专利名称：一种筛选蛋白酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种筛选蛋白酶抑制剂的方法。
背景技术：
癌症是严重影响人类生活质量和生存的重大疾病之一，对于癌细胞浸润、转移至其他组织与器官，人类尚无可行方法加以阻止。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMP)是参与癌症转移的主要酶之一，可降解癌细胞周围的组织，使癌细胞扩散至较大范围或进入血液循环转移至其他器官。抑制基质金属蛋白酶的活性可有效地控制癌细胞的转移，所以从已知或新合成的化合物中筛选出能抑制基质金属蛋白酶活性的抑制剂是当前抗癌药物研究的热点，为此必须建立有效、可行、经济的基质金属蛋白酶抑制剂评估体系。
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目前高通量筛选体系主要有荧光法和分光光度法。前者利用两个荧光基团的FRET(荧光共振能量转移)变化来获得抑制剂能力大�。浞从Φ孜锸侨斯ず铣傻碾钠危⒃诟玫孜锪蕉肆由狭礁鲇馊玖希彼玫孜锿暾保捎诘谝桓鲇馊玖媳患し⑹彼⒊龅挠饽芰勘槐攘诘牡诙鲇馊玖纤眨佣沟谝桓鲇饣诺挠獯忝�。当有基质金属蛋白酶存在时，底物被降解，使得两个荧光基团分离，恢复第一个荧光基团的荧光。因而荧光的变化反应了基质金属蛋白酶活力的大小有抑制剂时，荧光变化缓慢；无抑制剂时，变化迅速。从而根据荧光变化获得抑制剂的半数抑制浓度。分光光度法也是利用人工合成的含有巯基的肽片段(寡肽)作为底物，当基质金属蛋白酶水解该底物后，释放出带有巯基的片段。利用巯基的Ellman' s Reagent反应形成黄色化合物,黄色的深浅反应了基质金属蛋白酶被抑制的程度。虽然荧光法(或分光光度法)已用于基质金属蛋白酶抑制剂的筛�。哂薪细叩牧槊粜院痛笸可秆。杂心承┤钡�1)由于过灵敏，人工假相常见于实验中，要设计合理的对照组；2)若抑制剂有荧光或能淬灭荧光，不能使用；3)需要人工合成底物，较高的花费；4)需要特殊的仪器；5)荧光较易被其他杂质或反应缓冲液组分所淬灭或增强，造成假象。茚三酮(ninhydrin)是一个有机化合物，在生命科学研究、生物工程、食品工业及犯罪现场指纹分析中广泛使用，它与氨基酸可形成紫色化合物而用于氨基酸含量测定。氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫(Ruhemann’s purple)。此化合物最大吸收峰在570nm波长处。同时，茚三酮亦用于蛋白含量测定，但均为将蛋白完全水解成氨基酸(24小时消化水解)，再与茚三酮反应，前期反应费时费力，增大了反应的成本，不利于大通量的蛋白与茚三酮反应。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种筛选蛋白酶抑制剂的方法。
本发明利用蛋白酶水解其底物一蛋白质时所形成的氨基酸或肽片段与茚三酮反应，生成紫色化合物进行比色(见图广4)，以吸光度值(OD)代表颜色的深浅，进而反映蛋白酶水解时被抑制的程度，从而获得抑制剂的半数抑制浓度(IC5tl或LD5(i)。本发明提供的一种蛋白酶抑制剂筛选方法，包括步骤(I)将待测物添加到蛋白 酶溶液中混匀，反应；同时设未添加待测物的蛋白酶溶液为空白对照；(2)含待测物的蛋白酶溶液和空白对照中分别加入底物蛋白溶液进行反应，得到反应液；(3)反应液中加入反应终止液；(4)再加入茚三酮反应液进行反应；(5)加入双蒸水，根据吸光度值OD57tlnm判断结果，若含待测物溶液的吸光度低于空白对照，则待测样品为阳性。所述蛋白酶为水解蛋白酶。优选地,所述蛋白酶为基质金属蛋白酶或胰酶。其中，步骤(I)将待测物添加到蛋白酶溶液中混匀平衡时间> 5min。其中，步骤(I)中蛋白酶溶液制备方法为将浓度为lmg/ml的蛋白酶水溶液与反应缓冲溶液按体积比为1:16 30混合得到蛋白酶溶液；步骤(2)中底物蛋白溶液制备方法为15-30mg/ml的底物蛋白水溶液与反应缓冲溶液按体积比为1: 5 10混合得到底物蛋白溶液。进一步地，在本发明方法中，当选用的反应缓冲液为50mM Tris-HCl，10(T250mMNaCl，I 5mM CaCl2,1 μ M ZnCl2, ρΗ=7. 5 时，反应终止液为 25 IOOmM 的 EDTA-Tris-HCl 缓冲液，含12% 20%聚乙二醇；当选用的反应缓冲液为50mM Tris-HCl，100 250禮 NaCl，l 5mM CaCl2,1 μ MZnCl2, ρΗ=7. 5，含有3% 6%聚乙二醇时，反应终止液为25 IOOmM的EDTA-Tris-HCl缓冲液。所述聚乙二醇为聚乙二醇分子量400 8000。优选地，所述的聚乙二醇为聚乙二醇6000。本发明方法中，步骤(I)中待测物加入蛋白酶溶液的终浓度为O. Γ300μΜο其中，步骤(2)蛋白酶溶液与底物蛋白溶液按体积比1:2 4进行混合。其中，步骤(3)中反应终止液按体积比O. 25^1:1加到反应液中。优选地，步骤(3)中反应液与终止液是在冰上混合。本发明方法中，步骤(4)所述的茚三酮反应溶液由溶液A和溶液B等体积混合得到，所述溶液A为氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含O. Γθ. 3Μ柠檬酸，7 IOmM氯化亚锡，用氢氧化钠调pH值为5. O ；所述溶液B为茚三酮-二甲基亚砜(DMSO)溶液、茚三酮-乙二醇溶液或茚三酮-N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液，其为将茚三酮溶解于DMSO或乙二醇或DMF中，使茚三酮终浓度为4(T70g/L。优选地，茚三酮终浓度为50g/L。其中，步骤(4)中茚三酮反应液按体积比5 8:1加到步骤(3)的混合溶液中。
其中，步骤(4)反应条件为80-100°C，10-15min，ρΗ=5· O。优选地，步骤(4)反应条件为80°C，lOmin，ρΗ=5· O。其中，步骤(5)双蒸水按体积比1:1. 2加入到步骤(4)的混合溶液中。本发明提供了上述筛选蛋白酶抑制剂的方法在制备抑制肿瘤侵袭、转移的药物中的应用。本发明提供了一种筛选的试剂盒，含有茚三酮反应溶液，所述的茚三酮反应溶液由溶液A和溶液B等体积混合得到；所述溶液A为氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含O. Γθ. 3Μ柠檬酸，7 IOmM氯化亚锡，用氢氧化钠调pH值为5. O ； 所述溶液B为茚三酮-二甲基亚砜溶液、茚三酮-乙二醇溶液或茚三酮-N，N- 二甲基甲酰胺溶液，其为将茚三酮溶解于二甲基亚砜溶液或乙二醇溶液或N，N-二甲基甲酰胺溶液中，使茚三酮终浓度为4(T70g/L。优选地，上述溶液B中，茚三酮终浓度为50g/L。本发明提供了一种筛选蛋白酶抑制剂的试剂盒，含有上述的茚三酮反应溶液、反应缓冲液、反应终止液；所述反应缓冲液为50mM Tris-HCl，100 250mM NaCl，l 5mM CaCl2,1 μ M ZnCl2,ρΗ=7· 5，含有3% 6%聚乙二醇；反应终止液为25-100mM的EDTA-Tris-HCl缓冲液。本发明提供了另一种筛选蛋白酶抑制剂的试剂盒，其含有上述的茚三酮反应溶液、反应缓冲液、反应终止液；所述反应缓冲液为50mM Tris-HCl，100 250mM NaCl，l 5mM CaCl2,1 μ M ZnCl2,pH=7. 5 ；所述反应终止液为25 IOOmM的EDTA-Tris-HCl缓冲液，含有12% 20%聚乙二醇。本发明所述的聚乙二醇可以为聚乙二醇400 8000。本发明通过优化缓冲体系、pH、温度、反应试剂制备条件及颜色稳定剂等诸多方面，选择最佳温度(80°C)、pH (5. O)及加入颜色稳定剂(聚乙二醇，聚合分子量从400-8000)等条件，使茚三酮与氨基酸或肽片段的呈色反应更加稳定，大大提高了实验的重复性，使得该方法能用于蛋白酶抑制剂尤其是基质金属蛋白酶抑制剂的筛选。另外，本发明方法中，蛋白酶与蛋白质的水解产物无需用高浓度酸(HC1、H2S04等)或碱(NaOH、Ba (OH)2)分解成氨基酸(传统上，均需将蛋白、肽完全水解成氨基酸)，再通过茚三酮反应进行测定，有效地减少了操作步骤，节省时间。在筛选蛋白酶抑制剂时，反应产物与未反应的蛋白，不用三氯乙酸或高氯酸进行沉淀分离(通常需用这些酸沉淀蛋白，离心，上清再用碱中和)，可直接与茚三酮反应，获得相对产物的量，同样减少了操作步骤，缩短操作时间，提高了功效比。本发明方法具有的优点如下(1)呈色稳定，灵敏度高，没有过灵敏导致的人工假象；(2)缓冲液组成对呈色反应影响小(除含有氨基或铵盐的缓冲体系外)；(3)不用人工合成的底物，用蛋白酶的天然底物——蛋白质为底物，无需化学修饰，更符合生物反应的真实情况；(4)由于不用昂贵的人工合成底物，成本低廉，单一样品费用仅为当前商品化试剂盒的1/10 ;(5)无需特殊设备，仅用实验室常用的分光光度计或酶标仪，简易可行；(6)本发明测定单一样品仅需30分钟，与当前试剂盒测定所用时间I小时左右相比，既快速又节省时间和人力成本。
图I是却二丽反应(成色)原理图。图2是明胶被胶原酶水解所形成的产物与茚三酮反应的光谱变化。图3是无抑制剂时吸光度与水解的反应时间的关系图；570纳米的吸光度与时间呈线性关系，随着反应时间的增加，水解的产物逐渐增加，相应的吸光度亦增加，而且呈线性关系。图4是有无抑制剂(邻菲罗啉)存在时吸光度与水解的反应时间的关系。有抑制剂存在时，直线的斜率(速率)小于无抑制剂时的斜率，因而可用于抑制剂筛选。 图5是不同浓度邻菲罗啉存在时的吸光度变化光谱。随着抑制剂浓度增加(0-160 μ Μ)吸光度逐步下降。图6是邻菲罗啉对胶原酶的抑制作用(半数抑制浓度为67. I ±4. 2 μ Μ)。图7是不同浓度Z-pro-leu-gly存在时的光谱变化，随着Z-pro-leu-gly增加(0-80 μ M)吸光度逐步下降。图8是Z-pro-leu-gly对胶原酶的抑制作用(半数抑制浓度平均值为52. 4±2· 2μΜ。图9是96孔板筛选对胶原酶的抑制作用。570nm吸光度测定在酶标仪上获得。右半部分为Z-pro-leu-gly，30-80 μ Μ,左半部分为邻菲罗啉，20-120 μ Μ。图10胰酶水解明胶所形成的产物与茚三酮反应的光谱变化，水解的产物量随着时间延长呈递增趋势。图11胰酶水解明胶与时间的关系。时间增长水解的产物量亦增加，且呈线性正比关系。当有苯甲基磺酰氯(PMSF)存在时，胰酶被抑制，相应的线性斜率降低(速率下降)。图12是O. 1%甘油对胶原酶降解明胶的影响图。图13为有、无甘油时的反应速率变化图，甘油对胶原酶降解明胶无影响，吸光度没有变化。图14Bradford法测定蛋白(BSA)标准曲线，线性区间100-1500mg/ml。图15本发明的茚三酮法测定牛血清白蛋白(BSA)标准曲线，线性区间100-3200 μ g/ml。图16本发明的茚三酮法与Bradford法比较。茚三酮法蛋白测定的范围(100-3200 μ g/ml)大于 Bradford (100-1500 μ g/ml)。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂均为市售。本发明实施例中使用的试剂和仪器如下明胶，购自生工生物工程(上海)有限公司，批号1786B510,配成30mg/ml的明胶水溶液；胶原酶(collagenase IV,亦称基质金属蛋白酶-2, MMP-2),购自invitrogen公司，批号17104-019,配成lmg/ml的溶液；胰酶，配成lmg/ml的溶液；邻菲罗啉(phenanthrolin),购自郑州派尼化学试剂厂,批号2005-6-2,配成ImM的溶液；茚三酮，购自天津市德恩化学试剂有限公司，批号2011-8-27。柠檬酸，郑州派尼化学试剂厂，批号20100619。二水合氯化亚锡，国药集团化学试剂有限公司，批号F20090324。聚乙二醇，乙二醇、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)均购自郑州派尼化学试剂厂，批号20070615。光谱分析仪(日本岛津，型号UV-2450)。实施例I溶液的配制(I)I、茚三酮反应溶液溶液A :氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含O. 2M柠檬酸钠，7mM氯化亚锡，pH 5. O0溶液B :茚三酮-二甲基亚砜溶液，其为将茚三酮溶解于DMSO溶液，使茚三酮终浓度为 50. Og/L。
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将溶液A和溶液B等体积混合得到茚三酮反应溶液。2、反应缓冲液50mM Tris-HCl, 150mM NaCl,3mM CaCl2,1 μ M ZnCl2, ρΗ=7. 53、反应终止液为50mM 的 EDTA-Tris-HCl 缓冲液，含有 12% 聚乙二醇 6000。实施例2溶液的配制(2)I、茚三酮反应溶液溶液A :氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含O. IM柠檬酸钠，8mM氯化亚锡，pH 5.0。溶液B :却三酮-DMF溶液，其为将茚三酮溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，使茚三酮终浓度为40. Og/L。将溶液A和溶液B等体积混合得到茚三酮反应溶液。2、反应缓冲液50mM Tris-HCl, IOOmM NaCl, ImM CaCl2,1 μ M ZnCl2, ρΗ=7. 53、反应终止液25mM 的 EDTA-Tris-HCl 缓冲液，含有 18% 聚乙二醇 4000。实施例3溶液的配制(3)I、茚三酮反应溶液溶液A :氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含0. 2M柠檬酸钠，8mM氯化亚锡，pH 5. O。溶液B :茚三酮-乙二醇溶液，其为将茚三酮溶解于乙二醇溶液，使茚三酮终浓度为 60. 0g/L。将溶液A和溶液B等体积混合得到茚三酮反应溶液。2、反应缓冲液50mM Tris-HCl, 250mM NaCl,5mM CaCl2,1 μΜ ZnCl2, pH=7. 5,含有3%聚乙二醇6OOO3、反应终止液为IOOmM的EDTA-Tris-HCl缓冲液。实施例4溶液的配制(4)I、却三酮反应溶液
溶液A:氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含O. 3M柠檬酸钠，IOmM氯化亚锡，pH 5.0。溶液B :茚三酮-二甲基亚砜溶液，其为将茚三酮溶解于DMSO溶液，使茚三酮终浓度为 70. Og/L。将溶液A和溶液B等体积混合得到茚三酮反应溶液。2、反应缓冲液50mM Tris-HCl, 200mM NaCl,2. 5mM CaCl2,1 μΜ ZnCl2, ρΗ=7· 5，含有 6% 聚乙二醇2000。3、反应终止液为75mM的EDTA-Tris_HCl缓冲液。实施例5胶原酶抑制剂的筛选方法(I) 茚三酮反应溶液、反应缓冲液和反应终止液取实施例I中的溶液组合。空白对照组(1)取30mg/ml的明胶水溶液22 μ 1，放置于I. 5毫升Ependoff 管中，再加321 μ I反应缓冲液，混匀。(2)将7μ I的胶原酶(lmg/ml)溶液加入到上述明胶溶液中，37°C反应。在 0min、2min、4min、6min、8min、IOmin 后分别抽取 50 μ I 反应液与 50 μ I反应终止液在冰上混合,终止反应。阴性对照组取22 μ I明胶(30mg/ml)分别放置于Ependoff管中，加入200 μ I反应缓冲液，混匀；另取一系列Ependoff管，加入7μ I胶原酶(lmg/ml )，117. 5 μ I反应缓冲液，以及3. 5 μ I甘油，混匀。然后与明胶溶液混合，终浓度为1% (总体积为350 μ 1)，在0min、2min、4min、6min、8min、IOmin后分别抽取50 μ I反应液与50 μ I反应终止液在冰上混合，终止反应。(见图12)。实验组(加邻菲罗啉(phenanthrolin)):分别取22 μ I明胶水溶液(30mg/ml)放置于不同Ependoff管中，并加入120 μ I反应缓冲液,混匀；另取一些Ependoff管,管中分别加入7 μ I胶原酶(lmg/ml )，和按表I所示的体积量加入反应缓冲液以及不同体积的邻菲罗啉(ImM)到胶原酶溶液中，混匀。然后与明胶溶液混合，使其终浓度(总体积为350 μ I)分别为 10 μ Μ、20 μ Μ、40 μ Μ、60 μ Μ、80 μ Μ、100 μ Μ、120 μ Μ、140 μ Μ、160 μ Μ，不同浓度邻菲罗啉的反应体系装入不同的样品管中。各浓度的邻菲罗啉试验组在0min、2min、4min、6min、8min、IOmin后分别抽取50 μ I反应液与50 μ I反应终止液在冰上混合，终止反应。表I配制不同浓度邻菲罗啉缓冲液
加入 ImM 祁莽 f 嚇 ( μ|Ι 3.5 7i) H 21 28 35 42 49 56
細入坟 f.v 1 冲液的 f- I μ ) 197.5 194 187 180 173 166 15C) 152 145
邻 ff 啉终浓 ΙξΙμΜ)10 20 40 60 SO 100 120 140 160反应终止后，每个样品管中加入500 μ I却三酮反应液，涡旋混匀，放入80°C水浴箱中反应IOmin ;然后每个样品管加入500 μ I双蒸水，混匀后进行光谱扫描(400 700nm)，获得在570nm的吸光度值。结果分析如下在相同的时间间隔，加邻菲罗啉的吸光度变化值(10分钟减去O分钟的吸光度(或2分钟))除以未加邻菲罗啉时(空白对照组)的吸光度变化值，获得在该浓度时的抑制率，从而得到不同浓度邻菲罗啉的抑制率，最后以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图。半数抑制剂浓度(IC5tl)经数学拟核回归得到。见图5和图6。图5显示，明胶被胶原酶水解可被邻菲罗啉抑制，随着邻菲罗啉的浓度增加，吸光度逐步下降。图6是经数学处理，抑制程度对邻菲罗啉浓度作图，进而获得半数抑制浓度(IC5tl)。本实验结果显示胶原酶分解明胶产生的氨基酸产物可利用本发明优化的茚三酮反应进行检测，在本发明的筛选体系中加入对基质金属蛋白酶具有抑制作用的邻菲罗啉后，其570nm的吸光度低于空白对照组和阴性对照组，证实了邻菲罗啉的蛋白酶抑制剂的效果，结果可靠，重复性高；进一步通过不同浓度邻菲罗啉对吸光度的影响，经数学拟核回归计算得到邻菲罗啉对胶原酶的半数抑制浓度，其IC5tl = 67. I μ M0实施例6胶原酶抑制剂的筛选方法(2)茚三酮反应溶液、反应缓冲液和反应终止液取实施例2中的溶液组合。空白对照组(I)取30mg/ml的明胶水溶液22 μ I，放置于I. 5毫升Ependoff管中，再加321 μ I反应缓冲液，混匀。(2)将7μ I的胶原酶(lmg/ml)溶液加入到上述明胶溶液中，37°C反应。在 0min、2min、4min、6min、8min、IOmin 后分别抽取 50 μ I 反应液与 50 μ I反应终止液在冰上混合,终止反应。阴性对照组取22 μ I明胶(30mg/ml)分别放置于Ependoff管中，加入200 μ I反应缓冲液，混匀；另取一系列Ependoff管，加入7μ I胶原酶(lmg/ml )，和117. 5μ I反应缓冲液，以及3. 5μ I乙醇，混匀。然后与明胶溶液混合，总体积为350μ 1，在0min、2min、4min、6min、8min、IOmin后分别抽取50 μ I反应液与50 μ I反应终止液在冰上混合，终止反应。实验组加Z-Pro-Leu-Gly (购自美国Sigma公司):取22 μ I明胶(30mg/ml)放置于不同Ependoff管中，并加入120 μ I反应缓冲液，混匀；另取一些Ependoff管，分别加入7μ I胶原酶(lmg/ml)，和按表2所示的体积量加入反应缓冲液以及不同体积的Z-Pro-Leu-Gly (ImM)到胶原酶溶液中，混匀。然后与明胶溶液混合，使其终浓度(总体积为 350 μ I)分别为 10μΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ、50μΜ、60μΜ、70μΜ、80μΜ，不同浓度Z-Pro-Leu-Gly的反应体系装入不同的样品管中。各浓度的Z-Pro-Leu-Gly试验组在Omin、2min、4min、6min、8min、IOmin后分别抽取50 μ I反应液与50 μ I反应终止液在冰上混合,终止反应。表-2Z-Pro-Leu_Gly抑制作用测定时体系组成
权利要求
1.一种蛋白酶抑制剂筛选方法，其特征在于，包括步骤 (I)将待测物添加到蛋白酶溶液中混匀；同时设未添加待测物的蛋白酶溶液为空白对昭. (2 )步骤(I)的含待测物的蛋白酶溶液和空白对照中分别加入底物蛋白溶液进行反应，得到反应液； (3)反应液中加入反应终止液； (4)再加入茚三酮反应液进行反应； (5)加入双蒸水，根据吸光度值OD57tlnm判断结果，若含待测物溶液的吸光度低于空白对照，则待测样品为阳性。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为基质金属蛋白酶或胰酶。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中蛋白酶溶液制备方法为将浓度为lmg/ml的蛋白酶水溶液与反应缓冲溶液按体积比为1:16 30混合得到蛋白酶溶液；步骤(2)中底物蛋白溶液的制备方法为15-30mg/ml的底物蛋白水溶液与反应缓冲溶液按体积比为1:5 10混合得到底物蛋白溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应缓冲液为含50mMTris-HCl，100 250禮 NaCl, I 5mM CaCl2,1 μ M ZnCl2, ρΗ=7. 5 ；或 50mM Tris-HCl，100 250禮 NaCl，l 5mM CaCl2,1 μ M ZnCl2, ρΗ=7· 5，含有 3% 6% 聚乙二醇。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，当蛋白酶溶液和底物蛋白溶液中含有聚乙二醇时，步骤(3)所述反应终止液为25 IOOmM的EDTA-Tris-HCl缓冲液； 当蛋白酶缓冲溶液和蛋白缓冲溶液中没有聚乙二醇时，步骤(3)所述反应终止液为25 IOOmM的EDTA-Tris-HCl缓冲液，含12% 20%聚乙二醇。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的茚三酮反应溶液由溶液A和溶液B等体积混合得到， 所述溶液A为氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含O. Γθ. 3Μ柠檬酸，7 10mM氯化亚锡，用氢氧化钠调pH值为5. O ; 所述溶液B为茚三酮-二甲基亚砜溶液、茚三酮-乙二醇溶液或茚三酮-N，N- 二甲基甲酰胺溶液，即将茚三酮溶解于二甲基亚砜或溶解于乙二醇，或溶解于N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，使茚三酮终浓度为4(T70g/L。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(4)中茚三酮反应液按体积比5 8:1加到步骤(3)的混合溶液中。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(4)反应条件为80-100°C，10-15min，ρΗ=5· O0
9.权利要求1 8任一所述的方法在制备抑制肿瘤侵袭、转移的药物中的应用。
10.一种筛选蛋白酶抑制剂的试剂盒，其特征在于，含有茚三酮反应溶液、反应缓冲液、反应终止液； 所述的茚三酮反应溶液由溶液A和溶液B等体积混合得到； 所述溶液A为氯化亚锡-柠檬酸钠溶液，含O. Γθ. 3Μ柠檬酸，7 10mM氯化亚锡，用氢氧化钠调pH值为5. O ;所述溶液B为茚三酮-二甲基亚砜溶液、茚三酮-乙二醇溶液或茚三酮-N，N- 二甲基甲酰胺溶液，其为将茚三酮溶解于二甲基亚砜溶液或乙二醇溶液或N，N-二甲基甲酰胺溶液中，使茚三酮终浓度为4(T70g/L ； 当所述反应缓冲液为 50mM Tris-HCl，100 250禮 NaCl，l 5mM CaCl2,1 μ M ZnCl2,ρΗ=7. 5 时， 所述反应终止液为25-100mM的EDTA-Tris-HCl缓冲液，含有12% 20%聚乙二醇；或当所述反应缓冲液为 50mM Tris-HCl，100 250禮 NaCl，l 5mM CaCl2,1 μ M ZnCl2,ρΗ=7. 5，含有3% 6%聚乙二醇时； 所述反应终止液为25-100mM的EDTA-Tris-HCl缓冲液。
全文摘要
本发明提供了一种筛选蛋白酶抑制剂的方法，包括以下步骤(1)将待测物添加到蛋白酶溶液中混匀；同时设未添加待测物的蛋白酶溶液为空白对照；(2)蛋白酶溶液中再加入底物蛋白溶液进行反应，得到反应液；(3)反应液中加入反应终止液；(4)再加入茚三酮反应液进行反应；(5)加入双蒸水，根据吸光度值OD570nm判断结果，若含待测物溶液的吸光度低于空白对照，则待测样品为阳性。利用该方法能够方便、快速地筛选蛋白酶抑制剂，不用人工合成底物，成本低，灵敏度高，为寻找抑制肿瘤侵袭、转移的药物提供新的途径。
文档编号G01N21/78GK102879390SQ201210416970
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者李长正, 张艳芳, 付云, 周素凤, 康丽霞, 孙芳 申请人:新乡医学院
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