男性生育能力分析方法和装置的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：男性生育能力分析方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于分析男性生育能力的方法和装置，特别是用于测定正向精子运动性和活性精子密度的方法和装置。
背景技术：
在美国和其它的工业化国家，在没有医学介入的前提下，夫妇具有15-20％不孕不育的可能性。男性不育症直接占三分之一左右并且在超过半数的受孕失败中成为主导因素。为了设计最合适的医学介入，必须精确测定男性精液样本的状况。根据世界卫生组织(WHO)为男性生育能力制定的标准，控制男性生育能力的主要因素为精液量、精子细胞密度、运动性、正向前进和形态学。这些标准并非是独立的。例如，具有高密度正向前进精子的精液样本也具有高运动性以及可接受的低形态缺陷率。因此，通过正确地测定精液样本中正向前进的精子细胞密度并将上述结果与国际医学标准对比，可以将男性不育症排除在受孕失败的原因之外，或者根据当前的医学惯例进行鉴定和治疗。
当前情况下，几乎所有的精液样本都是在设在大医院、医疗中心和由医生推荐的附属生育诊所的实验室中进行分析。由经过培训的技师进行大部分的精液分析。在显微镜下观察样本并对精子细胞组合物的几个方面进行量化，如密度、运动百分率、形态异常百分比和正向前进。这个时期，在英国和美国也可购买到一种可进行精子细胞计数的单个产品，其不需处方但可合法出售。
当前，对不孕夫妇的精液样本的分析受几方面因素的限制。许多夫妇直到困难和精神压力已持续很长时间也不愿为生育问题而寻求医学建议。一旦寻求了医学建议，由于窘迫和缺乏保密性，男性特别不愿意进行精液分析。需要经过训练的专业人员以及进行实验室测试在部分程度上引起了生育管理的高成本。对精液分析的低成本的私人替代品，如可从英国购买的家用细胞数测定仪，不能区分精液样本中的精子细胞和其它细胞类型，而且不能分析样本中精子细胞的任何运动特性。因此，希望提供一种基本上能克服上述缺陷的用于分析精子数目和运动性的家用方法和装置。
发明概述一方面，本发明包括用于分析精液样本中正向精子运动性和活性精子密度的方法。在实施该方法时，将精液样本放入样品容池中，并允许其从样品容池移入微通道并沿微通道向下游的收集区迁移，所述微通道将精子限定为通道内的单向运动。通过测量精子经过微通道的迁移率和流量来测定精液样本特性。微通道的优选宽度和深度尺寸均为10到100μm。
在一种概括实施方案中，微通道具有已知长度，下游收集区包括一个具有已知体积的收集容池，并且测量精子经过微通道的迁移率和流量的步骤可以包括(1)测量收集容池中存在的细胞的浓度变化，作为时间的函数，(2)根据步骤(1)以及收集容池的体积来确定样本中活性精子的密度，作为时间的函数，以及(3)根据步骤(1)测定精子通过下游方向微通道的平均迁移率。更具体地，步骤(1)可以包括产生一个时间相关函数，其斜率近似于单位时间内在收集容池中存在的细胞数的变化，并且其截距近似于在收集容池中首次出现精子的时间，步骤(2)可以包括将所述函数与一个或多个标准函数进行对比，所述标准函数是用具有不同的已知精子数和正向前进速率的精液样本产生的，并且步骤(3)可以包括根据截距确定正向精子的平均迁移率。
在本实施方案中，可以用荧光指示剂标记样本中的精子，并且步骤(1)可以包括测量收集容池中的荧光发射。这种标记方法可以包括将精子暴露于具有可裂解酯基的荧光指示剂中，该酯基可促进指示剂吸收到不带电状态的精子中，并抑制指示剂从带电的酯裂解状态的精子流出。
在另一个概括实施方案中，微通道的宽度可以将精子沿微通道的运动限制为单列运动，测量精子经过微通道的迁移率和流量的步骤可以包括(1)当精子从上游到下游方向迁移经过微通道内的检测区时对个体精子进行检测，(2)对迁移经过检测区的精子数目进行计数，以及(3)确定个体精子经过检测区的迁移率。
在本实施方案中，检测区的宽度优选约15到40μm。检测区可以由一对相邻的轴向间隔的检测器进行限定，并且步骤(1)可以包括将从每个检测器接收的信号进行关联以提高每个检测过程的信噪比。可供选择地，检测区由一对相邻的轴向间隔检测器进行限定，并且步骤(3)还可以包括利用从各检测器接收的信号之间的时间间隔来确定精子在微通道中的迁移率。
可以用荧光指示剂标记样本中的精子，并且步骤(1)可以包括测量精子迁移经过检测区的荧光。如上所述，精子可以用具有可裂解酯基的荧光指示剂标记，该酯基允许指示剂吸入基本不带电状态的精子，但抑制指示剂从带电的酯裂解状态的精子流出。
可供选择地，可以用磁性或导电金属的微粒来标记样本中的精子，并且步骤(1)可以包括测量(i)由邻近检测区设置的电路元件产生的电信号，以及(ii)经过检测区的用磁性或导电金属的微粒标记的精子的特征的电信号。步骤(3)可以包括从由电路元件产生的特征信号的变化率来确定精子经过检测区的迁移率。
另一方面，本发明包括用于分析精液样本中精子运动性和活动精子密度的装置。该装置包括微流控结构，其具有样品容池、下游收集区和在其间延伸的微通道。所述微通道的尺寸设定成将样本精子限定为通道内的单向运动，从而使设置在样品容池内的精液样本中的精子进入微通道并沿微通道迁移入收集区。还包括一个检测器，用于检测在微通道或收集区的标记精子的存在。装置中的一个电子单元可操作地连接到所述检测器，用于(i)接收检测器的信号，(ii)根据所接收的检测器信号来确定精液样本中的精子运动性和密度，以及(iii)显示与精子运动性和密度有关的信息。
所述装置可以制成为机内单元，例如，一个处理单元，具有可为控制单元和检测器供电的自有电源(电池)。所述装置中微通道的优选宽度和深度尺寸均为10到100μm。
在一个概括实施方案中，微通道具有已知长度，下游收集区包括具有已知体积的收集容池，并且电子单元运行以便(1)确定收集容池中存在的细胞的浓度变化，作为时间的函数，(2)根据步骤(1)以及收集容池的体积来确定样本中活性精子的密度，作为时间的函数，以及(3)根据步骤(1)确定精子经过下游微通道的平均迁移率。更具体地，在执行步骤(1)时，电子单元可以运行以产生一个时间相关函数，其斜率近似于单位时间内收集容池中存在的细胞数的变化，并且其截距近似于在收集容池中首次出现精子的时间，在执行步骤(2)时将所述函数与一个或多个标准函数进行对比，所述标准函数用具有不同的已知精子数和正向前进速率的精液样本产生，并且在执行步骤(3)时从截距确定正向精子的平均迁移率。
在本实施方案中，检测器可以包括LED、第一和第二光检测器以及整体式光学元件，该光学元件设计成(1)将来自LED的光导向第一光检测器，(2)将来自LED的光通过收集容池，以及(3)捕获从收集容池发射的荧光并导向第二光检测器。所述光学元件可以为由多个具有不同折射率的光学元件组成的整体式元件。
在另一个概括实施方案中，检测器布置成邻近微通道内的检测区。在本实施方案中，所述电子单元可以运行以便(1)当精子从上游到下游方向迁移经过微通道内的所述区域时检测个体精子，(2)对迁移经过检测区的精子数目进行计数，以及(3)确定个体精子经过检测区的迁移率。在本实施方案中，微通道的宽度优选约15到40μm。
检测区可以由一对相邻的轴向间隔的检测器进行限定，并且步骤(1)可以包括对从每个检测器接收的信号进行关联以提高每个检测过程的信噪比。可供选择地，检测区由一对相邻的轴向间隔的检测器进行限定，并且步骤(3)还可以包括利用从各检测器接收的信号之间的时间间隔来确定精子在微通道中的迁移率。所述检测器可以为荧光检测器。
可供选择地，检测器可以包括邻近检测区设置的电路元件，其中，所述电路元件对附近的磁性或金属导体微粒的运动作出响应，从而使得用磁性或金属导体微粒标记的精子经过微通道内检测区的运动将改变所述元件的感应系数。在本实施方案中，所述电子单元可以包括检测器电路，可操作地连接到所述元件，用于检测所述元件的感应系数的变化。在执行步骤(3)时，所述电子单元可以运行以便从由电路元件产生的特征信号的变化率来确定精子经过检测区的迁移率。
装置中的样本接收容池可以通过一个可降解的隔液插头与微通道的上游端连通，并且所述容池含有能降解所述插头的酶。
参照附图，通过阅读下面的详细说明，本发明的上述和其它目的和特征将会变得更加显明。
附图简述

图1显示了根据本发明一种实施方案构造的分析装置的立体图；图2A-2F(2A)为根据本发明构造的微流控装置中底板的平面图，(2B)为通过图2A中线A-A的截面图，显示了用于将输入端连接到微通道的中央检测容池和井，(2C)为微流控装置中顶板的平面图，(2D)为微流控通道的末端区域和在顶板上形成的相对容池的详细结构；以及(2E)为微流控通道和在顶板上形成的容池轮廓的详细结构；以及(2F)为完整的装置图，顶板和底板叠加在一起；图3为沿图2A和2C中的剖面线3-3得到的本发明分析装置中光学元件的截面图；图4示出如何用连有酯的荧光指示剂来标记样本精子；图5A-5C示出在图1的装置运行期间，在三个不同时间点处的样本运动和分布状态；图6显示了在图1的装置运行期间产生的典型精子浓度函数；图7为图1装置中的控制单元所执行的操作流程图；图8A-8C显示了本发明第二概括实施方案中微流控结构和相关检测器的平面图(8A和8B)，以及由两个检测器纪录的典型光学检测信号(8C)；图9为图8中两个检测器装置的控制单元所执行的操作流程图；图10为本发明第三概括实施方案中微流控结构和相关检测器的平面图；图11A和11B显示了图10的实施方案的电路(11A)和检测的信号(11B)；以及图12A和12B示出了本发明装置中的各种输出显示器。
发明详述
A.定义在本说明书中，除非另有说明，以下术语具有下面的含义。
“微通道”指一种通道，其具有的宽度和深度尺寸可促进精子以类似于在体内经由输卵管的方式经过通道运动。为了对正向前进的个体细胞进行计数，通道将变窄以便将精子限制为单列运动。典型地，微通道的宽度和深度尺寸均为约10到100微米。微通道可以具有任何横截面形状，如圆形或矩形，且长度达若干厘米。
“标记化合物”指任何能结合或并入精子细胞表面或内部的化合物，其结果是精子细胞含有可检测的标记物，优选荧光标记物。
“运动性”指运动的能力，并且“精子运动性”特指精子细胞可通过流体介质运动的性质。
“正向前进”指精子以线性方式运动的能力。
“活性精子”指那些活动的并向前运动的精子细胞。
“精子数”指由单个检测单元区分和计数的活性精子细胞数，并通过进行计数的体积而与“精子浓度”相关。
“精子密度”指在聚集的精液样本中活性精子的细胞密度，并且是男性生育能力的一项测定指标，根据世界卫生组织制定的标准，能生育的样本具有等于或大于20×106个精子细胞/cm3。
B.分析装置该部分通过参照三个概括实施方案描述了本发明的分析装置。在第一实施方案中，参照图1-7和12进行说明，由从样本接收容池通过具有已知长度的微流控通道进入到收集容池的精子迁移率和数目来确定精液样本中正向的精子运动性和活性精子密度，在所述收集容池内测定精子随时间的积聚。在图1、4、8、9和12所述的第二实施方案中采用了一对光学检测装置，其位于沿微流控通道的间隔位置处，用于检测当精子沿通道在上游容池和下游容池之间迁移时的个体精子。在图1和10-12中示出了第三实施方案，其根据微流控装置中电阻的时间相关变化来确定精子运动性和活性精子密度。
图1示出了根据本发明构造的机内装置20，用于测量精液中正向的精子运动性和活性精子密度。该图首先示出了外壳22，其装有(i)内部的微流控结构，将于该结构中测定精子的活动特性，(ii)检测系统，用于检测精子在所述微流控结构内的运动和/或积聚，和(iii)电子单元，可操作地连接到所述检测系统，用于根据检测的信号来确定精子特性。
下面将讨论这些部件的结构和运行。
如图1所示，外壳22限定了一个样本接收开口24，如将要描述的，其在内部与所述装置中微流控系统的样本接收容池连通。也显示了比色皿或样本收集固定器26，用于射精总量的收集和样本的制备。比色皿可以用体积指示器标记物(未示出)来指示最少的精液体积，如由WHO标准测定的男性正常生育能力所必需的1.5mL的体积。比色皿可以直接插入所述装置的开口24，用于将流体从固定器转移到所述装置的微流控结构，或者可以提供一个附加的样本制备管，以容纳较小体积的总射精量、全部样本的稀释物、或者全部样本与其它液态或固态化学药品的混合物。
欲插入样本接收井的比色皿被称作积聚样本固定器并可以具有包括比色皿的全部底面的底部开口，或设在底面内的某种较小尺寸的装置，其可轻易地用削尖的进口(如注射器针头)在开口底部穿孔。底面可以由橡胶或蜡制成以允许穿孔而不泄露样本。样本可以通过毛细作用吸入流控通道。样本固定器可以预填充或涂有固态和/或液态的化学化合物，如标记化合物和/或消化酶。消化酶如胶原酶或胰岛素可用于促进精液样本正常的溶解蛋白分解。可以加入化学药品如氯化钠和果糖以提高精液样本的体外存活率。典型地，比色皿也包括精子标记试剂，用于用可检测的指示剂如荧光指示剂标记精子，如以下讨论的。
样本固定器可以预填充液体试剂，或者那些除固定器中的样本之外可以在独立的流体分配器中提供给使用者的试剂。所述液体试剂可以包括糖和盐的均透水溶液(大约290mOsm)，主要由但不局限于果糖、氯化钠、氯化钙、氯化镁和氯化钾组成，用HEPES缓冲液维持在生理pH下。
固定器中的预填充溶液或固体试剂可以含有标记化合物，或者该标记化合物可以以固态形式包含在装载容池或量筒中。所述标记化合物或者因为浓度或量子产率的原因在溶液中为弱荧光的，或者因为由于活性积聚、分配或酯酶活性而使浓度增加或者因为由于脂类插入或环境改变而使量子产率增加的原因导致在精子细胞上或内部为强荧光的。
一旦将样本固定器插入所述装置中，用一个削尖的进口刺穿积聚样本固定器的底部，从而使积聚样本可以进入分析装置内的流体通道。可供选择地，样本一旦与比色皿中的试剂混合，可以倒入开口中，并从那里，例如通过溶解可酶解的塞子或由使用者去除封口后，进入微流控结构。
图中也显示了显示窗28，用于向使用者显示分析结果。下面参照图12A和12B讨论了两类显示信息。在一种优选的实施方案中，将装置20制造成小型的手持式一次性装置。
C.基于收集容池中精子检测的装置该部分描述了根据本发明第一实施方案构造的收集容池装置的组件。参照图2A-2F，图2F显示了由底板32(图2A)与顶板34(图2C)对正接合而组成的微流控结构30。如在图2A和2B中最清楚地看到的，底板32包括在该板的上游端部区域的、在其上表面形成的一个泪珠状凹口36，将形成结构中的收集容池部分的一个中央圆柱形容池凹口38，以及一个下游凹口40。底板内还具有一个圆形对准凹口42，用于当两块板连在一起时将顶板和底板对准，还有一个接头44，用于对准结构30上的光学元件，如将要看到的。
现在参照图2C-2E考虑顶板34的结构，样本接收开口46形成于该板的上游端。形成于该板下侧的微流控通道48具有两个单独的通道段上游段48a从上游供给凹口50延伸至中央容池凹口52，下游段48b将凹口52延伸至下游的排放凹口54。图2D的放大图分别显示了凹口50、54和相邻的通道段部分48a、48b。凹口50(如图2E的放大图所示)具有与底板中的容池凹口38相同的圆形尺寸，并随之在装配的结构中形成圆柱形收集容池60(图2F)，将在那里收集用于检测的标记精子，如以下讨论的。在一种例示性实施方案中，收集容池的柱半径为0.1-1mm，深度为0.1-1mm，以产生0.001-1mm3的已知体积。
刚好在凹口52下游的通道段48b内有一个通道迂回路56(图2E)，其用于限制迂回路下游的活动精子的流动，从而限制活动精子的运动超出容池。
如上所述，在本实施方案中，微通道指两个微通道段48a、48b，其宽度和深度尺寸均为10到100微米，优选15-60微米。所述微通道可以具有任何横截面形状，如半圆形或矩形，并长达若干厘米。微通道并且尤其是微通道段48a的尺寸的功能为可允许活动精子从上游到下游方向但在十分局限的空间内经过通道前进，其中，精子在通道内具有非常低的逆转运动可能性。如以下将要看到的，通道的宽度和/或深度可以容纳精子并排经过通道或可以将精子限定到单列运动。在前一种情况下，通道的宽度和深度尺寸优选50微米-100微米；在后一种情况下为10-30微米。
如从对板32、34的前述描述中可以理解的，并根据图2F，装配的结构具有由开口46形成的样本入口端，并且该入口端与底板内的凹口36相通以形成样本接收站47。在其下游端，凹口36与顶板中的上游供给凹口50重合，用于通过毛细作用将液体从凹口36转移到凹口50以及从该凹口转移入微通道48，在这里，微通道的中央区域由圆柱形收集容池60阻断。自该容池开始，流体从下方的微通道48b吸入与凹口40重合的凹口54，用于将液体分配到由凹口40和开口40形成的排放容池。典型地，在结构30中描述的流体通道在制造时填充有适当的液体介质如等压盐溶液，并在使用前被密封。当样本流体加入到所述装置时，所述样本与样本接收站内的预填充流体混合。在所述样本中并且现在为样本接收站中含有的精子很快遍及该站分布，启动一系列的精子迁移现象，这将形成用于测定精子运动性和正向运动精子密度的基�。缦滤�。
可以采用聚合物材料的喷射模塑法制造板32、34，优选透明聚合物如聚丙烯、聚碳酸酯，或其它任何公知的透光聚合物，以提供明确稳定的模制性能。可供选择地，可通过将公知的表面制作方法应用到各种适当的材料如硅、玻璃、石英、塑料或其它聚合物而形成板。在后一种方法中，可以通过激光烧蚀或化学蚀刻制作通道。通过将烧蚀中所使用的激光聚焦、或者通过利用微型光刻法，在蚀刻前掩饰基底，可获得所提议的通道尺寸。每个板的典型宽度、长度和厚度尺寸为0.5-2cm、2-4cm和1-2mm。典型地，装配结构的总厚度为2-3.5mm。典型地，除凹口52之外，凹口的厚度尺寸为25-100微米。
两块板一旦被形成并放成相互对准，采用常规方法如化学法、静电法或通过加热和加压(熔焊)的方式连接。
参照图3，微流控结构30安装于板64上，如印刷电路板，其也支撑着(i)发光二极管66，其作为结构30中收集容池内的荧光样本物质的激发光源，一对光学检测器68、70，可操作地检测由容池内的样本物质所发射的光，以及具有如下所述的多个光学元件的整体式光学装置62，分别用于将来自LED的激发和发射光波导入检测器。
可以用光电二极管、CCD或其它固态检测器检测发射光。这些是便宜可靠的，具有快速的响应时间，并可在宽范围的波长灵敏度轮廓和尺寸中使用。一种例示性的LED是由Uniroyal供应的UNPRX465-OG1LED，其主要发射450-470nm波长附近的蓝光。一种例示性的光检测器是由Centronic供应的OSD1-0光电二极管。
如可从图2A和2C理解的，光学组件横跨微流控结构的中央“切断”部分，并通过结构30中的光学元件和接头44之间的适当部件与之对准。通过与板64上的固定件72交错连接而进一步在板64上对准所述光学元件。
从操作说明中可以理解装置中的各种光学元件(i)将来自LED光源的光束导向光检测器68，以便为LED光强提供参考(用黑色线指示)；(ii)将来自LED的激发光束聚焦到微流控结构的收集容池(在图3中用黑色线指示)，以及(iii)将来自收集容池的发射光导入光检测器70，用于测量容池中的荧光水平(用灰色线指示)。
如图3所示，来自LED66的发散光线被弯曲的反射表面71反射并会聚到检测器71上。相对于检测器70测定的由LED诱导的荧光发射光强而言，在该检测器测定的光强被用于校准LED光强。来自LED的发散光线也通过起会聚作用的透镜元件72进行引导，产生具有平行光的光线，如所显示的。这些光线被直角反射表面74反射，并且所述反射光束通过装置中的滤光器插件78内含有的高通滤光器76。滤光器76被设计成去除由LED产成的低频成分，例如有可能与荧光发射波长重叠的红色和绿色成分。一种优选的滤光器为450-470nm的带通滤光器。现在，被反射并被过滤的光又被会聚的反射表面80反射，其用于将反射光会聚到微流控结构中的收集容池60。通过设置在容池下方的板64上的反射镜82而进一步提高样品容池内激发光的强度。
从图3的射线图可以理解，上述激发光光路将光线限制成沿图中基本垂直的方向。为使激发光和发射光重合最少，从基本上与激发光正交的发射光来检测荧光发射，即基本上在图中的水平方向。该发射光或者直接穿过光学装置中的元件86，或者从位于收集容池对面的反射镜84反射进入该元件。导入元件86的发射光被弯曲的反射表面88反射，从那里到斜角反射镜90，并通过滤光器插件94内含有的低通滤光器92。该滤光器为低通滤光器，设计成去除大于荧光发射波长的光频率，代表来自LED的激发频率。一种优选的滤光器为505-540nm的带通滤光器。滤过的发射光束被直角反射表面102反射并通过起会聚作用的透镜元件104会聚到检测器70，其随后测定来自收集容池中的样本物质的荧光发射强度。
光学元件中的光学装置制成单模塑料件，如模制的聚醚-砜、聚碳酸酯或丙烯酸的或其它具有相对高的折射率和良好的光传输性的聚合物。在显示的特定实施方案中，整个装置由一种聚合物材料形成，尽管在其它实施方案中可以采用具有不同折射率的聚合物，例如，在受控注射中，将不同的聚合物材料连续注入模具中。通过应用具有反射涂层的胶带来形成板64上的反射表面。光学组件内的反射由全内反射组成。
通过多种公知方法中的任何一种，包括结合标记的抗体或荧光标记的选择性吸收，可以例如以荧光标记法来标记样本中的精子。图4示出了后面方法的优选实施方案。该图显示了具有外部膜102的个体精子细胞100。由于哺乳动物细胞膜的特性，相较于带电物质而言，膜102更能透过不带电分子。在该方法中，荧光标记试剂为一种荧光分子，其具有荧光指示剂基团(F)和可裂解酯基(--OC(O)-R)，该酯基可以在酯键处被细胞内酯酶裂解为酸性荧光分子和乙醇水解产物(R-OH)。一种优选的荧光分子为由分子探针公司(Molecular Probes)生产的钙黄绿素AM酯(Calcein AM ester)。
如图所示，当分子被酯化时主要以不带电的形式存在，并因此可以轻易地越过膜102而迁移进出细胞。一旦进入细胞内部，分子易受到细胞内酯酶的修饰，裂解酯键并留下在细胞内的pH下主要以带负电形式存在的酸性基团。优选在最初的细胞预处理时执行标记过程，室温下标记时间优选至少5-15分钟。预处理的样本物质加入到所述装置的微流控结构中，因而包括精子和内在化的荧光标记的悬浮液，以及主要是非裂解形式的细胞外标记物。
在另一个概括实施方案中，通过光散射或光吸收来检测精子，而不是通过来自光源如LED的荧光。例如，可以用有色的或UV吸收指示剂通过抗体或其它由指示剂衍生的精子结合剂来标记精子。可供选择地，在细胞内变为裂解的例如形成带电物质的有色指示剂可以被用于标记细胞。在本实施方案中，将上述光学系统进行改造以检测来自细胞的吸收或光散射而不是荧光。例如，这可以通过将光学元件中的第二光检测器(检测器70)直接放在上述收集容池下面而实现，从而使精子在容池内的积聚引起光检测器处的光信号减弱。
图5A-5C中示出了可允许对精子运动性和活性精子密度进行定量的精子运动性动力学。上述图显示了微流控结构30的微通道部分，包括供给凹口50的下游端、微通道段48a、收集容池60和微通道段48b。当预处理的精液样本首次进入该装置中时，在时间t＝0处，样本中的标记精子细胞很快通过样本接收站内含有的流体分配。即微通道段48a事实上不含有任何标记细胞，如图5A所示。随着时间的过去，例如，在时间t＝t1处，活动的正向运动精子细胞找到了进入通道段48a的途径，并开始以与细胞的平均运动性有关的迁移率向容池60迁移。当活动的正向迁移细胞完成通过通道段48a的旅程时，它们开始在容池60内积聚，导致在容池内测定的荧光信号增加。
如在容池内随时间而进行的荧光检测所表明的上述细胞迁移过程绘制在图6中。在时间t＝0处，测定的荧光处于很低的背景水平并持续到时间t1，此时标记的细胞首次开始到达容池。由于越来越多的标记细胞开始积聚在容池内，测定的荧光总量开始上升，该图显示出经过时间t1后随时间的过去而线性上升，具有荧光/特定的时间段变化的斜率。通过将该斜率后推至零斜率时间(t1)，可以测定精子细胞通过通道段48b迁移所需的时间t1。
所述装置的电子组件包括微处理器并采用小型电池供电。检测器的信号用AD转换器或比较器进行数字化，然后存储在微处理器的RAM中。接着，微处理器根据下述逻辑计算密度和运动性。如果给定了下面将要描述的所需输出和逻辑运行，该微处理器的设计和结构对本领域技术人员而言是显而易见的。
图7的流程图显示了在执行这些分析测定时由装置微处理器所执行的步骤。如在框110中，当首次将样本加入到装置中时发送信号至微处理器，例如通过样本流体而关闭两个电极之间的导电通道，如在112处所示，将时钟的时间设定为0。也可以通过开关或通过将传感器连接到覆盖样本井的金属薄片或塞结构而进行手动激活。当移开防护罩时样本被激活。同时打开LED66，微处理器开始接收来自检测器68和70的与时间相关的荧光发射信号。
光学检测连续进行一预设的时间t2，该时间足够长以纪录在容池60内所增加荧光的可靠图形。当到达该时间时，通过逻辑116，处理器采用标准曲线分析算法来分析荧光曲线以测定与时间相关的荧光曲线的斜率，如118所示。从该曲线中，在120处测定斜率与水平基线相交处的“零截距”，并根据该“零截距”分别在122、124处测定活性精子迁移通过通道段48a(t1-t0)的平均移动时间和活动精子的平均速度。即，根据已知的平均迁移时间和通道段48a的已知长度可以计算通道内正向移动的细胞中活动细胞的迁移率(速度＝距离/时间t1)。在126处将所计算的速度或精子运动性的定性指示显示给使用者。
为测定活动精子的密度，在128处，将在118和120处测定的时间相关曲线的斜率与多个已知斜率中的每一个进行对比，以上每一个都代表在相同条件下用不同的已知精液样本进行的时间相关荧光测定并存储在130中。尽管图中未示出，样本的荧光曲线的斜率被调整到标准化的激发强度以补偿实际的LED激发强度的变化，如在装置中检测器68所测定的，从而使样本曲线和所有的模拟曲线都基于一个标准化的激发值。曲线拟合和匹配的适当方法为本领域公知的。在132处，一旦进行最佳的曲线拟合，根据最佳的拟合曲线来估计样本中活动精子的密度，并在126处显示给使用者。
在下面的D部分中，参照本发明所有的三个一般实施方案，对所有三个概括实施方案中的装置的运行进行描述。
D.基于沿微通道的精子检测的装置该部分描述了根据本发明第二实施方案构造的装置组件，其中，用沿微流控通道的间隔位置设置的一对光学检测器测定精子运动性和密度特性。图1具体地示出了该装置，该图显示了本发明所有的三个实施方案共有的外壳特征，图4示出了精子细胞的荧光标记图，图8A-8C示出了该实施方案的微流控通道和光学传感组件，图9显示了由该装置所执行的电控算法的流程图，图12示出了为所有三个实施方案所共有的两种例示性输出显示器。
图8A和8B示出了第二实施方案的装置中微流控结构140的一部分。这里显示出一个样本接收容池142和微通道的一部分，该部分的上游端与容池142进行流体连通。微通道的另一端与末端容池相通，该末端容池用于防止已计数的精子细胞从检测通道返回。可采用几种形状以产生一个不限制功能的末端容池，用于收集已通过检测通道的精子细胞。
结构140可采用类似于B部分中所述的方法制造。在该结构中，微通道具有的宽度和深度尺寸类似于以上描述的，以确保精子在通道中从上游到下游运动。通道的长度优选2-5cm。
沿微通道的间隔位置设有两个光学检测系统146、148，每个都包括LED光源，分别如LED152和154，以及光检测器，分别如光检测器150和156。LED和光检测器都类似于以上为装置20所描述的那些，并可操作地连接到微处理器(未示出)，用于(i)当启动分析过程时激活LED的微处理器，以及(ii)接收并处理光检测器信号，以产生预期的精子运动性和精子密度信息。光源和检测器可以并入相同的整体部分。如以下将要看到的，来自单个检测器的信号被用于计数经过通道的精子。两个光源-检测器对沿微流控通道设置(在显示的实施方案中)以追踪个体精子经过固定距离的时间。
如上所述制备图中所示的样本。样本制备或预处理可以包括细胞荧光标记和细胞在均透溶液中的悬浮。如上所述，将预处理的样本引入装置中，在初始时间t＝0时精子开始运动进入微通道。图8A和8B显示了在两个密切相关的时间t1和t1+d时精子在微通道内的位置，在这段时间，精子如精子158a从一个检测器区迁移到另一个检测器区。
图8C显示了细胞s1、s2和s3迁移通过通道144时的荧光信号迹线，并于时间t1和t2时在两个检测区进行测定，分别相应于图8A和8B所示的细胞位置。运行时，装置处理器计算在每个检测器测定的每个峰，并将该峰指定为连续的新细胞数N。因此，例如，如果将检测器150检测的细胞158a指定为细胞数N，由检测器156检测的该同一细胞应当指定为同一数目。然后，通过对比相应的同一数目的细胞之间的时间间隔，装置可以测定检测器之间的每个精子“N”的迁移时间。这些在图8C中作了阐述，该图的下框即在166处显示出分别在上游和下游检测器检测到的相应峰164和164′的荧光信号峰。
由于微通道的宽度有限，精子通过微通道的迁移可以仅为单列的，或者同时为单列和并排的。当在相同时间内有多于一个细胞通过检测区时，根据荧光峰更宽和/或更高，其将被纪录为一个多细胞过程。在那里，微通道的宽度/深度将容纳至少一个并排方式的精子细胞，微处理器可具有常规的信号分析能力，用于(i)根据峰高/宽度测定对峰有贡献的细胞数，和(ii)相应于测定的精子细胞数来指定峰细胞计数(例如，N+1、N+2)。
图9的流程图显示了装置中微处理器的运行过程，用于测定平均精子运动性和活性精子密度。首先，如160、162所示，来自每个检测器的原始检测器信号分别通过170和172处的数字转换器和鉴别器，以便测定信号幅度与精子通道相符合的时间(过程)。为每个检测器存储这些时间。例如，如分别在176和178处显示的，将第n个精子通过第一和第二检测器的时间分别表示为Tn1、Tn2。如上所述，在多个细胞通过检测区的任何时间，较大的峰高和/或宽度被纪录为适当的细胞数。
在测定期间，将通过每个检测器的所有精子的连续计数(N)在174处进行保存，微通道内计数/时间的总数提供了样本中活性精子密度的基础。如上所述，可以通过将在样本中检测的实际细胞/时间和为多个密度已知样本中的每一个所测定的多个标准细胞/时间数中的每一个进行对比，来测定实际的活性精子密度。
然后，如在180处所示，通过测定特定精子到达两个检测器的时间差并用两检测器之间的距离去除该数值来计算个体的精子速度。将许多个体精子的速度进行平均以计算平均精子速度(Vn)。如在184处所示，精子密度作为N、Vn和校准因子的结果来进行评价。可以通过单独测量精子密度，然后用N和Vn去除该密度来测定校准因子。在图12A和12B中显示了该装置的两种例示性显示器，如以上为装置12所描述的。
尽管本实施方案具有一对间隔设置的检测器，用于在两个独立的时间点检测精子位置，应当理解可以轻易地改造该装置以便通过单个的LED和检测器对来测定精子速度，其中，速度作为峰宽的函数进行测定。
E.根据阻抗测定的精子检测装置该部分描述了根据本发明第三实施方案构造的装置组件，其中，当精子迁移经过通道时，通过横过微通道或微通道内的阻抗变化来测定精子运动性和密度特性。图1具体地示出了该装置，该图显示了为本发明所有的三个实施方案共有的外壳特征，图10示出了该装置中的通道和电极构型，图11A和11B以简化的形式示出了系统中的电路组件和在分析过程中获得的典型电阻曲线，并且图12示出了为所有三个实施方案共有的两种例示性输出显示器。
图10示出了第三实施方案装置中微流控结构186的一部分。这里显示了样本接收容池188、收集容池192和在其间延伸的微通道段190。结构186可以基本上具有与在C部分所描述的结构30相同的结构，且制造方法相同。
分别位于容池188、192内的一对电极194、196形成电路部分，该电路包括电子激发单元198和位于微流控结构内两个电极之间的流体通道。
如图11A所示，两个电极组成装置的电路部分200，其包括AC电流源204，用于将选定频率的AC电压置于电极间，例如，选定的频率为约0-1MHz，和电压表202，用于测量电路中任何特定频率的电压。对于特定的频率，用Z(f)＝(V(f)/I(f))测定电极的电阻。在特定的频率，电阻的实部对收集容池中精子的积聚作出响应。在某些状态下，实Z(f)将具有类似于图11B所示的时间曲线，其中，从初始时间t＝0到精子首次开始从微通道进入收集容池的时间t1，测定的阻抗基本上保持恒定的基线水平，并且当精子在容池内积聚时，具有某种测定斜率的阻抗曲线增加。可以通过有用的频率范围来周期性地扫描容池的阻抗，产生更多信息以提高测定的可靠性。注意，阻抗也可以通过采用电压源和电流表进行测定。
将意识到，阻抗曲线显示出与图6中的荧光曲线相同的行为，并由装置中的微处理器以基本相同的方式进行处理，以得出平均精子运动性和活性精子密度。特别是，微处理器含有一套用于具有已知密度的精液样本的阻抗曲线，以供曲线匹配，来测定最佳的拟合密度值。在图12A和12B中显示了该装置的两种例示性显示器，如以上为装置12描述的。
F.装置的运行该部分描述了根据本发明方法的装置在执行精液样本分析时的运行过程，以测定样本的精子数和运动性。
在典型的样本分析方法中1.在样本收集瓶中收集射精总量，并将该体积与为男性生育能力制定的WHO标准进行比较。
2.将量筒或具有较小体积或稀释体积的独立容池或混合有其它化学药品、化合物或溶剂的精液放入装置的样本接收井中。当样本固定器的插件向下吸入井中时位置被锁定，启动装置的电子元件，并用削尖的进口穿破样本固定器底部，使装置内部的流体通道进入精液样本。精液样本流入干燥的装载容池或立即开始与预填充的流体通道接触。可供选择地，可以在微通道被打开后将处理过的样本倒入样本收集井。在描述的前两个实施方案中，样本预处理包括用荧光指示剂标记样本精子。在第三实施方案中，不需要标记样本。
3.如果预填充的流体通道与干燥的装载室分开，随着液体样本进入容池而启动蛋白酶活性对膜状塞的溶解。可供选择地，移开封口以将样本暴露于微流控通道中的流体内。可供选择地，刺破样本管以便将微流控通道暴露于样本流体中。
4.上述任何使样本与微流控通道接触的过程触发装置中的计时装置，其将定时器设为t＝0，显示出精子首次可以开始进入并在装置的微通道中迁移的时间。
5.纪录精子迁移进入装置中的微通道并通过该微通道，这是通过(i)在第一实施方案中，测定收集容池中的荧光发射，(ii)在第二实施方案中，测定沿微通道的个体标记精子的迁移过程的速度和密度，以及(iii)在第三实施方案中，测定微通道的阻抗变化。
6.采用微处理器计算WHO标准，图7、9和11显示了对于三个
7.或者以如图12A所示的简单定性方式或者以如图12B显示的定量方式将结果显示给使用者。在两个图中，显示窗相应于图1所示装置的显示窗28。根据测定的精子运动性和活性精子密度，采用具有已知精子运动性和密度值的标准查寻表，将样本精子分为两种类别中的一种，图12A中的显示指示器要么持续等到分析结束或者在分析结束时向使用者提供“可能生育”或“可能不育”的指征。
在图12B更加详细的显示中给出了相对于正常水平的活动精子的实际百分率，以及相对于正常水平的实际精子正向运动速度。
尽管为了理解清楚而通过附图和实施方案对本发明进行了详细描述，对本领域技术人员显而易见的是在不偏离附属的权利要求书的主题和范围的前提下，可以根据本发明的教导对其进行某些改变和改造。特别是将要意识到，作为三个已公开的概括实施方案的不同特定实施方案，其它与权利要求一致的实施方案是预期的。
例如，可能希望从相同的精液样本有多个独立的流体填充检测线。两个或多个流体填充通道可以源自于相同干燥容池的多种形状。这种类型的独立测定可允许任意高精度的精子细胞计数和运动性能，这是由于每次独立测定都对全部测定的准确度作出了贡献。
作为另一种实例，作为对第二实施方案的改进，可以采用各种电子或电磁检测系统以检测个体精子沿微通道的经过情况，例如，根据含有精子细胞的通道部分内的电容变化，或根据由金属标记的精子所产生的磁效应。
权利要求
1.一种用于分析精液样本中正向精子运动性和活性精子密度的方法，包括(A)将样本放入样品容池中，(B)使样本中的精子从样品容池迁移入微通道并沿该微通道移动，所述微通道将精子限定为在通道内向下游的收集区单向运动，以及(C)测量精子经过所述微通道的迁移率和流量。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述微通道的宽度和深度尺寸均为10到100μm。
3.根据权利要求2的方法，其中，所述微通道的长度已知，所述下游收集区包括具有已知体积的收集容池，并且步骤(C)包括(C1)测量收集容池中存在的细胞的浓度变化，作为时间的函数，(C2)根据步骤(C1)以及所述收集容池的体积来测定所述样本中的活性精子密度，作为时间的函数，以及(C3)根据步骤(C1)测定精子通过下游方向的所述微通道的平均迁移率。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤(C1)包括产生一个时间相关函数，其斜率近似于单位时间内收集容池中存在的细胞数的变化，并且其截距近似于在所述收集容池中首次出现精子的时间，步骤(C2)包括将所述函数与一个或多个标准函数进行对比，所述标准函数用具有不同的已知精子数和正向前进速率的精液样本产生，并且步骤(C3)包括从所述截距确定所述正向精子的平均迁移率。
5.根据权利要求3的方法，其还包括用荧光指示剂标记所述样本，并且步骤(C1)包括测量收集容池中的荧光发射。
6.根据权利要求5的方法，其中，所述标记包括将精子暴露于具有可裂解酯基的荧光指示剂，该酯基可促进指示剂吸入不带电状态的精子，并抑制指示剂从带电的酯裂解状态的精子流出。
7.根据权利要求3的方法，其中，步骤(C1)包括测量收集容池中的细胞相关吸收或光散射。
8.根据权利要求1的方法，其中，所述微通道的宽度使得精子沿所述微通道的运动被限制为单列运动，并且步骤(C)包括(C1)当精子从上游到下游方向迁移经过微通道内的检测区时检测个体精子，(C2)对迁移经过检测区的精子数目进行计数，以及(C3)确定通过所述检测区的个体精子的迁移率。
9.根据权利要求8的方法，其中，所述微通道的宽度为约15到40μm。
10.根据权利要求8的方法，其中，所述检测区由一对相邻的轴向隔开的检测器限定，并且步骤(C)还包括对从每个检测器接收的信号进行关联以提高每个检测过程的信噪比。
11.根据权利要求8的方法，其中，所述检测区由一对相邻的轴向间隔的检测器限定，并且步骤(C3)还包括利用从所述各检测器接收的信号之间的时间间隔来测定精子在微通道内的迁移率。
12.根据权利要求8的方法，其还包括用荧光指示剂标记所述样本，并且步骤(C1)包括测量精子迁移经过检测区的荧光。
13.根据权利要求12的方法，其中，所述标记包括将精子暴露于具有可裂解酯基的荧光指示剂，该酯基可允许指示剂吸入基本不带电状态的精子，但抑制指示剂从带电的酯裂解状态的精子流出。
14.根据权利要求8的方法，其中，步骤(C1)包括测量收集容池中的细胞相关吸收或光散射。
15.根据权利要求8的方法，其还包括用磁性或导电金属的微粒标记所述精子，并且步骤(C1)包括测量(i)由邻近检测区设置的电路元件产生的电信号，以及(ii)由经过检测区的用磁性或导电金属的微粒标记的精子的特征信号。
16.根据权利要求15的方法，其中，步骤(C3)包括从由电路元件产生的特征信号的变化率来测定精子通过所述检测区的迁移率。
17.一种用于分析精液样本中活动精子的精子运动性和密度的装置，包括微流控结构，其具有样品容池、下游收集区和在其间延伸的微通道，所述微通道的尺寸为将通道内的样本精子限定为单向运动，从而使设置在样品容池内的精液样本中的精子进入微通道并沿所述微通道迁移进入所述收集区，用于检测在所述微通道或收集区内的标记精子的存在的检测器，以及可操作地连接到所述检测器的电子单元，用于(i)接收检测器的信号，(ii)根据所接收的检测器信号来测定精液样本中的精子运动性和密度，以及(iii)显示与精子运动性和密度相关的信息。
18.根据权利要求17的装置，其中，所述微通道的宽度和深度尺寸均为10到100μm。
19.根据权利要求17的装置，其中所述微通道具有已知长度，所述下游收集区包括具有已知体积的收集容池，并且电子单元，其运行用以(1)测定收集容池中存在的细胞的浓度变化，作为时间的函数，(2)根据步骤(1)以及收集容池的体积来测定所述样本中的活性精子密度，作为时间的函数，以及(3)根据步骤(1)来确定精子在所述微通道内向下游方向的平均迁移率。
20.根据权利要求19的装置，其中，所述电子单元运行用以执行步骤(1)以产生一个时间相关函数，其斜率近似于单位时间内存在于收集容池中的细胞数的变化，且其截距近似于首次在所述收集容池中出现精子的时间，执行步骤(2)以便将所述函数与一个或多个标准函数进行对比，所述标准函数用具有不同的已知精子数和正向前进速率的精液样本产生，以及执行步骤(3)以从所述截距测定正向精子的平均迁移率。
21.根据权利要求19的装置，其中，所述检测器包括LED、第一和第二光检测器，以及光学元件，该光学元件设计用以(1)将来自LED的光导入第一光检测器，(2)使来自LED的光通过收集容池，以及(3)捕获从收集容池发射的荧光并导入第二光检测器。
22.根据权利要求21的装置，其中，所述光学元件是由具有不同折射率的多个光学元件组成的整体式元件。
23.根据权利要求17的装置，其中，所述检测器布置成邻近所述微通道内的检测区，并且所述电子单元运行用以(1)当精子在从上游到下游方向迁移通过微通道内的所述区域时检测个体精子，(2)对迁移经过检测区的精子数目进行计数，以及(3)测定通过所述检测区的个体精子的迁移率。
24.根据权利要求23的装置，其中，所述微通道的宽度为约15到40μm。
25.根据权利要求23的装置，其中，所述检测区由一对相邻的轴向隔开的检测器限定，并且所述电子单元运行用以执行步骤(1)以便将从每个检测器接收的检测信号进行关联以提高每个检测过程的信噪比。
26.根据权利要求23的装置，其中，所述检测区由一对相邻的轴向间隔的检测器限定，并且所述电子单元运行，在执行步骤(3)时，利用从所述各检测器接收的信号之间的时间间隔来确定微通道内的精子迁移率。
27.根据权利要求23的装置，其中，所述检测器包括荧光激发光源和荧光发射检测器。
28.根据权利要求23的装置，其中，所述检测器包括邻近检测区设置的电路元件，所述电路元件对附近的磁性或金属导体微粒的运动进行响应，从而使用磁性或金属导体微粒标记的精子在微通道内通过所述检测区的运动将改变所述元件的感应系数，并且所述电子单元包括可操作地连接到所述元件的检测器电路，用于检测所述元件的感应系数的变化。
29.根据权利要求28的装置，其中，所述电子单元运行，在执行步骤(3)时，从由电路元件产生的特征信号的变化率来确定精子通过所述检测区的迁移率。
30.根据权利要求23的装置，其中，所述电子单元运行，在执行步骤(2)时，对在已知的时间段内通过检测区的精子数目进行计数，并在标准曲线上找出可比较的精子数/时间值，所述标准曲线用具有不同的已知精子数的精液样本产生。
31.根据权利要求17的装置，其中，所述样本接收容池通过可降解的隔液插头与所述微通道的上游端连通，并且所述容池含有能降解所述插头的酶。
32.根据权利要求15的装置，其形成为机内单元，具有可为控制单元和检测器供电的自有电源。
全文摘要
本发明公开了用于分析精液样本中正向精子运动性和活性精子密度的方法和装置。所述装置包括微流控结构，其具有样品容池、下游收集区和在其间延伸的微通道。所述微通道的尺寸设置成将通道内的样本精子限定为单向运动，从而使设置在样品容池内的精液样本中的精子进入微通道并沿微通道迁移并进入收集区。还包括用于检测在微通道内或收集区是否存在标记精子的检测器，以及可操作地连接到所述检测器的电子单元，用于(i)接收检测器信号，(ii)根据所接收的检测器信号来确定精液样本中的精子运动性和密度，以及(iii)显示与精子运动性和密度有关的信息。
文档编号G01P13/00GK1745292SQ200380109355
公开日2006年3月8日申请日期2003年12月9日优先权日2002年12月9日
发明者A·M·阿拉瓦尼斯, J·L·派尔申请人:先进流体实验室股份有限公司

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男性生育能力分析方法和装置的制作方法