关节炎和变形性关节炎的治疗中使用抗整联蛋白抗体，会出现其他部位也受到同样抑制的可能性，有产生副作用的危险。
另外，WO 01/71358中公开了抑制α4整联蛋白与骨桥蛋白结合的物质的筛选方法，以及使用筛选得到的物质治疗炎症的方法等。
风湿性关节炎的病因有各种因素，已有很多报告，但都很不确定。另外，在其治疗方法中，目前已知的都是对症疗法，也无法满足需要。
因此，迫切需求明确风湿性关节炎的病因，提供更为优异的治疗方法，本发明的目的在于解决上述课题。
另外，风湿性关节炎难以与变形性关节病等区分，提供用于区别病症的诊断方法也是本发明的课题之一。
发明的公开本发明人发现，风湿病患者和变形性关节病患者中，关节腔液的OPN浓度显示较高值，还首次发现风湿病患者中，在所有OPN中经凝血酶切割型的N末端片段所占比例增加。推断OPN与这些疾病的发病有密切的关系。如后述参考例所示，通过使用OPN剔除小鼠进行的试验，证实了这一事实。
另外，制备分别鉴别性地识别凝血酶切割的OPN的N末端片段以及C末端片段的抗体，用所述抗体进行试验，发现在风湿性关节炎患者中的关节腔内，特别是被凝血酶切割的N末端片段显示高浓度。
本发明人着眼于上述风湿性关节炎患者中高浓度出现的N末端片段中共同存在人整联蛋白所识别的RGD序列和SVVYGLR序列的情况，推想同时阻断两个序列的抗体应该可以广泛抑制OPN与整联蛋白的结合，对风湿性关节炎和变形性关节炎的治疗有效。
并且，OPN也分布于肾脏、胎盘、卵巢、脑、皮肤等中，但主要在骨组织中表达。本发明人认为在治疗风湿性关节炎时，最好是以对OPN一侧更具特异性方法，来阻断OPN与整联蛋白的结合。此时，考虑到上述的各种各样的整联蛋白协同参与炎症，因此，认为更广泛地阻断与这些各种整联蛋白的结合应是有效的方法。
，因此制备了抑制人OPN的RGD序列与整联蛋白结合、人OPN的SVVYGLR序列与整联蛋白结合的抗体，并通过细胞粘附和细胞迁移等实验验证了其效果。并获得了抗小鼠OPN的该内部序列所对应的合成肽的抗体，使用小鼠关节炎病态模型研究了这种抗体作为治疗药物的效果。
即，在氨基酸序列中与人OPN同源的位置上，小鼠OPN上具有可为小鼠整联蛋白所识别的RGD序列和SLAYGLR序列，因此获得了同时阻断这些序列的M5抗体。已证实该M5抗体与小鼠OPN及其凝血酶消化物的结合受到含有RGD序列的GRGDSP肽抑制，另外该M5抗体抑制被TNF-α活化的、来源于小鼠脾脏的单核细胞的迁移。用小鼠的颅盖器官培养系研究该M5抗体时，观察到抑制骨破坏的作用。并且，将上述抗体给与小鼠的胶原诱导性关节炎模型时，证实显示出明确的治疗效果。
上述结果强有力地表明同时阻断RGD序列、SVVYGLR序列与人整联蛋白结合的抗体抑制OPN与整联蛋白的结合，对于风湿性关节炎等治疗有效，并且，预期不仅对青少年关节风湿病和慢性风湿病等风湿病有效，对牛皮癣性关节炎和银屑病的治疗也有效。另外，器官移植后的慢性排斥的特征是出现血管和支气管的闭塞性病变，从其组织学研究来看，认为是T细胞和巨噬细胞的活化导致产生细胞因子、增殖因子，引起血管内皮细胞障碍，进一步由于血管平滑肌增殖引起纤维化等，向血管闭塞进一步发展(P.Freese等，(2001)Nephrol DialTransplant，16，2401-2406/J.R.Waller等，(2001)British Journal ofSurgery，88，1429-1441/S.R.Lehtonen等，(2001)Transplantation，72，1138-1144)。有报道指出在这些巨噬细胞活化和血管平滑肌纤维化的过程中，OPN作为必需蛋白发挥功能(A.O′Regan等，(2000)Int J ExpPathol，81，373-390)。本发明的OPN抑制抗体可通过抑制单核细胞和中性粒细胞的迁移，来抑制上述向纤维化发展的过程。因此预期可以抑制器官移植后的慢性排斥反应，帮助器官存活，另外也对全身性自身免疫病、红斑狼疮、葡萄膜炎、贝切特病(Behcet’s disease)、多发性肌炎、增殖性肾小球肾炎、肉样瘤病等自身免疫病的治疗有效。
即本发明提供抑制识别RGD序列的整联蛋白与OPN或其片段结合，且广泛抑制识别SVVYGLR序列或其相当序列的整联蛋白与骨桥蛋白或其片段结合的抗骨桥蛋白抗体。
另外，本发明提供含有上述抗体作为有效成分的自身免疫病治疗剂、风湿病治疗剂以及风湿性关节炎的治疗剂。
本发明进一步提供将上述抗骨桥蛋白抗体给与风湿病患者以及风湿性关节炎患者，通过抑制骨桥蛋白的RGD序列与整联蛋白结合和/或SVVYGLR序列与整联蛋白的结合，治疗自身免疫病、风湿病以及风湿性关节炎的方法。
另外，本发明进一步提供利用上述骨桥蛋白抗体的风湿病的诊断药物以及诊断方法。
附图简述
图1是显示抑制RGD依赖型细胞粘附于OPN的图。
图2是显示抗体2K1抑制α9转化SW480细胞与nOPNRGD依赖型以及RGD非依赖型细胞粘附的图。
图3a是显示OPN诱导细胞迁移的图。
图3b是显示通过抗体抑制OPN诱导细胞迁移的图。
图4是显示将触发关节炎抗体混合剂/LPS分别给与OPN基因缺陷型小鼠和正常小鼠时关节炎计分随时间的变化图。
图5是将触发关节炎的抗体混合剂/LPS分别给与OPN基因缺陷型小鼠和正常小鼠时腕部肿大的比较图。
图6是显示小鼠OPN与NIH3T3的浓度依赖型粘附的图。
图7是显示GRGDSP肽抑制小鼠OPN与NIH3T3粘附的图。
图8是显示抗体M5抑制小鼠OPN与NIH3T3粘附的图。
实施发明的最佳方案本发明的抑制识别RGD序列的整联蛋白与OPN或其片段结合、且抑制识别SVVYGLR序列或其相当的序列的整联蛋白与OPN或其片段的结合的抗骨桥蛋白抗体(以下称为“OPN抑制抗体”)，只要是可抑制识别RGD序列的整联蛋白例如αvβ1、αvβ3和αvβ5等与OPN-a、OPN-b、OPN-c或其N末端片段结合，且可抑制识别SVVYGLR序列的整联蛋白例如α9β1、α4β1和α4β7等与OPN-a、OPN-b、OPN-c或其N末端片段结合的抗体，则可以是任何抗体。SVVYGLR序列或其相当的序列是指人OPN中从第162号丝氨酸到第168号精氨酸的序列，其相当的序列是指其他哺乳动物的OPN中相当于SVVYGLR的序列，例如在猪中与人类序列相同，为SVVYGLR；猴中为SVAYGLR；小鼠和大鼠中为SLAYGLR；牛中为SVAYGLK；兔中为SVAYRLK。本发明的OPN抑制抗体的制备方法并无特别限定，只要是制备保持上述性质的抗体即可，例如可以使用包含OPN-a、OPN-b、OPN-c、它们的N末端片段或氨基酸序列RGDSVVYGLR序列或其相当序列的肽(以下将它们统称为“OPN相关肽”)作为抗原来制备。这里所述OPN片段是指OPN经过蛋白分解酶等分解的片段，例如经过凝血酶分解的片段。
上述人OPN抑制抗体优选使用含有RGDSVVYGLR序列的肽作为抗原来制备。更优选例如以连续含有所述两个序列的OPN-a的由第153号缬氨酸残基至第169号丝氨酸残基的肽(VDTYDGRGDSVVYGLRS)作为抗原使用，可以按照下述常规方法进行处理而获得的抗体。为了提高抗原性，优选以上述OPN相关肽与生物高分子化合物的结合物作为抗原使用。
另外，使用小鼠作为实验动物进行与OPN有关的疾病等研究时，优选使用针对小鼠OPN的OPN抑制抗体，这样的抗体优选使用含有RGDSLAYGLR序列的肽作为抗原来制备。
与上述OPN相关肽结合的生物高分子化合物的例子有匙孔血蓝蛋白(以下称为“KLH”)、卵清蛋白(以下称为“OVA”)、牛血清白蛋白(以下称为“BSA”)、兔血清白蛋白(以下称为“RSA”)、甲状腺球蛋白等，其中更优选KLH和甲状腺球蛋白。
上述OPN相关肽与生物高分子化合物的结合可以通过例如混合酸酐方法(B.F.Erlanger等，(1954)J.Biol.Chem.234，1090-1094)或活化酯法(A.E.Karu等，(1994)J.Argric.Food Chem.，42，301-309)等公知的的方法进行。
在混合酸酐方法中使用的混合酸酐可以使OPN相关肽通过通常的Schotten-Baumann反应来获得，将其与生物高分子化合物反应，来制备目标肽-高分子化合物结合物。该混合酸酐方法中使用的卤代甲酸酯包括例如氯代甲酸甲酯、溴代甲酸甲酯、氯代甲酸乙酯、溴代甲酸乙酯、氯代甲酸异丁酯等。该方法中的肽、卤代甲酸酯及高分子化合物的使用比例可以在广范围内进行适当选择。
Schotten-Baumann反应是在碱性化合物的存在下进行的，该反应所使用的碱性化合物是Schotten-Baumann反应所常用的化合物，例如可以使用三乙胺、三甲胺、吡啶、二甲基苯胺、N-甲基吗啉、二氮双环壬烯(DBN)、二氮双环十一碳烯(DBU)、二氮双环辛烷(DABCO)等有机碱；碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠等无机碱等。
另外上述反应通常在-20℃至100℃，优选在0℃-50℃下进行，反应时间为5分钟-10小时左右，优选5分钟-2小时。
得到的混合酸酐与生物高分子化合物的反应通常在-20℃至150℃，优选在0℃-100℃下进行，反应时间为5分钟-10小时左右，优选5分钟-5小时。混合酸酐方法通常在溶剂中进行，溶剂可以使用混合酸酐方法所常用的任一种溶剂，具体包括二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等卤化烃；苯、甲苯、二甲苯等芳烃类；二乙醚、二噁烷、四氢呋喃、二甲氧基乙烷等醚类；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类；N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、六甲替磷酰三胺等非质子性极性溶剂等。
另一方面，活化酯法通�？梢匀缦陆�。首先将OPN相关肽溶解于有机溶剂，在偶合剂存在下与N-羟基琥珀酰亚胺反应，生成N-羟基琥珀酰亚胺活化酯。
偶合剂可以使用缩合反应中常用的偶合剂，例如二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑、水溶性碳二亚胺等。另外，有机溶剂可以使用例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜、二噁烷等。反应中使用的肽与N-羟基琥珀酰亚胺等偶合剂的摩尔比优选1∶10-10∶1，最优选1∶1。反应温度为0℃-50℃，优选22℃-27℃，反应时间为5分钟-24小时，优选1-2小时。反应温度可以在各物质的熔点以上、沸点以下进行。
偶联反应后，向溶解了生物高分子化合物的溶液中加入反应液，使其进行反应，例如当生物高分子化合物含有游离氨基时，该氨基与肽的羧基之间生成酰胺键。反应温度为0-60℃，优选5-40℃，更优选22℃-27℃，反应时间为5分钟-24小时，优选1-16小时，更优选1-2小时。
将上述方法得到的OPN相关肽与生物高分子化合物的反应物通过透析、脱盐柱等进行纯化，可以得到OPN相关肽与生物高分子化合物的结合物(以下可以简称为“结合物”)。
下面，对使用如上所述得到的结合物作为抗原制备抗体的方法以及使用该抗体的免疫化学测定方法进行说明。另外，制备抗体时，可以适当采用公知的方法，例如续生化学实验讲座、免疫生化学研究法(日本生化学会编)等中记载的方法。
使用上述结合物制备本发明的多克隆抗体时，可以用该结合物免疫动物，从该动物中收集抗体。
即，首先例如将OPN相关肽-甲状腺球蛋白结合物等的结合物溶解于磷酸钠缓冲液(以下称为“PBS”)，将其与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂、或明矾等辅助剂混合后的混合物作为免疫原免疫哺乳动物。
被免疫的动物只要是该领域常用的即可，可以使用任一种动物，例如可以例举小鼠、大鼠、兔、山羊、马等。另外，免疫时免疫原的给与方法可以是皮下注射、腹膜为注射、静脉注射、肌内注射中的任一形式，优选皮下注射或腹膜内注射。免疫可以进行一次或以适当间隔进行多次，优选以1周至5周的间隔进行多次。
接着，按照常规方法采集免疫动物的血液，分离血清，纯化多克隆抗体级分，可以获得OPN抑制抗体。
另外，根据常规方法，将用上述结合物免疫动物而获得的免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤，从该杂交瘤的培养物中收集抗体，可以得到作为单克隆抗体的OPN抑制抗体。
在将本发明的抗体用于人或动物的治疗用途时，优选使用通过基因工程、对所得到的OPN抑制抗体的恒定区进行修饰而具有与作为治疗对象的人或动物的抗体相同的恒定区的嵌合抗体(参照欧洲专利公开公报EP0125023)；以及使用所述动物化抗体(参照欧洲专利公开公报EP0239400或EP045126)。或者优选利用人为地导入了与作为治疗对象的人或动物的抗体产生有关的基因的转基因动物所制备的单克隆抗体(该动物型抗体)(参照欧洲专利公开公报EP0546073或WO97/07671)。
例如当治疗对象为人、产生OPN抑制抗体的动物为小鼠时，优选使用人鼠嵌合抗体或人源化抗体，进一步优选使用导入了与抗体产生有关的人类基因的小鼠等的转基因动物，来制备人单克隆抗体。另外，为了产生抗体，也可以使用噬菌体展示法。
对于如上所述得到的OPN抑制抗体，还可以以抗原识别区经蛋白酶等切割后的Fv、Fab或F(ab′)2的形式使用。
根据需要，对如此得到的OPN抑制抗体进一步纯化后，可以按照常规方法制成制剂，用于风湿性关节炎、青少年关节风湿病和慢性风湿病等风湿病、牛皮癣性关节炎、银屑病等的治疗；抑制器官移植后的慢性排斥反应；全身性自身免疫病、红斑狼疮、葡萄膜炎、贝切特病、多发性肌炎、增生性肾小球肾炎、肉样瘤病等自身免疫病的治疗。
本发明的OPN抑制抗体优选可以作为风湿病治疗药或风湿性关节炎治疗药使用。这些风湿病治疗药等的剂型例如可以是注射剂、输液等胃肠外制剂，优选通过静脉给药、皮下给药等的给药途径(作为自身免疫病治疗药时也可按照该途径)。另外制成制剂时，可在药学上可接受的范围内使用适合这些剂型的载体和添加剂。
制造上述制剂时，OPN抑制抗体的添加量根据患者的症状程度、年龄和所用制剂的剂型或OPN抑制抗体的结合效价等而不同，例如可以使用约0.1mg/kg至100mg/kg。
预计如上所述得到的本发明的治疗药通过有效成分OPN抑制抗体与OPN的RGD序列和SVVYGLR序列的强结合，抑制OPN的该部分与整联蛋白的结合，从而可以抑制风湿病和风湿性关节炎以及除此之外的自身免疫病的症状的恶化。
本发明的OPM抑制抗体不是与整联蛋白一侧，而是与OPN一例特异性结合，因此预期减少抑制整联蛋白的其他重要功能的危险性，避开副作用的问题。
本发明的OPN抑制抗体也可以进一步用于筛选自身免疫病治疗药的目的。即，如上所述，抑制OPN的RGD序列与整联蛋白结合以及SVVYGLR序列与整联蛋白结合的化合物均可以作为自身免疫病的治疗药。因此，向存在一定量的OPN和整联蛋白的测定系统内，竞争性地加入要筛选的物质(受试物质)和OPN抑制抗体，构成反应系统，测定相对于所使用的OPN抑制抗体的量，OPN-整联蛋白之间结合的抑制程度，则可评价受试物质作为自身免疫病治疗药的应用性。
同样地，抑制OPN的RGD序列与整联蛋白结合以及SVVYGLR序列与整联蛋白结合的化合物可以作为风湿病或风湿性关节炎的治疗药，因此使用OPN抑制抗体，构成与上述同样的反应系统，可以用于风湿病或风湿性关节炎的筛选。
另外，本发明的OPN抑制抗体可以用作风湿病诊断剂。如前所述，在风湿性关节炎患者的关节中，特别发现经过凝血酶切割的OPN的N末端片段的浓度高。因此，使用该OPN抑制抗体测定试样中OPN或其末端片段的量，则可用于风湿病的诊断。其方法可以利用放射性同位素免疫测定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvall等，(1980)Methods inEnzymol.，70，419-439)、荧光抗体法、噬斑法、斑点法、凝集法、Ouchterlony法等通常免疫化学测定方法中使用的各种方法(“杂交瘤方法与单克隆抗体”“Hybridoma Method and Monoclonal Antibody”，株式会社R&D Planning发行、第30-53页，1982年3月5日)。
可以从各种观点适当选择上述方法，但从灵敏度、简便性等方面考虑，优选ELISA法。更优选的方法有例如将本发明的OPN抑制抗体固定化于载体上，通过标记识别OPN上与本发明的OPN抑制抗体所识别的位点不同的位点的抗体，可以检出OPN或其N末端片段，可以以此作为风湿性关节炎的诊断剂。
标记上述抗体所使用的标记物有辣根过氧化物酶(以下称为“HR”)、碱性磷酸酶(以下称为“AP”)等酶；异氰酸荧光素、罗丹明等荧光物质；32P、125I等放射性物质；化学发光物质等。下面以夹心法为例，对更具体的OPN同种型的检测方法的顺序进行说明。首先(a)将本发明OPN同种型抗体固定化于载体上，然后，(b)用与抗原无关的例如蛋白质来封闭为固定化抗体的载体表面。进一步(c)向其中加入含有各种浓度OPN同种型的试样，生成OPN同种型-抗体复合物，(d)加入标记的抗OPN同种型抗体，与固定化抗原-抗体复合物结合，最后，(e)通过测定与载体结合的标记量，可以从事先制作的标准曲线中确定试样中游离OPN同种型的量。
首先，在(a)步骤中，用于固定化抗体的载体并无特别限定，可以使用任何免疫化学测定方法中常用的载体。例如有聚苯乙烯制的96孔微量滴定板或氨基结合型的微量滴定板。另外，使抗体固定化时，例如可以向载体上加入含有抗体的缓冲液进行温育。可以使用公知的缓冲液，例如10mM的PBS。缓冲液中的抗体浓度可从较宽范围内选择，通常为约0.01-100μg/ml，优选0.1-20μg/ml。另外，使用96孔微量滴定板作为载体时，缓冲液的量为300μl/孔以下，更优选约20-150μl/孔。温育的条件并无特别限定，通常在4℃左右温育过夜。
另外，由于在下面的步骤中添加的试样中的OPN存在与抗原抗体反应无关的吸附在载体上的情况，因此(b)的封闭步骤是为了防止这样非特异性吸附而进行的。封闭剂可以使用例如牛血清清蛋白(BSA)和脱脂乳溶液。或者也可使用市售的Block-Ace(大日本制药Code No.UK-25B)等封闭剂。对此无具体限制，例如向固定化抗原的部分加入适量的Block-Ace，在约4℃下温育过夜后，用缓冲液洗涤。对于缓冲液也无特别限定，例如可以是采用10mM PBS(pH 7.2)、0.8％(w/v)NaCl、0.02％(w/v)KCl和0.02％(v/v)吐温20组成的缓冲液。
在(c)步骤中，通过使含有OPN同种型的试样与固定化抗体接触，用固定化抗体捕捉OPN同种型，生成固定化抗体-OPN同种型复合物。可以在37℃左右反应1小时，但反应并不受此限定。反应结束后，用缓冲液洗涤载体，除去未反应的蛋白质等。该反应中使用的缓冲液优选为10mM PBS(pH7.2)、0.05％(v/v)吐温20组成的缓冲液。
进一步在(d)步骤中，加入识别被固定化抗体捕捉的OPN同种型的其他表位的标记抗体，形成固定化抗体-OPN同种型-标记抗体复合物。优选在该反应结束后，用缓冲液洗涤载体，除去未反应的蛋白质。该反应使用的缓冲液可以使用上述(c)步骤中所述的缓冲液。
在上述(d)步骤中使用的标记抗体，要求识别与(a)步骤中的固定化抗体所识别的表位不同的表位。例如使用识别OPN同种型的前半区的多克隆抗体作为固定化抗体时，作为结合酶(例如HRP或AP等)的标记抗体，优选使用识别OPN同种型的后半区的多克隆抗体。如上所述，通过使用识别不同位点的抗体，可以高灵敏度且特异性地测定因可变剪接而产生的OPN同种型。
(d)步骤中使用的标记抗体的量相对于与载体结合的固定化抗体为约5,000-10,000倍，优选与稀释的标记抗体反应，以使最终测定时的最大吸光度为1.5-2.0。可以使用缓冲液进行稀释，在约37℃反应约30分钟，但反应并不受此限定，优选反应后用缓冲液洗涤。通过上述反应，可以使抗体-OPN同种型-标记抗体复合物与载体结合。
最后，在(e)步骤中，加入与固定化抗体-OPN同种型-标记抗体复合物的标记物反应的显色底物溶液，通过测定吸光度，可由标准曲线计算OPN的量。
使用过氧化物酶作为标记抗体的标记物时，例如可以使用含有过氧化氢和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的显色底物溶液。可以加入显色底物溶液，在约25℃下反应约20分钟，然后加入1N硫酸，使酶促反应终止，但显色反应并不受此限定。使用TMB的情况下，通过测定450nm的吸光度来测定显色。另一方面，使用酶AP作为标记物的情况下，以对硝基苯磷酸(pMPP)作为底物显色，加入2NNaOH使酶促反应终止，在415nm下测定吸光度的方法是合适的。
事先通过添加了已知浓度的OPN同种型的反应液的吸光度制作标准曲线，使用该标准曲线，可以计算试样中的OPN同种型的浓度。
上述本发明的OPN同种型的检测方法可用于阐明OPN的作用、OPN相关疾病的诊断、治疗，该使用方法的例子有通过鉴别性地检测经凝血酶切割的OPN的N末端片段与未经切割型OPN，可以检测是否有炎症异常，例如鉴别风湿病与变形性关节病的炎症异常检测试剂盒。
如上所述，在风湿性关节炎患者的关节腔内，特别显示出经凝血酶切割的OPN的N末端片段的浓度高，但在变形性关节炎患者中，该倾向则显著降低。由于每位患者中在上述关节腔内OPN中N末端片段所占比例各有不同，因此为了鉴别性地诊断风湿病与变形性关节病，只要测定所有OPN中N末端片段所占的比例即可。
作为更具体的例子，可以针对OPN的三种同种型OPN-a、OPN-b和OPN-c均共同存在的下述三种序列，制备分别抗每种肽的抗体。
C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S(C+V153至S169) (1)K S K K F R R P D I Q Y P D A T D E C(K170至E187+C) (2)I P V K Q A D S G S S E E K Q C(I17至Q31+C)(3)其中，序列(1)存在于凝血酶切割位点的N末端一侧，在凝血酶未切割型的全长OPN和N末端一侧片段上都存在。而序列(2)存在于凝血酶切割位点至C末端一侧，在凝血酶未切割型的全长OPN上存在，但在N末端一侧片段上不含此序列。另外，序列(3)对应于OPN的N末端一侧第17号至第31号的氨基酸残基，在凝血酶未切割型的全长OPN和N末端一侧片段上都存在。用于鉴别风湿病患者与变形性关节病患者的诊断试剂盒可以由使用分别抗上述三种序列的肽的抗体中的2种的免疫检测试剂构成。即在第一免疫检测试剂中，使用抗上述序列(3)和(2)所示肽的2种抗体，来定量测定试样中被2种抗体共同识别的凝血酶未切割型OPN。此时，例如将抗序列(3)的肽的抗体固定化于载体上，使其与来源于患者的试样反应，洗涤后，可以加入抗序列(2)的肽的抗体作为标记抗体，根据与上述相同的夹心法检测。另外，在第二免疫检测试剂中，使用抗上述序列(1)和(3)所示肽的2种抗体，来定量测定试样中被2种抗体共同识别的凝血酶未切割型OPN以及经凝血酶切割而生成的N末端一侧的片段两者的总量。此时，例如将抗序列(1)的肽的抗体固定化于载体上，使其与来源于患者的试样反应，洗涤后，可以加入抗序列(3)的肽的抗体作为标记抗体，根据与上述相同的夹心法检测。通过对同一患者的试样用上述2种免疫检测试剂检测的结果进行比较，即可确定该患者的所有OPN中经凝血酶切割而生成的N末端一侧片段所占比例，从而可以鉴别风湿病和变形性关节病。
实施例下面例举实施例和参考例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例等的任何限制。
实施例1GST-OPN融合蛋白的克隆、构建、纯化以及试剂对于克隆和蛋白质纯化，基本上按照文献(S.Kon等，(2000)J.Cell.Biochem.77487-498)中记载的方法实施。
如下获得人OPN同种型a、b的cDNA。以从人肾癌细胞株NRC-12细胞中制备的RNA作为模板，合成cDNA，并以此为模板，使用下述OPN-5、OPN-3引物进行PCR，分别获得编码含有信号肽区的全长人OPN-a和OPN-b的cDNA。
接着，如上述文献所记载，将上述克隆的OPN-a和OPN-b的cDNA插入pGEX4T载体(Amersham Pharmacia Biotech，Tokyo，Japan)，使其与GST(谷胱甘肽S转移酶，EC2.5.1.18)基因为相同可读框，使用大肠杆菌JM109，以GST融合蛋白表达(以下，将如此得到的GST-OPN融合蛋白分别称为“GST-OPN-a”和“GST-OPN-b”)。
OPN-55’-CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3’OPN-35’-CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3’编码人OPN-c同种型的cDNA是以上述OPN-a的cDNA为模板，通过二步PCR制备。第一步是将OPN-5与下述OPNct-3引物、下述OPNct-5与OPN-3引物分别进行PCR，将两个PCR产物混合，通过加热后慢慢冷却使其退火，加入酶使其延伸。接着作为第二步，通过将OPN-5与下述OPN-3引物进行PCR，来获得编码含有信号肽区的全长人OPN-c的cDNA。按照与同种型a、b相同的方法，使该同种型c的cDNA重组到pGEX4T载体，制备GST融合蛋白(以下称为“GST-OPN-c”)OPNct-35’-ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC-3’OPNct-55’-TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3’编码从OPN-a的凝血酶切割位点到氨基末端一侧一半(M1-R168)的cDNA是以上述OPN-a的cDNA为模板，使用OPN-5和下述的OPNnh-3引物进行PCR而获得。按照与同种型a、b相同的方法重组到pGEX4T载体中，制备GST蛋白(以下称为“GST-Nhalf”)。
OPNnh-35’-GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3’从OPN-a的凝血酶切割位点到羧基一侧的骨桥蛋白蛋白质(hOPNC half)是以OPN-a的cDNA为模板，通过两步PCR制备的。第一步是用OPN-5、下述OPNch-3引物、下述OPNch-5与OPN-3引物分别进行PCR。第二步通过用OPN-5与OPN-3引物进行PCR，来制备羧基一侧的OPN蛋白质。按照与同种型a、b相同的方法，重组到pGEX4T载体中，制备GST蛋白(以下称为“GST-Chalf”)OPNch-35’-TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3’OPNch-55’-CACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3’各种重组GST-OPN融合蛋白可以按照常规方法由大肠杆菌中制备，根据上述文献所述方法，使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱进行纯化。其中对于GST-Nhalf蛋白，使用预切割蛋白酶(PreScission；AmershamPharmacia Biotech)将连接部分切开，除去GST蛋白部分，得到只由OPN的氨基末端一侧一半(I17-R168)构成的蛋白(以下称为“nOPN”)。
另一方面，进一步将编码全长OPN-a(M1-N314)的cDNA插入pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen)，用其转染CHO-K1细胞(大日本制药(株))(以下称为“CHO/OPN-a细胞”)。如下所述对由该细胞得到的糖链结合型OPN-a(以下称为“CHO/OPN-a”)进行纯化。即，对CHO/OPN-a细胞的培养上清液通过使用DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱(AmershamPharmacia Biotech)进行离子交换层析、使用ULTROGEL AcA44柱(BioSepra SA)进行凝胶过滤层析，接着采用RESOURCE RPC柱(Amersham Pharmacia Biotech)的反向柱层析进行纯化。
用于免疫致敏和结合研究的各种肽均购自Sigma Genosis Japan，或用肽合成仪(型号432 A、PerkinElmer Life Science)，按照Fmoc法(N-(9-芴基)甲氧羰基)化学合成，然后通过C18反向柱层析纯化制得。
实施例2单克隆抗体的制备准备以下所示的人OPN的内部序列所对应的合成肽，用于免疫。
肽1；C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S (C+V153至S169)肽2；C I D S Q E L S K V S R E F H S H (C+I261至H276)其中，肽1具有分别识别αvβ3和α9β1整联蛋白受体的RGD和SVVYGLR序列。
使这些肽与甲状腺球蛋白结合，按照常规方法，用于小鼠的免疫。然后从经过免疫的小鼠中分离脾细胞，使用聚乙二醇，与小鼠骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8-653进行细胞融合。根据文献(M.Kinebuchi等，(1991)J.Immunol.，146，3721-3728)所述方法，选择与用于免疫的肽反应的杂交瘤。
从用肽1和2免疫的小鼠中分别得到了命名为2K1和4C1的单克隆抗体。产生单克隆抗体2K1的杂交瘤于2001年6月20日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号为FERM BP-7883。另外，单克隆抗体53(mAb53)是用全长重组人OPN进行免疫而获得的(D.S.Bautista等，(1994)J.Biol.Chem.，269，23280-23285)。
实施例3OPN及其凝血酶消化物与单克隆抗体的反应性使用蛋白质印迹法，测试实验例2中得到的单克隆抗体2K1和4C1与OPN及其凝血酶消化物的结合力。表明2K1抗体与GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Nhalf反应。另外表明4C1抗体与GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Chalf反应。进一步表明这些单克隆抗体不但与由大肠杆菌生产的糖链非结合型重组OPN结合，也与糖链结合型CHO/OPN-a蛋白及其凝血酶消化物(以下称为“凝血酶切割型OPN”)反应。
实施例4单克隆抗体抑制细胞粘附于OPN通过以下方法研究单克隆抗体是否抑制细胞粘附于OPN。首先，在4℃下，用各种浓度的CHO/OPN-a预包被96孔板过夜，然后在37℃条件下，以0.5％BSA的PBS进行10分钟的处理以便封闭非特异性粘附。使人成纤维细胞TIG-7或用整联蛋白α9亚基cDNA转化的SW480细胞(以下称为“α9转化SW480细胞”)悬浮于含有0.25％BSA的D-MEM中，在各种浓度的单克隆抗体或合成肽的存在或不存在下，将200μl细胞悬浮液(细胞浓度为5×104细胞/孔)注入预包被CHO/OPN-a或nOPN的96孔板中，在37℃下孵育1小时。
从板上除去培养基，用含有0.25％BSA的D-MEM将所有孔洗涤2次。固定粘附的细胞，用溶于20％甲醇中的0.5％结晶紫染色30分钟。
用水将所有孔冲洗3次，使粘附的细胞溶于20％乙酸。将由各孔得到的所产生的上清液用免疫读出仪(immunoreader)分析，测定590nm下的吸收，求出粘附于孔上的细胞的相对数量。全部测定均进行3次，进行至少3次独立实验。所示数值为至少3个独立的实验的平均值。
已知TIG-7很好地粘附于OPN，但如图1A所示，该粘附明显地受到GRGDSP肽(100μg/ml)的抑制，不受对照肽(OPN的C末端部分K296-N314)(100μg/ml)的抑制，因此为RGD依赖型。另外，如图1B所示，表明200μg/ml的2K1抗体抑制细胞粘附于OPN。并且如图1C所示，2K1的细胞粘附抑制效果与mAb53所显示的效果相当，为浓度依赖型。2K1和mAb53并不抑制TIG-7细胞粘附于玻连蛋白(VN)和纤连蛋白(FN)。
图2显示单克隆抗体对nOPN和玻连蛋白与α9转化SW480细胞的粘附的抑制的图。如图2A所示，1μg/ml玻连蛋白与α9转化SW480细胞的粘附受到200μM GRGDSP肽(PGD)的抑制，因此为RGD依赖型。α9转化SW480细胞对3μg/ml nOPN的粘附受到200μM GRGDSP肽(PGD)和抗α9β1单克隆抗体Y9A2(A.Wang等，(1996)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，15，664-672)的组合的抑制，因此为RGD依赖型和非依赖型的粘附。另外，图2B显示了2K1对α9转化SW480细胞与nOPN和玻连蛋白的粘附的影响。α9转化SW480细胞与玻连蛋白的粘附不受2K1的抑制，但与nOPN的粘附受到2K1的抑制。结果表明2K1具有RGD依赖性的粘附抑制功能。
实施例5单克隆抗体对OPN诱导单核细胞迁移的抑制通过ChemoTx101-8系统(Neuro Probe Inc.)进行使用U937细胞的细胞迁移实验。使细胞在含有0.1％BSA的D-MEM中的浓度为2×106细胞/ml，加入到滤膜(孔径8μm)的上层，下层加入OPN蛋白质。
在37℃、5％CO2存在下，将ChemoTx板静置4小时。静置后，用甲醇固定滤膜，用苏木精和曙红(H-E)染色。以400倍放大倍数计数显微镜下迁移到滤膜的背面的细胞数。试验进行3次，取平均值作为数据。结果如图3所示。
图3a显示相对于所示浓度的CHO/OPN-a、凝血酶切割型OPN和GST-Nhalf，U937细胞的细胞迁移。另外，图3b为在50μg/ml的经过抗原特异性纯化的2K1、mAb53或对照小鼠IgG存在下或不存在下，使用10μg/ml的各OPN的抑制测定。
如图3a和图3b所示，CHO/OPN-a、凝血酶切割型OPN和GST-Nhalf浓度依赖性地诱导人单核细胞U937的迁移(A)。2K1抗体明显抑制由CHO/OPN-a、凝血酶切割型OPN和GST-Nhalf诱导的单核细胞的迁移。而mAb53只抑制由全长OPN所诱导的单核细胞的迁移(B)。
参考例1OPN与关节炎的诱发为了了解关节炎中OPN的作用，按照常规方法，人工制备OPN基因缺陷型小鼠(S.R.Rittling等，(1998)J.Bone and Mminer.Res.，13(7)，1101-1111)，与正常小鼠进行比较实验。
分别对OPN基因缺陷型小鼠(OPN-/-)和正常小鼠(OPN+/+)使用市售的关节炎触发用单克隆抗体混合剂(商品名关节炎用混合剂、Arthrogen-CIAmAb，Arthritogenic mAb cocktail、岩井化学药品)，作为引发关节炎的药物，按照产品说明书给药，引发关节炎，观察发病程度。使用给予生理盐水的两只小鼠作为对照。
关节炎发病程度通过下述的关节炎计分和给药10天后腕部肿胀程度进行比较。结果如图4和图5所示。
图4表明在给予关节炎用混合剂/脂多糖(以下称为“LPS”)的正常小鼠中，自第4天起关节计分上升，至第10天达到最高(12以上)。而在OPN基因缺陷型小鼠中，自第5天起关节计分上升，但最高只是4以下。另外，在给予生理盐水的组中，均未见关节炎计分的上升。
如图5所示，OPN基因缺陷型小鼠的腕部的肿胀明显比正常小鼠的程度弱，表明了OPN与关节炎有关。
实施例62K1抗体对人外周血白细胞迁移的抑制活性按照下述方法研究2K1抗体对细胞因子活化的人外周血白细胞迁移的抑制活性。对中性粒细胞迁移的抑制活性结果如表1所示，对单核细胞迁移的抑制活性结果如表2所示。
<实验方法>
用Ficoll法从健康人外周血中分离单核细胞级分和中性粒细胞级分(P.M.Daftarian等，(1996)Journal of Immunology，157，12-20)。对于单核细胞，收集Ficoll与血清之间的中间层，在烧瓶中在37℃下培养1小时，使用贴壁细胞。向收集了单核细胞级分后剩余的红细胞层中加入5倍量的3％葡聚糖-PBS，使红细胞凝集，然后在4℃下，以150×g离心5分钟。
凝集的红细胞沉淀，中性粒细胞以悬浮状态存在于上清中，因此通过将该级分在室温下、以500×g离心20分钟，得到中性粒细胞。将上述得到的单核细胞和中性粒细胞在TNF-α(20ng/mL)中培养过夜，将活化的细胞用于迁移实验。
使用48孔微量趋化室(micro chemotaxis chamber)(Neuro Probe Inc.)进行迁移实验。事先在37℃下，以各种浓度向凝血酶切割型OPN中添加2K1抗体，放置15分钟，然后加入到下室中(人OPN的终浓度为10μg/mL)。从上面装入聚碳酸酯滤膜(孔径5μm)，再向上室中加入50μL的细胞悬浮液(2×106细胞/mL)。
在37℃、5％CO2存在下培养2小时，然后取出聚碳酸酯滤膜，除去滤膜上侧表面的细胞，然后将浸润于滤膜背面的细胞用Diff-Quick(Baxter)染色。以40倍放大倍数显微镜计数染色的细胞数。结果以6孔平均细胞数(细胞/mm3)±SD表示。
<实验结果>
2K1抗体抑制了由TNF-α活化的人外周血中性粒细胞和单核细胞向凝血酶切割型OPN的迁移。
对中性粒细胞迁移的抑制
**P＜0.01(单因素ANOVA，Dunnett检验)对单核细胞迁移的抑制[表2]
**P＜0.01(单因素ANOVA，Dunnett检验)实施例7M5抗体的制备准备如下所示的小鼠OPN的内部序列(C+V138至R153)所对应的合成肽，用于免疫。
M5肽CVDVPNGRGDSLAYGLR将该肽与甲状腺球蛋白结合，按照常规方法同其免疫兔。采集经免疫兔的抗血清，使用使M5肽N末端的半胱氨酸与thiol Sepharosebeads(硫代琼脂糖凝胶微珠)(Amersham Pharmacia Biotech)通过二硫键结合的柱制备M5抗体。
实施例8OPN及其凝血酶消化物与M5抗体的反应性采用蛋白质印迹法测试实施例7中得到的M5抗体对OPN及其凝血酶消化物的结合力。所用OPN为由CHO细胞生产的糖基化重组小鼠OPN。M5抗体与OPN及其凝血酶消化物发生反应。
实施例9M5抗体抑制细胞粘附于OPN根据文献(S.Kon等，(2002)J.Cell.Biochem.，84(2)，420-432)所述方法研究M5抗体是否抑制细胞粘附于OPN。OPN使用由预切割蛋白酶(Amersham Pharmacia Biotech)除去了GST部分的小鼠全长OPN(以下称为“mOPN/de-GST”)。细胞使用小鼠NIH3T3细胞。
如图6所示，NIH3T3细胞浓度依赖性地粘附于mOPN/de-GST。另外，如图7所示，该粘附明显地受到GRGDSP肽(100μg/mL)的抑制，因此是RGD依赖型。图8表明200μg/mL的M5抗体抑制了细胞粘附于OPN。
实施例10M5抗体对来源于小鼠脾脏的单核细胞迁移的抑制活性根据下述方法研究M5抗体对细胞因子活化的、来源于小鼠脾脏的单核细胞迁移的抑制活性。结果如表3所示。
<实验方法>
用载玻片将C57BL/6小鼠的脾细胞捣碎成为单细胞，在37℃下在烧瓶中培养1小时，使用贴壁细胞作为单核细胞。将该单核细胞在人TNF-α(20ng/mL)中培养过夜，将活化的细胞用于迁移实验。迁移实验按照与上述实施例6中人的情况同样的方法进行。
<实验结果>
M5抗体抑制由TNF-α活化的来源于小鼠脾脏的单核细胞向由牛凝血酶(Sigma)将小鼠全长OPN(Genzyme)切割而得到的凝血酶切割型小鼠OPN的迁移。
**P＜0.05(单因素ANOVA，Dunnett检验)实施例11M5抗体对骨破坏的抑制作用根据下述方法研究M5抗体对小鼠颅盖器官培养系统中骨破坏的抑制作用，结果如表4所示。
<实验方法>
取下出生1天的新生小鼠的颅骨，取其一半调整为合适大�。湃�24孔板的各个孔中。向其中加入添加了终浓度为10nM的人甲状旁腺激素(PTH)(1-34)的D-MEM培养液(添加10％牛血清)，引发骨破坏。添加M5抗体，使终浓度为200μg/mL。在37℃下培养1小时后，用CaliumETest WAKO(和光纯药)定量测定由骨中释放到培养液中的钙量。
<实验结果>
未添加PTH的试样显示出7.02mg/mL的钙值，添加PTH，钙值为9.11mg/mL，可见促进了钙从骨中向外释放。以200μg/mL的浓度添加M5抗体，则可证实骨吸收受到约70％的抑制。
**P＜0.01(单因素ANOVA，Dunnett检验)实施例12M5抗体在小鼠胶原性关节炎模型中的效果根据下述方法研究M5抗体在小鼠胶原性关节炎模型中的效果。关节炎计分的结果如表5所示，足部浮肿的结果如表6所示，体重变化的结果如表7所示，摄食量变化的结果如表8所示。
<实验方法>
使用识别胶原中4个特异性表位的关节炎触发抗体混合剂(商品名关节炎用混合剂Arthrogen-CIAmAb，Arthritogenic mAb cocktail，岩井化学药品)诱发关节炎。将该关节炎混合剂对小鼠静脉给药，3天后，通过腹膜内给予LPS(100μg)诱发。自给予LPS后的第3天起观察关节炎，第6天达到最高分。
在给予LPS之前和给予后第3天，以40μg、150μg或400μg的剂量静脉给予M5抗体。其对照组为给予兔IgG组(给药量400μg)。另外，在给予LPS之前和给予后第3天，以200μg/小鼠的剂量静脉给予抗小鼠TNF-α抗体。其对照组为给予大鼠IgG组(给药量200μg)。另外，自给予LPS日起，按照每天一次的频率经口给予MTX(给药量3.2mg/kg)。此时使用的MTX是溶解于5ml的0.5％甲基纤维素溶液的MTX。作为其对照组，给予5ml 0.5％甲基纤维素溶液。
每组5只，进行关节炎计分、足部浮肿、体重变化、摄食量4个项目的评价。
<实验结果>
如表5至表8所示，M5抗体对小鼠关节炎模型(治疗效果)显示了改善关节炎计分、延迟发病和改善足部浮肿等的明确的抑制作用。对于关节炎发病的抑制是剂量依赖性，抑制程度超过给予抗小鼠TNF-α抗体(给药量200μg/小鼠)所产生的效果。与此相反，MTX几乎未显示药效。
在该模型的正常组中，进一步观察到在给予LPS后3天内，体重显著减轻约3g，虽然之后减轻的比率稍有缓和，但持续到第3-6天。而给予M5抗体组(150μg、400μg)以及给予抗小鼠TNF-α抗体组中表示出明显对体重减轻的改善。另外，关于摄食量，至给予LPS后第3天，对任何药剂均观察到体重急剧减轻，但在第3-6天中，观察到给予M5抗体组和给予抗小鼠TNF-α抗体组有改善。对关节计分的效果如表5所示、抑制足部浮肿的效果如表6所示、体重变化以及摄食量变化分别见表7和表8。
**P＜0.01，*P＜0.05(非参数Mann-Whitney检验)
*P＜0.05(非参数Mann-Whitney检验)
**P＜0.01，*P＜0.05(单因素ANOVA，Dunnett检验)
实施例13OPN相关片段肽的获得可以从Auspep Inc.(Parkiville，Australia)购入HPLC色谱纯化的OPN相关片段肽。其氨基酸序列如下述(1)-(3)所示。
hOPN5C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S(C+V153至S169) (1)hOPN3K S K K F R R P D I Q Y P D A T D E C(K170至E187+C) (2)hOPN1I P V K Q A D S G S S E E K Q C(I17至Q31+C)(3)
实施例14免疫用抗原的制备根据EMCS(N-(6-马来酰亚胺基己酰氧基)-琥珀酰亚胺)法，如下制备OPN相关片段肽与甲状腺球蛋白的结合物。制备结合物时，甲状腺球蛋白与OPN相关片段肽及EMCS的摩尔比分别为1∶300∶400。
分别将4mg实施例13的各OPN相关片段肽溶解于约1ml的蒸馏水中。将溶解于1ml 0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)的5mg甲状腺球蛋白、用二甲基甲酰胺溶解的80μg/μl EMCS分别按照上述摩尔比混合，制备甲状腺球蛋白-EMCS复合物溶液。将该复合物溶液分为3份，按照上述摩尔比分别向其中加入各种上述OPN相关片段肽溶液，制备由EMCS交联的OPN相关片段肽与甲状腺球蛋白的结合物溶液。
该结合物溶液用PBS透析，调节至结合物浓度为10μg/μl。将这样得到的OPN相关片段肽与甲状腺球蛋白的结合物作为免疫用抗原使用。
实施例15筛选用抗原的制备作为筛选用OPN蛋白，GST与人OPN同种型的融合蛋白GST-OPN-a、GST-OPN-b和GST-OPN-c、由凝血酶切割位点至氨基一侧的OPN片段(GST-Nhalf)、以及至羧基一侧的OPN片段(GST-Chalf)分别按照实施例1所述的方法制备，用于抗血清与OPN的反应性。
实施例16免疫致敏使用实施例14中得到的OPN相关片段肽与甲状腺球蛋白的结合物作为免疫用抗原，对兔进行免疫。通过间隔1周或2周给予100μl(100μg)结合物溶液来进行免疫。作为抗原，只在初次免疫时与弗氏完全佐剂混合，从第二次起则与弗氏不完全佐剂混合。免疫8次后，进行采血，分离血清，将其作为抗血清。
实施例17抗血清与OPN的反应性将实施例13中制备的OPN相关片段肽用0.1M碳酸缓冲液(pH9.5)稀释，使浓度为10μg/ml，以50μl/孔固定于96孔板中。用PBS洗涤，用0.1％BSA/PBS/0.05％NaN3溶液封闭，然后将实施例16中得到的抗血清的100倍稀释液依次稀释2倍，向孔中加入50μl，在37℃下反应30分钟。
反应结束后，用0.05％吐温20-PBS洗涤4次，向各孔中加入各50μlHRP标记抗兔IgG(IBL Co.，Ltd.)，在37℃下反应30分钟。反应结束后，向各孔中加入各100μl含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD)和0.03％过氧化氢水溶液的0.05M柠檬酸缓冲液(pH4.5)，在室温下以避光放置15分钟，让其显色。显色后，向各孔中加入100μl 1N硫酸，使反应终止，测定492nm的吸光度。
另一方面，使用实施例15中制备的OPN蛋白质，通过蛋白质印迹法研究抗血清的反应性。结果，针对OPN相关片段肽hOPN1和hOPN5的抗血清，与GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Nhalf反应，但不与GST-Chalf反应。针对OPN相关片段肽hOPN3的抗血清，与GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Chalf反应，但不与GST-Nhalf反应。
实施例18制备抗OPN相关片段肽抗体与HRP的结合物如下制备针对OPN相关片段肽hOPN3和hOPN1的抗体与HRP的结合物。用胃蛋白酶消化20mg各种抗OPN相关片段肽抗体，通过凝胶过滤纯化抗OPN相关片段肽抗体的F(ab′)2片段，使用2-巯基乙醇将F(ab′)2片段还原为Fab′片段。在37℃下，将HRP与EMCS反应60分钟，通过凝胶过滤制备HRP-EMCS结合物，进一步将该结合物与抗OPN相关片段肽抗体Fab′片段在4℃下反应过夜，通过凝胶过滤制备由EMCS交联的抗OPN相关片段肽抗体与HRP的结合物。
实施例19夹心ELISA系统的构建用夹心ELISA用平板与标记抗体的组合制备1-3、5-1两种系统。其中，1-3系统如下制备。将10μg/ml抗OPN相关片段肽hOPN1抗体加入96孔ELISA用平板，每孔100μl。在4℃反应过夜后，用10％BSA/PBS/NaN3溶液进行封闭，以此状态作为夹心ELISA用平板。以实施例18制备的抗OPN相关片段肽hOPN3抗体与HRP的结合抗体作为标记抗体。以这样使用抗hOPN1抗体的固相平板和使用抗hOPN3抗体的标记抗体的组合作为1-3系统。
同样，以使用抗hOPN5抗体的固相平板和使用抗hOPN1抗体的标记抗体的组合构建5-1系统。
实施例20以夹心ELISA系统进行受试者骨桥蛋白的测定如下进行OPN蛋白质的测定。向1-3系统和5-1系统的夹心ELISA用平板中加入100μl含有采集于受试者的血浆和关节腔液试样的溶液，在37℃下反应1小时。反应后，用0.05％吐温20-PBS洗涤4次，分别向各系统中加入100μl特异性标记抗体，在4℃下反应30分钟。反应后，用0.05％吐温20-PBS洗涤6次，加入100μl TMB溶液(四甲基联苯胺)，在室温下避光放置30分钟。用1N硫酸使反应终止，测定450nm的吸光度。
由上述方法测定的风湿病患者关节腔液(13例)的OPN值如表9所示，变形性关节病患者的关节腔液(12例)的OPN值如表10所示。另外，风湿病患者血浆(16例)的OPN值如表11所示，变形性关节病患者血浆(7例)的OPN值如表12所示，正常人血浆(6例)的OPN值如表13所示。
这些结果表明在血浆中OPN值的比较中，在1-3系统中风湿性关节炎患者、变形性关节病患者与健康人之间并未见显著性差异。但在5-1系统中风湿性关节炎患者、变形性关节病患者与健康人比较，其测定值显著偏高，风湿性关节炎患者为最高。这显示5-1系统反映出的总OPN量在关节炎类总体诊断中的有效性。
另一方面，风湿性关节炎患者及变形性关节病患者的关节腔液的OPN值较血浆中的OPN值高，强烈显示局部产生了OPN。
另外，在风湿性关节炎患者与变形性关节病之间关节腔液中OPN值的比较中，使用1-3和5-1的两个系统，风湿性关节炎患者的OPN值均较变形性关节症患者显著偏高。
作为新的指标，进一步研究了1-3系统/5-1系统的OPN值比。该指标可以比较凝血酶切割型OPN的比例。风湿性关节炎患者的血浆和关节腔液的OPN值为1以下，变形性关节病患者为2以上，可见显著性差异。因此，利用1-3系统/5-1系统的OPN值，可用作可区分风湿病患者与变形性关节病患者的早期检查方法。
序列表<110>株式会社免疫生物研究所(Immuno-Biological Laboratories Co.，Ltd.)藤泽药品工业株式会社(Fujisawa Pharmaceutical Co.，Ltd.)<120>抗骨桥蛋白抗体及其应用<130>PF-020002-WO<140>
<141>
<150>JP 2001-290700<151>2001-09-25<150>JP 2001-107578<151>2001-04-05<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(1)hOPN5<400>1Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg Ser
<210>2<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(2)hOPN3<400>2Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg ProAsp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr1 5 10 15Asp Glu Cys<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(3)hOPN1<400>3Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Cys1 5 10 15<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPN-5<400>4cgggatccac taccatgaga attgcagtga tttgc 35<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPN-3<400>5ccgctcgagt taattgacct cagaagatgc actatc 36<210>6<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNct-3<400>6acacagcatt cttttccaca gaacttccag aatcagc37<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNct-5
<400>7tgaggaaaag aatgctgtgt cctctgaaga aaacc 35<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNnh-3<400>8gcctcgagtt acctcagtcc ataaaccaca ct 32<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNch-3<400>9tcttagattt ggcacaggtg atgcctagga g 31<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNch-5
<400>10cacctgtgcc aaatctaaga agtttcgcag a 31<210>11<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽1<400>11Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg Ser<210>12<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽2<400>12Cys Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu Phe His Ser1 5 10 15His<210>13
<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述M5肽<400>13Cys Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>14Ser Val Val Tyr Gly Arg Leu1 5<210>15<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>15
Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser1 5 10<210>16<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>16Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg1 5 10 15Ser<210>17<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>17Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg Ser1 5 10<210>18<211>17<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述片段肽<400>18Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg1 5 10 15Ser
权利要求
1.抗骨桥蛋白抗体，所述抗骨桥蛋白抗体抑制识别RGD序列的整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合，并且抑制识别SVVYGLR序列或其相当的序列的整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合。
2.抗骨桥蛋白抗体，所述抗骨桥蛋白抗体抑制识别RGD序列的整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合，并且抑制α9β1整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合。
3.抗骨桥蛋白抗体，所述抗骨桥蛋白抗体抑制识别RGD序列的整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合，并且抑制α4整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合。
4.抗骨桥蛋白抗体，所述抗骨桥蛋白抗体抑制识别RGD序列的整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合，并且抑制α9β1整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合、以及α4整联蛋白与骨桥蛋白或其片段的结合。
5.抗骨桥蛋白抗体，其中权利要求1-4的片段为骨桥蛋白N末端片段。
6.权利要求1-5的任一项的抗骨桥蛋白抗体，其中所述抗体是以含有部分氨基酸序列RGDSVVYGLR的肽作为抗原而得到的。
7.权利要求1-6的任一项的抗骨桥蛋白抗体，其中所述抗体是以含有部分氨基酸序列RGDSVVYGLRS的肽作为抗原而得到的。
8.权利要求1-7的任一项的抗骨桥蛋白抗体，其中所述抗体是以肽VDTYDGRGDSVVYGLRS作为抗原而得到的。
9.权利要求1-5的任一项的抗骨桥蛋白抗体，其中所述抗体是以含有部分氨基酸序列RGDSLAYGLR的肽作为抗原而得到的。
10.权利要求1-5的任一项的抗骨桥蛋白抗体，其中所述抗体是以肽CVDVPNGRGDSLAYGLR作为抗原而得到的。
11.权利要求1-10的任一项的抗骨桥蛋白抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
12.权利要求1-8的任一项的抗骨桥蛋白抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
13.权利要求1-8的任一项的抗骨桥蛋白抗体，其中所述抗体是人类抗体。
14.自身免疫病治疗药，所述治疗药含有权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体作为有效成分。
15.风湿病治疗药，所述治疗药含有权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体作为有效成分。
16.风湿性关节炎治疗药，所述治疗药含有权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体作为有效成分。
17.变形性关节病治疗药，所述治疗药含有权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体作为有效成分。
18.自身免疫病的治疗方法，其特征在于将权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体给予自身免疫病患者。
19.风湿病的治疗方法，其特征在于将权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体给予风湿病患者。
20.风湿性关节炎的治疗方法，其特征在于将权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体给予风湿性关节炎患者。
21.变形性关节病的治疗方法，其特征在于将权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体给予变形性关节病患者。
22.自身免疫病治疗药的筛选方法，其特征在于评价受试化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整联蛋白的结合和/或SVVYGLR序列与整联蛋白的结合的抑制程度。
23.风湿病治疗药的筛选方法，其特征在于评价受试化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整联蛋白的结合和/或SVVYGLR序列与整联蛋白的结合的抑制程度。
24.风湿性关节炎治疗药的筛选方法，其特征在于评价受试化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整联蛋白的结合和/或SVVYGLR序列与整联蛋白的结合的抑制程度。
25.变形性关节病治疗药的筛选方法，其特征在于评价受试化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整联蛋白的结合和/或SVVYGLR序列与整联蛋白的结合的抑制程度。
26.抗骨桥蛋白同种型抗体，所述抗体是通过使骨桥蛋白同种型所对应的片段肽与生物高分子化合物结合，用该结合物免疫动物，由该动物收集抗体而获得。
27.权利要求26的抗骨桥蛋白同种型抗体，其中所述骨桥蛋白同种型所对应的片段肽是以下式(1)、(2)或(3)所示的肽，C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S(1)K S K K F R R P D I Q Y P D A T D E C (2)I P V K Q A D S G S S E E K Q C(3)
28.诊断方法及检测用的试剂盒，所述方法和试剂盒通过检测骨桥蛋白的N末端片段来鉴别风湿性关节炎和变形性关节病的炎症异常。
29.使用关节腔液或血浆用于权利要求28的炎症异常鉴别的方法及检测试剂盒。
30.用于检测炎症异常的试剂盒，所述试剂盒包含利用权利要求27的3种抗骨桥蛋白同种型抗体中2种抗体的组合的第一免疫检测试剂和利用不同的2种抗体组合的第二免疫检测试剂的组合。
31.权利要求29的炎症异常检测试剂盒，其中所述第一免疫检测试剂所使用的2种抗体分别为抗以下式(3)和(2)I P V K Q A D S G S S E E K Q C (3)K S K K F R R P D I Q Y P D A T D E C (2)所示肽的抗体；所述第二免疫检测试剂所使用的2种抗体分别为抗以下式(1)和(3)C V D T Y D G R G D S V V Y G L R S (1)I P V K Q A D S G S S E E K Q C (3)所示肽的抗体。
32.权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体在制备自身免疫病治疗药中的应用。
33.权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体在制备风湿病治疗药中的应用。
34.权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体在制备风湿性关节炎治疗药中的应用。
35.权利要求1-13的任一项的抗骨桥蛋白抗体在制备变形性关节病治疗药中的应用。
全文摘要
本发明公开了抑制识别RGD序列的整联蛋白与骨桥蛋白或其片段结合，并且抑制识别SVVYGLR序列或其相当的序列的整联蛋白与骨桥蛋白或其片段结合的抗骨桥蛋白抗体。该抗体可用作自身免疫病治疗药、风湿病治疗药以及风湿性关节炎的治疗药，并提供治疗自身免疫病、风湿病及风湿性关节炎的方法。另外该骨桥蛋白抗体也可用于风湿病的诊断剂和诊断方法。
文档编号G01N33/68GK1513000SQ0281108
公开日2004年7月14日 申请日期2002年4月4日 优先权日2001年4月5日
发明者上出利光, 今重之, 佐伯行彦, 横崎恭之, 野田政树, 山本宣哉, 之, 哉, 彦, 树 申请人:株式会社免疫生物研究所, 藤泽药品工业株式会社
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