专利名称：血小板检验方法和血小板检验装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用少量血液来测定血液的血小板机能的方法和检验装置，更具 体而言，涉及一种使用微芯片来检验血液的血小板机能的方法和检验装置。
背景技术：
(血小板凝集检验的现有技术中的问题)血小板的活化和凝集在动脉的血栓形成(白色血栓)和一次止血中起到关键作用。当血管受损时，血小板直接和间接地与血管内皮细胞下存在的胶原蛋白结合。在 血液缓慢流动的环境下(在低剪切应力下)，它们的结合主要是经由诸如GPVI等胶原蛋白 受体的直接结合，而在血液快速流动的环境下(在高剪切应力下)，VffF与胶原蛋白结合，并 且血小板的GPrt α受体与vWF结合，从而导致血小板与胶原蛋白的间接结合。与胶原蛋白 的直接和间接相互作用使血小板活化，并且通过这种刺激，从致密颗�：挺� -颗粒释放诸 如ADP和血清素等各种血小板活化物质。这样释放出的血小板活化因子活化各自的血小板和附近的血小板。在活化的血小 板中，纤维蛋白原受体GPnb和IIIa在结构上变为活化型，从而使血小板对于纤维蛋白原 变为高亲和型。通过二聚的纤维蛋白原，活化的血小板彼此顺次交联，从而造成血小板凝集。然而，大多数常规的血小板凝集计利用因大量血小板活化试剂的刺激引起的血小 板活化和凝集过程的方法(非专利文献1)。因此，在与生理血小板活化条件极为不同的环境下诱发血小板活化反应，并且尽 管可以测定在诸如各受体的先天机能异常等机能方面的明显差异，但是难于测定更多的生 理血小板机能。PFA-100 (血小板机能分析仪非专利文献2)是一种测定由于接触固定胶原蛋白、 剪切应力和接触血小板诱发物质的血小板总活化引起的孔堵塞的系统。与使用单独的血小 板活化诱发物质的刺激引起的常规血小板凝集相比，这是一种使用更近似于生理环境的测 定系统。然而，不可以控制数据变化以及通过孔的血液中所含的诱发物质的浓度变化。因 此，不能适宜地测定在血小板活化诱发物质处于极低浓度或不存在的条件下(在已经因血 栓症发展而活化血小板的患者中观察到)诱发的血小板凝集；以及在血小板机能异常的患 者中测定血小板机能的情况下利用极高浓度的血小板诱发物质的刺激引起的血小板凝集 能力。此外，专利文献1公开了一种测量血小板机能的方法，其中血液被允许通过毛细 管内部，然后通过分隔件的开口部，并测量因血栓形成而堵塞分隔件的开口部所需的时间。 然而，由于在这种方法中加入大量的血小板活化试剂，所以例如在血小板被活化但血小板 数量减少的情况下以及在血小板数量正常但血小板机能减弱的情况下，难以测定反映体内 状况的详细血小板机能。
现有技术文献专利文献专利文献1 JP 2007-29851IA非专利文献__专禾[I文献 1 :“Platelet Aggregability Test",Thrombosis and Circulation, vol. 12，No. 4，pl7-20，2004非专禾O 文献 2 "‘Measurement of Platelet Aggregability with PFA-100"Thrombosis and Circulation, vol. 13, No. 3, p90-94,200
发明内容
在诸如败血症和播散性血管内凝血综合征(DIC)等疾病中，由于血管内皮紊乱和 血栓形成，血小板处于活化状态，并且还形成血小板和白血球之间的复合体等。此外，由于 持续的血栓形成非常消耗血小板，所以尽管体内血栓形成但仍可能出现出血症状。在常规的血小板机能检验中，难以进行严格反映这种症状的检查。例如，在浊度法中，即使在血小板减少的情况下，当针对血小板诱发物质的反应性 提高时，血小板机能也被判定为提高(增强)。此外，由于因体内的炎症反应等形成并大大 影响血栓形成的血小板和白血球之间的复合体在用于制备富血小板血浆的离心分离过程 中与红血球一起沉积，所以它们未包含在富血小板血浆中。此夕卜，当使用PFA-100时，在强血小板机能的患者和弱血小板机能的患者中测定 时使用相同浓度的诱发物质，使得不能适宜地进行确认在诱发物质不存在或处于极低浓度 条件下的自然凝集诱发或者确认在给予抗血小板剂的患者中在诱发物质的浓度极高条件 下药剂的药效的检验。此外，即使在使用PFA-100测定时堵塞时间延长的情况下，也难以进 行血小板机能减弱的情况与血小板数量减少但血小板机能提高(在活体内活化)的情况之 间的比较。有鉴于上述情形，本发明的目的是提供一种使用少量血液在与血流同等环境下能 够有效和正确地评价血小板机能的装置和方法。为了解决上述问题，本发明提供一种检验血小板机能的方法，其中包括使抗凝固 处理的血液经过在至少内表面的一部分上具有血小板粘合面的毛细管，并观察或测定血液 在所述毛细管内的行为来检验血小板机能。这里，优选使用柠檬酸、肝素或水蛭素进行抗凝固处理。此外，所述血小板粘合面优选由胶原蛋白涂层或玻璃制成。此外，所述抗凝固处理的血液优选经受弱血小板活化处理，并且优选通过将所述 抗凝固处理的血液与未引起不可逆血小板凝集的量的血小板活化试剂混合来进行所述弱 血小板活化处理。这里，优选使用血小板活化试剂进行所述血小板活化处理，并且所述血小板活化 试剂优选是腺苷二磷酸，它与所述抗凝固处理的血液混合至浓度为0. 001 5 μ M，或者所 述血小板活化试剂优选是花生四烯酸，它与所述抗凝固处理的血液混合至浓度为0. 001 ImM0此外，所述毛细管内部的至少一部分优选具有包括流路分割壁的流路分割部，所述流路分割壁沿着在所述毛细管内的血液流动方向延伸并将所述毛细管的宽度分割成多 个流路。所述流路分割部的各流路的宽度优选为10 200 μ m。所述血小板粘合面优选设置在所述毛细管的流路分割部中。所述毛细管优选形成在微芯片内。在本发明的检验血小板机能的方法中，血小板机能优选通过以下方法检验，其中 利用泵将所述抗凝固处理的血液，优选经受弱血小板活化处理的抗凝固处理的血液，导入 所述毛细管内，并利用压力传感器测量因血液流入所述毛细管内而施加在所述泵上的压 力。这里，所述抗凝固处理的血液优选保存在与所述毛细管和所述泵连接的血液收容部内， 通过利用所述泵将比重小于血液的液体导入所述血液收容部内而将血液导入所述毛细管 内，并测量所述液体的流入压力，从而间接测量因血液流入所述毛细管内而施加的压力。此外，所述抗凝固处理的血液优选保存在与所述毛细管和所述泵连接的血液收容 部内，通过利用所述泵将血小板活化试剂导入所述血液收容部内而在所述血液收容部内将 抗凝固处理的血液与血小板活化试剂混合，并将与所述血小板活化试剂混合的血液导入所 述毛细管内，同时测量所述血小板活化试剂的流入压力，从而间接测量因血液流入所述毛 细管内而施加的压力。此外，优选地，在本发明的检验血小板机能的方法中，所述毛细管与所述血液收容 部连接，并且允许在所述血液收容部内与血小板活化试剂混合的抗凝固处理的血液经过所 述毛细管。这里，所述血小板活化试剂优选就在测定之前与所述抗凝固处理的血液混合。可 选择地，所述血小板活化试剂与所述抗凝固处理的血液混合使得所述血小板活化试剂在抗 凝固处理的血液和血小板活化试剂的混合物中的浓度沿着线性浓度梯度或阶跃浓度梯度 增大。抗凝固处理的血液和血小板活化试剂的混合物优选被搅拌。本发明还提供一种血小板机能检验装置，其包括在至少内表面的一部分上具有 血小板粘合面的毛细管；和设置在所述毛细管的至少一部分上的流路分割部，所述流路分 割部具有流路分割壁，所述流路分割壁沿着在所述毛细管内的血液流动方向延伸并将所述 毛细管的宽度分割成多个流路。这里，所述毛细管优选形成在微芯片内，并且优选地，不少于两个毛细管形成在微 芯片内。在后一种情况下，所述各毛细管优选具有10 150μπι和50 200μπι范围的不 少于2种的宽度。此外，所述血小板机能检验装置优选具有送液泵。此外，它优选具有照相机，用于 拍摄所述微芯片内部的图像。此外，所述血小板机能检验装置优选具有在所述微芯片内部的血小板粘合面下游 的废液贮存部，所述废液贮存部用于保存已经通过所述血小板粘合面的血液废液。在这种 情况下，所述废液贮存部的深度优选不小于100 μ m。更优选地，在所述废液贮存部的位置处 设置贯通至所述微芯片外部的孔，特别优选地，在相应于所述微芯片的表面上的孔的位置 设置血液吸收材料。使用本发明的如权利要求1所述的检验血小板机能的方法，通过使抗凝固处理的 血液经过在至少内表面的一部分上具有血小板粘合面的毛细管，并观察或测定血液在所述 毛细管内的行为，从而用作在血液经过所述血小板粘合面时引起的剪切应力造成的血小板活化的指标，可以检验血小板机能。使用本发明的如权利要求2所述的检验血小板机能的方法，由于柠檬酸、肝素或 水蛭素用于抗凝固处理，因而可以廉价地进行抗凝固处理。在胶原蛋白涂层用作所述血小板粘合面并且将要使用的所述抗凝固处理剂是诸 如柠檬酸等钙螯合剂的情况下，更适于通过将血液与血小板活化试剂混合并使混合物经过 胶原蛋白涂层而进行血小板机能的测定。另一方面，在使用钙螯合剂之外的抗凝固处理剂 的情况下，特别是使用水蛭素，与在使用柠檬酸进行抗凝固处理的情况下相比，血小板凝集 在胶原蛋白上更迅速更强烈地发生，造成所述毛细管的堵塞，使得即使在未使用血小板活 化试剂时也可以进行稳定的血小板机能检验。当由于血小板机能异常或抗血小板剂的使用 等而未发生血小板凝集时，通过在测定之前混合血小板活化试剂可以测量血小板机能的降 低程度或抗血小板剂的效果。通过在一个芯片内配置具有不同流路宽度的流路并使用用水 蛭素和柠檬酸抗凝固处理的血液，可以综合测定血小板凝集能力的强度、血小板诱发物质 的敏感度和抗血小板剂的效果等。使用本发明的如权利要求3所述的检验血小板机能的方法，由于所述血小板粘合 面由胶原蛋白涂层制成，因而可以测定更为生理的血小板机能。使用本发明的如权利要求4所述的检验血小板机能的方法，由于所述血小板粘合 面由玻璃制成，因而可以使用更廉价的物质测定血小板机能。使用本发明的如权利要求5所述的检验血小板机能的方法，由于所述抗凝固处理 的血液经受弱血小板活化处理，因而可以在更为生理的条件下测定血小板机能并且可以获 得反映各种疾病的检验结果。使用本发明的如权利要求6所述的检验血小板机能的方法，由于通过将所述抗凝 固处理的血液与未引起不可逆血小板凝集的量的血小板活化试剂混合来进行所述弱血小 板活化处理，因而可以简便地进行弱血小板活化处理，并且血小板活化试剂引起的血小板 活化与血小板粘合面上的剪切应力引起的血小板活化的组合允许观察更为生理的血小板活化。使用本发明的如权利要求7所述的检验血小板机能的方法，由于所述血小板活化 试剂是腺苷二磷酸，它与所述抗凝固处理的血液混合至浓度为0. 001 5 μ Μ,因而可以在 更为生理的条件下检验血小板机能并且可以获得反映各种疾病的结果。使用本发明的如权利要求8所述的检验血小板机能的方法，由于所述血小板活化 试剂是花生四烯酸，它与所述抗凝固处理的血液混合至浓度为0. 001 ImM，因而可以在更 为生理的条件下检验血小板机能并且可以获得反映各种疾病的结果。使用本发明的如权利要求9所述的检验血小板机能的方法，由于所述毛细管内部 的至少一部分具有包括流路分割壁的流路分割部，所述流路分割壁沿着在所述毛细管内的 血液流动方向延伸并将所述毛细管的宽度分割成多个流路，因而容易发生剪切应力引起的 血小板活化。使用本发明的如权利要求10所述的检验血小板机能的方法，由于所述流路分割 部的各流路的宽度为10 200 μ m，允许各流路提供支架(scaffold)，因而在形成小的血小 板凝集体时，即使在快速血流和高剪切应力下，血小板凝集体也可增大内部压力，而不会被 血流冲走。
使用本发明的如权利要求11所述的检验血小板机能的方法，由于所述血小板粘 合面设置在所述毛细管的流路分割部中，因而血小板凝集体容易保持在流路分割部中。使用本发明的如权利要求12所述的检验血小板机能的方法，由于所述毛细管形 成在微芯片内，因而可以使用少量血液进行检验。使用本发明的如权利要求13所述的检验血小板机能的方法，由于利用泵将所述 抗凝固处理的血液导入所述毛细管内，并利用压力传感器测量因血液流入所述毛细管内而 施加在所述泵上的压力，从而检验血小板机能，因而可以定量地测定血小板机能。使用本发明的如权利要求14所述的检验血小板机能的方法，由于所述抗凝固处 理的血液保存在与所述毛细管和所述泵连接的血液收容部内，通过利用所述泵将比重小于 血液的液体导入所述血液收容部内而将血液导入所述毛细管内，并测量所述液体的流入压 力，从而间接测量因血液流入所述毛细管内而施加的压力，因而泵未被血液污染。使用本发明的如权利要求15所述的检验血小板机能的方法，由于所述抗凝固处 理的血液保存在与所述毛细管和所述泵连接的血液收容部内，通过利用所述泵将血小板活 化试剂导入所述血液收容部内而在所述血液收容部内将抗凝固处理的血液与血小板活化 试剂混合，并将与所述血小板活化试剂混合的血液导入所述毛细管内，同时测量所述血小 板活化试剂的流入压力，从而间接测量因血液流入所述毛细管内而施加的压力，因而可以 快速地进行检验。使用本发明的如权利要求16所述的检验血小板机能的方法，由于所述血小板活 化试剂与所述抗凝固处理的血液混合使得所述血小板活化试剂在抗凝固处理的血液和血 小板活化试剂的混合物中的浓度沿着线性浓度梯度或阶跃浓度梯度增大，因而可以测定宽 范围浓度的血小板活化试剂引起的血小板活化，并且可以在一次实验中测定血小板的机能 亢进和机能减退。使用本发明的如权利要求17所述的检验血小板机能的方法，由于抗凝固处理的 血液和血小板活化试剂的混合物被搅拌，因而可以获得更准确的检验结果。使用本发明的如权利要求17所述的血小板机能检验装置，由于血小板机能检验 装置包括在至少内表面的一部分上具有血小板粘合面的毛细管；和设置在所述毛细管的 至少一部分上的流路分割部，所述流路分割部具有流路分割壁，所述流路分割壁沿着在所 述毛细管内的血液流动方向延伸并将所述毛细管的宽度分割成多个流路，因而血小板可以 被有效地活化。因此，所述装置适于上述检验血小板的方法。使用本发明的如权利要求18所述的血小板机能检验装置，由于所述毛细管形成 在微芯片内，因而可以容易的制作毛细管并且可以使用少量样品进行检验。使用本发明的如权利要求19所述的血小板机能检验装置，由于不少于两个毛细 管形成在微芯片内，因而可以同时进行多种检验。使用本发明的如权利要求20所述的血小板机能检验装置，由于所述各毛细管具 有10 150 μ m和50 200 μ m范围的不少于2种的宽度，因而可以使用少量样品同时进 行多种检验。使用本发明的如权利要求21所述的血小板机能检验装置，由于所述装置具有送 液泵，因而可以控制血液流入毛细管的流量，这是优选的。使用本发明的如权利要求22所述的血小板机能检验装置，由于所述装置具有照相机，用于拍摄所述微芯片内部的图像，因而可以观察血小板活化。设置的照相机优选能够 拍摄静止或活动图像。如果照相机能够以恒定间隔自动地拍摄内部的静止或活动图像，则 可以在测定之后随着时间推移来视觉评价血小板活化的状态，这是优选的。如果整个流路 内部的图像被作为全景照片或连续静止图像拍摄，则可以容易地进行它们的保存和比较， 这是更优选的。当拍摄静止或活动图像时，安装透过型光源，即，在所述照相机相对侧的光 源，能够拍摄更清楚的图像。使用本发明的如权利要求23所述的血小板机能检验装置，由于所述装置具有在 所述微芯片内部的血小板粘合面下游的废液贮存部，所述废液贮存部用于保存已经通过所 述血小板粘合面的血液废液，因而不需要吸收和除去血液废液，因此可以简便地进行检验。使用本发明的如权利要求M所述的血小板机能检验装置，由于所述废液贮存部 的深度不小于100 μ m,因而可以充分地保存血液废液。使用本发明的如权利要求25所述的血小板机能检验装置，由于在所述废液贮存 部的位置处设置贯通至所述微芯片外部的孔，因而所述废液贮存部内的空气被排出到外 部，因此可以在未增大内部压力的情况下将血液保存在贮存部中。使用本发明的如权利要求沈所述的血小板机能检验装置，由于在相应于所述微 芯片的表面上的孔的位置设置血液吸收材料，因而血液废液可以被吸收进血液吸收材料 内，因此血液废液未飞散。
图1是构成本发明的血小板监测装置的微芯片的第一实施方案的示图。图2是本发明的血小板监测装置的第一实施方案的示图。图3是构成本发明的血小板监测装置的微芯片的第二实施方案的示图。图4是本发明的血小板监测装置的第二实施方案的示图。图5是实施例1中的泵109的压力变化的示图。图6是实施例2中的泵109的压力变化的示图。图7是实施例3中的泵109的压力变化的示图。图8是实施例4中的泵109的压力变化的示图。图9是实施例5中的泵109的压力变化的示图。图10是实施例6中的泵109的压力变化的示图。图11是实施例7中的血小板活化的状态的示图(照片)。A 无ADP ；B :0. 025 μ M ADP ；C 0. 05 μ M ADP ；D 0. 1 μ M ADP。图12是实施例8 10中的泵209的压力变化的示图。图13是本发明的血小板监测装置的第三实施方案的示图。图14是实施例11 13中的泵209的压力变化的示图。图15是实施例14和15中的泵209的压力变化的示图。图16是在20μ Ι/min下压力上升的结果，使用加入花生四烯酸的血液得到该结 果。A显示在20 μ Ι/min下压力上升的结果，使用实施例16a的受试体G的加入花生四烯酸 的血液得到该结果。B显示在与16a相似的实验中的压力上升，其中受试体G已经预先服用 IOOmg阿司匹林。
图17是在10 μ 1/min下压力上升的结果，使用加入花生四烯酸的血液得到该结 果。C显示在10 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例16b的受试体G的加入花生四烯酸 的血液得到该结果。D显示在与16b相似的实验中的压力上升，其中受试体G已经预先服用 IOOmg阿司匹林。图18是在5 μ 1/min下压力上升的结果，使用加入花生四烯酸的血液得到该结果。 E显示在5 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例16c的受试体G的加入花生四烯酸的 血液得到该结果。F显示在与16c相似的实验中的压力上升，其中受试体G已经预先服用 IOOmg阿司匹林。图19是在20 μ 1/min下压力上升的结果，使用加入胶原蛋白的血液得到该结果。 A显示在20 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例16d的受试体G的加入6 μ 1胶原蛋白 的血液得到该结果。B、C和D分别显示在与实施例16d相似的实验中的压力上升，使用在 实施例18中加入18 μ 1胶原蛋白的血液、其中使用在实施例18中加入12 μ 1胶原蛋白的 血液和其中受试体G已经预先服用IOOmg阿司匹林。图20是在10 μ 1/min下压力上升的结果，使用加入胶原蛋白的血液得到该结果。 E显示在10 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例16e的受试体G的加入胶原蛋白的血液 得到该结果。F显示在与16e相似的实验中的压力上升，其中受试体G已经预先服用IOOmg 阿司匹林。图21是在5 μ 1/min下压力上升的结果，使用加入胶原蛋白的血液得到该结果。F 显示在5 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例16f的受试体G的加入胶原蛋白的血液得 到该结果。G显示在与16f相似的实验中的压力上升，其中受试体G已经预先服用IOOmg阿 司匹林。图22是在20 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例21中的用0. 4 μ g/ml或 0.8 μ g/ml ReoPro处理的血液得到该结果。‘对照’显示在20 μ 1/min下压力上升的结果， 使用实施例19中的血液(未用ReoPro处理)得到该结果。图23是在7 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例21中的用0. 4 μ g/ml或 0. 8 μ g/ml ReoPro处理的血液得到该结果。‘对照’显示在7 μ 1/min下压力上升的结果， 使用实施例20中的血液(未用ReoPro处理)得到该结果。图M是在20 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例22中的用0. 01 μ g/ml或 0. 1 μ g/ml OS-I处理的血液得到该结果。‘对照’显示在20 μ 1/min下压力上升的结果，使 用未用OS-I处理的血液得到该结果。图25是在7 μ 1/min下压力上升的结果，使用实施例22中的用0. 01 μ g/ml或 0. 1 μ g/ml OS-I处理的血液得到该结果。‘对照，显示在7 μ 1/min下压力上升的结果，使 用未用OS-I处理的血液得到该结果。
具体实施例方式下面参照
本发明的血小板检验装置。在本发明中，‘血液’包括全血和富 血小板血浆。图1是构成本发明的血小板检验装置的微芯片的第一实施方案的概念图。下面基 于图1进行说明。
图KA)是第一基板100的平面图，其中在表面上刻有相应于微芯片1的毛细管 101的凹槽。凹槽的截面形状可以是任意的，可以是矩形、U形或V形等。由于血小板凝集 体是脆性的，因此为测量压力上升，凹槽的深度优选不超过10 200 μ m。凹槽的宽度优选 为 10 100 μ m。在相应于毛细管101的凹槽的第一端部(入口侧的端部)和第二端部(出口侧的 端部)之间的部分中，设有沿着血液流动方向延伸的多个流路分割壁103，从而形成将毛细 管的宽度分割成多个流路的流路分割部102。此外，流路分割壁103之间的间隔优选不超过200 μ m。由于宽度不超过200 μ m， 因此当形成血小板凝集体时，即使在快速血流和高剪切应力下，血小板凝集体也可增大内 部压力，而不会被血流冲走。此外，在流路分割部102中，毛细管101的宽度优选被流路分 割壁103分割成不少于5个流路。也就是说，在流路的宽度被分割成不少于5个流路的情 况下，各分割流路的堵塞被平均化，因此可以容易地获得偏差较小的数据。流路分割壁103的形状不受限制，只要它们可以将毛细管101的宽度分割成多个 流路。图I(B)是第二基板110的平面图，其上刻有相应于微芯片1的入口 104和出口 105的贯通孔。贯通孔相应于入口 104和出口 105的位置是在与第一基板100叠置时分别 相应于第一基板100上的毛细管101的第一端部和毛细管101的第二端部的位置。此外， 通过用胶原蛋白等涂布第二基板Iio的覆盖第一基板100上的流路分割部102的背面，形 成血小板粘合面106。更具体而言，如图I(C)所示，胶原蛋白等从安全性的观点来看宽泛地 涂布在将要用作血小板粘合面106的区域上。如图3所示(第二实施方案)，血小板粘合面还可以在毛细管的整个长度上延伸。 在第二实施方案中，第二基板210的材料是玻璃，并且微芯片2的毛细管201内部的第二基 板侧的整个长度用作血小板粘合面206。可选择地，如图1和图3所示，代替在相应于毛细管的第二端部在第二基板中的位 置处设置贯通孔并从而提供出口，如图13所示(第三实施方案)，通过设置凹槽使其包围相 应于毛细管301的第二端部在第二基板310上的位置并用第一基板300覆盖凹槽，可以设 置用于保存已经通过血小板粘合面306的血液废液的废液贮存部307。通过设定废液贮存 部307的容量大于检验用的血液量，可以消除象第一和第二实施方案中那样使用泵等从出 口抽吸血液废液并排出的操作，使得可以更容易地进行检验。贯通孔可以设置在废液贮存 部307中，以提供气孔305。通过将血液吸收材料308放置在相应于微芯片3的表面上的 贯通孔305的位置，即使在血液样品量很大的情况下也可以避免血液废液向微芯片外部扩 散。将要贴附的血液吸收材料的例子包括海绵和布。图I(C)是微芯片1的平面图，其中第一基板100和第二基板110彼此叠置，使得 第一基板100的凹槽和第二基板110的血小板粘合面向内面对。波浪线显示毛细管103存 在于微芯片1的内部。血小板粘合面的例子包括胶原蛋白涂层和玻璃。其中，由于胶原蛋白容易获得和 处理并且能够提供近似于实际血管的模型，因而是特别优选的。血小板粘合面也可以是含 有胶原蛋白和组织促凝血酶原激酶的血小板粘合面。诸如胶原蛋白等物质以高粘合强度涂 布在血小板粘合面106上，从而避免被血流冲走。
通过例如JP 05-260950A和Blood. 1995 Apr 1 ；85(7) 1拟6_35 中所记载的，将胶 原蛋白溶解在酸性溶液中，并将得到的溶液涂布在被赋予亲水性的诸如玻璃或聚苯乙烯等 基板的预定位置上，然后洗涤和干燥基板，可以高粘合强度简便地涂布胶原蛋白涂层。在将要涂布疏水性树脂等的情况下，通过经等离子体处理等使树脂表面亲水化， 然后将胶原蛋白溶液涂布到所需区域，然后风干或减压干燥，可以获得涂层。在塑料用作基材的情况下，通过经等离子体处理等使其表面亲水化，然后使用诸 如吸液管或注射器等分配器将胶原蛋白溶液涂布到所需区域，然后风干或减压干燥，可以 用胶原蛋白或含有组织促凝血酶原激酶的胶原蛋白容易地进行涂布。在玻璃用作血小板粘合面的情况下，可以使用其中仅相应于血小板粘合面106的 位置由玻璃形成而其他区域由塑料或硅树脂等形成的第二基板110，或者如图3所示，在玻 璃基板用作第二基板210并且第二基板与由塑料或硅树脂等形成的第一基板200叠置的情 况下，血小板粘合面206可以在毛细管201的整个长度上延伸。微芯片1的材料优选是金属、玻璃、塑料或硅树脂等。从在血液监测(尤其是图像 分析)中的用途的观点来看，透明材料是优选的。此外，从回路形成的观点来看，塑料是优 选的，透明塑料是特别优选的。在材料是诸如PDMS(聚二甲基硅氧烷)等硅树脂的情况下， 在各基板之间获得优异的粘合，使得第一基板100甚至通过按压就可以与第二基板110叠 置，无需使用粘合剂等进行粘合，但是在向微芯片1的内部施加高压力的情况下，优选使用 粘合剂。通过使用聚(丙烯酸2-甲氧基乙酯)(PMEA)，还可以在意料之外的部位容易和有 效地抑制血液凝固。可以使用刀具或激光束刻出在微芯片1的基板上设置的凹槽和孔，并 且在微芯片1的材料是塑料的情况下，也可以通过射出成型来形成。通过射出成型来形成 是优选的，因为可以有效地制作具有一致质量的微芯片1。下面基于图1 (C)说明使用本实施方案的微芯片1的血小板机能检验的一个例子。 将管子(图未示)与第一入口 104连接，经由该管子连接血液贮存器(血液收容部)107和 送液泵109(图未示)。通过将连接的泵109中的液体注入贮存器107内，将贮存器内的血 液注入微芯片1。如果泵内的液体是血小板活化试剂，则贮存器内的抗凝固处理的血液的 血小板被活化，并且当通过血小板粘合面时由于剪切应力而被进一步活化。此外，贮存器内 的血小板活化试剂的浓度可以持续上升。通过在血液贮存器内放置搅拌子并搅拌内部的血 液，使血小板活化试剂与血液不断混合，这是优选的。送液泵内的液体可以是比重小于血液的液体，如矿物油或生理盐水，并且该液体 可以被导入预先填充抗凝固处理的血液的贮存器内，从而允许血液被导入毛细管内。通过 测量该液体的流入压力，可以间接测量因血液流入毛细管而施加的压力。贮存器所预先填 充的抗凝固处理的血液优选是与血小板活化试剂的混合物。还可以将干燥或液体状态的血 小板活化试剂预先放置在贮存器内，然后与血液混合。此外，通过以阶跃方式增大送液泵的 流量，还可以阶跃方式增大剪切应力。抑制血液凝固的抗凝固处理用的抗凝固处理剂的例子包括柠檬酸钠或钾；草酸钠 或钾；A⑶(酸性柠檬酸葡萄糖)；和乙二胺四乙酸(EDTA)盐。这些抗凝固处理剂可以作为 粉末、冻干品或溶液(如水溶液)使用。在这些抗凝固处理剂中，常用的3. 2%柠檬酸钠是 优选的，因为容易获得。在这种情况下，优选的是9体积的血液使用1体积的这种抗凝固处理剂。
可以使用的其他抗凝固处理剂的例子包括肝素、水蛭素、凝血酶适体和玉米胰蛋 白酶抑制剂(1977. J.Biol. Chem 252.8105)。可以使用超过一种的抗凝固处理剂。在使用 的抗凝固处理剂是水蛭素的情况下，与使用柠檬酸的抗凝固处理的情况相比，即使没有使 用血小板活化试剂处理也引起更强的血小板凝集，使得水蛭素适于测定剪切应力依赖性的 血小板机能。在使用柠檬酸抗凝固处理血液的情况下，可以准确地测定依赖于血小板活化 试剂的刺激的血小板机能，使得柠檬酸更适于抗血小板剂的评价等。获得抗凝固处理的血液的方法的例子包括其中上述抗凝固处理剂预先放置在注 射器或真空采血管中，然后用其采集血液的方法，以及其中在采集血液后立即将抗凝固处 理剂快速加到血液中的方法。还可以使用含有肝素的真空采血管等收集血液，然后加入肝素酶和适于监测目的 的抗凝固处理剂，从而利用肝素酶使肝素分解，实现用适于测定目的的抗凝固处理剂置换 肝素。将要与抗凝固处理的血液混合的血小板活化试剂的例子包括ADP、胶原蛋白、凝血 酶、花生四烯酸和利托菌素。血小板活化试剂以引起弱血小板活化的浓度与抗凝固处理的 血液混合。引起弱血小板活化的浓度是在静止状态下未引起不可逆的血小板凝集(血小板 二次凝集)的浓度。例如，在ADP的情况下，浓度为0.001 5μΜ，在花生四烯酸的情况下， 浓度为0. 001 ImM。然而，在由于血小板机能异常或给予抗血小板剂而使得对于这些血小 板活化试剂的反应性明显降低的情况下，优选在加入浓度高于上述浓度的血小板活化试剂 下进行降低程度的测定。特别地，在测定氯吡格雷(clopidogrel)或阿司匹林的效果程度 的情况下，优选的是分别使用ADP或花生四烯酸的增大浓度进行测定。从入口 104引入并经过毛细管101的弱血小板活化试剂和抗凝固处理的血液的混 合物经过流路分割部102，同时产生剪切应力，并因而增强血小板的活化，导致血小板在血 小板粘合面上的粘合和积聚。通过调节流量和微芯片并在高剪切应力和低剪切应力下进行 比较实验，可以更详细地评价血小板机能、评价抗血小板剂的药效等。通过观察经过流路分 割部102的混合物的流量和性状，可以监测血小板机能。被监测的血液从设置在毛细管101 端部的出口 105排出。下面说明使用微芯片1的本发明的血小板检验装置。图2是作为本发明的血小板检验装置的第一实施方案的血小板检验装置A的概念 图，其中微芯片1由透明基板构成并组装到装置中。下面基于图2说明第一实施方案。将其中放置抗凝固处理的血液并包含搅拌子108的贮存器107(血液收容部)以 倒立位置与微芯片1的入口 104连接，将供应血小板活化试剂的送液泵109经由管子与贮 存器107连接。将压力传感器(图未示)与送液泵109连接。从送液泵109将血小板活化试剂注入贮存器107内，并利用由磁力搅拌器113驱 动的搅拌子108将血小板活化试剂与抗凝固处理的血液混合。通过在将血小板活化试剂从送液泵109导入贮存器107内时调节泵的流量，从而 使血小板活化试剂在与血液的混合物中的浓度从0自动地增大到能够充分诱发血小板的 浓度，可以在一次实验中测定血小板机能亢进和血小板机能减退，这是优选的。例如，ADP 浓度可以沿着0 0. 1 μ M的浓度梯度增大，或者诱发物质的浓度可以阶跃方式从0增大到 0. 02,0. 04,0. 06,0. 08 和 0. 1 μ Μ。
与血小板活化试剂混合的抗凝固处理的血液注入到微芯片1的毛细管101内。混 合物经过毛细管101并到达具有诸如胶原蛋白或玻璃等血小板粘合面的流路分割部102。通过使用照相机111观察血小板在流路分割部102的活化(粘合、凝集等)和引 起的毛细管堵塞，可以检验血小板机能。可选择地，通过利用与送液泵109连接的压力传感 器测量流路中的压力，可以进行更定量的血小板机能检验。此外，通过测量血液与血小板活 化试剂的混合物经过毛细管101所需的时间长度或已经经过毛细管101的混合物量，也可 以进行血小板机能检验。照相机111与图像分析仪114连接，它们能够使血小板活化的状态成像等。从患 者血液状态的综合判断的观点来看，通过采集毛细管内部的血小板活化的图像而视觉评价 和基于压力上升的血小板活化的定量检验的组合非常重要。例如，在诸如DIC等病态中血 小板已经体内活化但显著消耗和减少的情况下，压力上升和堵塞延迟。即使在这种情况下， 使用照相机采集内部图像也能够从检验开始之后立即确认血小板粘合面上的血小板粘合 和凝集上升等，使得可以综合判断患者血液的状况。照相机111可以沿着毛细管101中的血流方向移动。也可以通过使用奎纳克林等荧光标记血小板来分析血小板。在这种情况下，可以 通过利用图像分析来监测因为荧光而每单位面积的亮度，使监测结果数值化，从而获得作 为数据的监测结果。将微芯片1置于平台状加热器115上，通过利用加热器115加热微芯片1达至 37°C，可以在与身体内部相似的条件下进行监测。含有已经经过流路分割部102的血液的混合物从出口 105平稳地排出到出口管 112。搅拌子优选被进行抗凝固处理。抗凝固处理可以是通过在熔融树脂中浸渍磁性材 料而用肝素、聚乙烯基乳酰胺(PVLA)或聚(丙烯酸2-甲氧基乙酯)(PMEA)等在磁性材料 的表面上形成的涂层或者通过利用诸如模具内射出成型等树脂加工形成搅拌子的表面。尽管上面基于例子说明了其中血小板活化试剂与抗凝固处理的血液在微芯片外 部在贮存器内混合，然后导入微芯片内的毛细管中的实施方案，但是本发明的血小板机能 检验装置不限于上述实施方案。例如，还可以构造以下装置，其中在微芯片内设置将抗凝固处理的血液与血小板 活化试剂混合在一起的混合部，并且在微芯片内将血液与血小板活化试剂混合在一起，其 后允许混合物从混合部流入毛细管。实施例下面通过具体实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于此。[微芯片和血小板机能检验装置的制作]准备两个透明基板，S卩，图I(A)所示的第一基板100和图I(B)所示的第二基板 110 (Richell Corporation制造的射出成型品)。利用硅烷偶联剂和60°CT 16小时的热 压粘合，将第一基板100的相应于毛细管101的凹槽打开的侧面和第二基板110的具有血 小板粘合面106的侧面贴合到一起，使得它们彼此面对，从而提供图I(C)所示的微芯片1。 在第一基板100中，流路(毛细管)101的长度、深度和宽度分别为20mm、50ym和2mm。关 于流路分割部102，长度为2mm、宽度为25 μ m和高度为50 μ m的各分割壁103以25 μ m的等间隔设置，并且这一部分用作流路分割部102。在第二基板100中，相应于入口 104和出 口 105的各个孔是具有圆形截面且内径为2mm和深度为2mm的贯通孔。在第二基板110上 的与第一基板100的流路分割部102重叠的位置处，涂布3mg/ml的I型胶原蛋白(Nitta Gelatin Inc.制)，并真空干燥以提供血小板粘合面106。如图2所示，将制成的微芯片1放置在平台状加热器115上，并将贮存器107与微 芯片1的入口 104连接。将泵109经由管子与贮存器107连接，并使用压力传感器(图未 示)测量施加在泵上的压力。在贮存器107中，包含通过用PMEA涂布铁制圆柱制得的直径 为2mm和长度为5mm的圆柱形搅拌子108。搅拌子108被设置成利用在加热到37°C的加热 器115下方设置的搅拌器113的磁力使其能够以60 ISOrpm的转速转动。出口管112与 出口连接，使得可以排出分析后的血液。与图像分析仪114连接的照相机111设置在微芯 片1的流路分割部102的上方，从而允许观察在流路分割部102中的血小板活化的状态。实施例1)使用图1所示的微芯片1和图2所示的血小板检验系统A，进行测定。从受试体A 采集用柠檬酸抗凝固处理的血液。将用柠檬酸抗凝固处理的全血充满贮存器107，使用连接的泵109从入口将生理 盐水注入贮存器107，从而从贮存器107挤出血液并允许血液流入微芯片1内。在贮存器 107内，包含搅拌子108，并利用搅拌子108搅拌血液。泵109的流量最初10秒为100μ 1/min，然后为3μ 1/min。泵109的压力变化示于图5。实施例2)按与实施例1相同方式进行实验，除了流量为6 μ/min，代替3 μ 1/min。(使用来自与实施例1中相同的受试体A的血液样品。)泵109的压力变化示于 图6。(讨论)使用相同样品通过将流量从3μ 1/min增大到6 μ 1/min，剪切应力增大， 并且确认压力上升。实施例3)按与实施例2相同方式进行实验，除了用0.5μΜ ADP溶液填充泵109，代替生理盐 水。(使用来自与实施例中相同的受试体A的血液样品。)泵109的压力变化示于图7。实施例4 6)使用来自另一个受试体(受试体B)的样品通过测定进行实施例1 3中的实验。 泵109的压力变化分别示于图8、图9和图10。比较实验)将来自受试体A和B的血液在800rpm下离心分离，得到富血小板血浆，使用血小 板凝集计(PA-20, Kowa Company, Ltd.)测定ADP诱发的血小板凝集能力。ΙμΜ ADP在来 自受试体A的血液中诱发的大凝集大约是在来自受试体B的血液中的一半。讨论)基于受试体A和B的结果，可以确认，由于在剪切应力下对胶原蛋白的粘合和凝集 而造成的压力上升在受试体A中比在受试体B中更弱。然而，在受试体A中，ADP诱发的凝 集能力更强，并且确认在加入ADP时由于对胶原蛋白的粘合和凝集而造成的压力上升与在受试体B中的相同。实施例7)使用图像诊断用实施例1中的微芯片1和系统A进行实验。泵109中填充矿物油， 贮存器107充满用柠檬酸抗凝固处理的血液。使用泵109以8μ Ι/min的流量将矿物油送 至贮存器107，从而允许血液流入微芯片1。使用通过将ADP加到柠檬酸处理的血液中至最 终浓度分别为0.025 μ M、0.05 μ M和0. 1 μ M而制备的血液，进行完全相同的实验。图11中 的各画板显示实验1分钟后微芯片1内部的状态经使用照相机111拍摄的图像。讨论)当加入ADP时，观察到贴附到梳子部上的血小板量以ADP浓度依赖性方式上升，并 且可以视觉确认即使在未发生压力上升水平下的血小板附着。[微芯片和血小板机能检验装置的制作]将图3Α所示的第一基板200和图所示的第二基板210彼此叠置并粘合，从而 提供图3C所示的微芯片2。关于基板200，使用由PDMS制成的基板(Fluidware)，全部流 路的深度为120 μ m ；流路宽度为Imm ；梳子的长度为Imm ；梳子的宽度为50 μ m ；凹槽宽度为 50 μ m。关于基板210，使用载玻片，并且象基板110中那样设置相应于入口和出口的贯通 孔，但是与基板110不同的是，由于玻璃起到血小板粘合面的作用，因而未涂布胶原蛋白。 也就是说，毛细管201内部的第二基板侧的总长度用作血小板粘合面206。图4中所示的血小板机能检验装置B与图2中的血小板机能检验装置A相同，除了 使用微芯片2，代替微芯片1，并且没有搅拌子和搅拌器。因为在以下实施例中，预先与ADP 混合的抗凝固处理的血液被放置在贮存器内，所以不需要搅拌子和搅拌器。实施例8)使用图3中所示的微芯片2和图4中所示的血小板机能检验装置B。将大约600 μ 1 的用柠檬酸抗凝固处理的血液填充入血液贮存器207。泵209填充矿物油，泵209与贮存 器207连接，其前端进一步连接到微芯片2的入口 204。以20μ Ι/min的流量将矿物油从泵 209注入微芯片2，并利用压力传感器(图未示)测量矿物油的流入压力。实施例9)通过进行与实施例8中相同的实验测定压力变化，除了 ADP(Wakc) Pure Chemical Industries, Ltd.制)进一步加到贮存器207内的用柠檬酸抗凝固处理的血液，至最终浓 度为&ιΜ。实施例10)通过进行与实施例9中相同的实验测定压力变化，除了使用服用75mg氯吡格雷 (Sanofi-aventis)后3小时采集的血液。实施例8 10中的泵209的压力变化示于图12。加入极少量ADP造成压力上升， 并且通过给予氯吡格雷抑制这种上升。[微芯片和血小板机能检验装置的制作]准备两个透明基板，S卩，图I(A)所示的第一基板100和图I(B)所示的第二基板 110 (Richell Corporation制造的射出成型品)。利用硅烷偶联剂和热压粘合，将第一基板 100的相应于毛细管101的凹槽打开的侧面和第二基板110的具有血小板粘合面106的侧 面贴合到一起，使得它们彼此面对，从而提供图1(c)所示的微芯片1。在第一基板100中，流路(毛细管)101的长度、深度和宽度分别为20mm、50 μ m和2mm。关于流路分割部102，长 度为1.5mm、宽度为50 μ m和高度为50 μ m的各分割壁103以50 μ m的等间隔设置，并且这 一部分用作流路分割部。在第二基板100中，相应于入口和出口的各个孔是具有圆形截面 且内径为2mm和深度为2mm的贯通孔。在第二基板110上的与第一基板100的流路分割部 102重叠的位置处，涂布大约10 μ 1的3mg/ml的I型胶原蛋白(Nitta Gelatin Inc.制)， 并真空干燥以提供血小板粘合面106。涂布胶原蛋白的区域是从梳子上游4mm到梳子下游 2mm，包括梳子。如图4所示，将制成的微芯片1放置在加热器215上，并且象实施例8中那样将泵 209和贮存器207与微芯片1连接。实施例11)(a)使用水蛭素采血管(Multiplate Services GmbH)从受试体D采集血液，将大 约600 μ 1的用水蛭素抗凝固处理的血液填充入贮存器207。泵209填充矿物油，并与贮存 器207连接，其前端进一步连接到微芯片1的入口 104。最初5秒以200μ1/π η的流量、然 后以20μ Ι/min的流量将矿物油从泵209注入贮存器，从而使贮存器内的血液以相同流量 注入微芯片1，同时利用压力传感器(图未示)测量矿物油的流入压力。(b)按与(a)中相同方式进行实验，除了最初5秒以200μ1/π η的流量、然后以 ΙΟμΙ/min的流量将矿物油注入贮存器，从而使贮存器内的血液以相同流量注入微芯片1， 同时测量矿物油的流入压力。(c)按与(a)中相同方式进行实验，除了最初5秒以200μ1/π η的流量、然后以 5μ Ι/min的流量将矿物油注入贮存器，从而使贮存器内的血液以相同流量注入微芯片1， 同时测量矿物油的流入压力。实施例11(a)、(b)和(c)的结果示于图14(A)。横轴代表时间，纵轴代表由于芯 片中的堵塞造成的压力上升。受试体D中按实施例(a)、(b)和(c)的顺序引起压力上升， 即，按剪切应力递减顺序。实施例12)使用受试体E进行与实施例11中相同的实验。结果示于图14(B)。实施例13)使用受试体F进行与实施例11中相同的实验。结果示于图14(C)。参考例)使用全血血小板凝集计Multiplate (Dynabyte)针对受试体D、E和F测定血小板 凝集能力。使用水蛭素采血管采集血液，并测定由6μ M ADP诱发的凝集能力。结果如下 D，691AU/min ；E,525AU/min ；和F，652AU/min。ADP诱发的凝集能力在受试体D中最强，然后 按顺序是受试体F和受试体E。讨论在D、E和F中，压力上升最初在高剪切应力下发生，然后按顺序是中和低剪切 应力。此外，压力上升最初在受试体D中发生，然后按顺序是F和E，并将该结果与使用 Multiplate进行的有关ADP诱发的凝集能力的检验结果相关联。按与实施例Ila相同方式进行实验，除了使用柠檬酸采血管采集血液并用柠檬酸 钠进行抗凝固处理。在这种情况下，即使在10分钟后也未观察到压力上升。
实施例14)将大约600μ1用柠檬酸抗凝固处理的受试体E的血液与6μ1 100 μ MADP试剂 (Chrono-log Corporation)混合，在其后立即将贮存器充满血液。象实施例Ila中那样，将 充满矿物油的泵与贮存器连接，再与微芯片连接。将微芯片1放置在加热器上，允许血液最 初5秒以200 μ 1/min的流量流动，然后为20 μ 1/min。实施例I5)a)按与实施例14相同方式进行实验，除了使用受试体D的血液。b)按与实施例 14相同方式进行实验，除了使用在口服给予IOOmg氯吡格雷后6小时采集的受试体D的血 液。实施例15和14的结果示于图15。在图5中，A代表实施例15a)的结果；B代表 实施例15b的结果；和C代表实施例14的结果。可以看出，在受试体D中，由于给予氯吡格 雷压力上升延迟，并且在给予氯吡格雷后压力上升比受试体E的血液更慢。实施例I6)a)将大约600 μ 1用柠檬酸抗凝固处理的受试体G的血液与6 μ 1 50mM花生四烯 酸(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即将贮存器充满血液。象实施例Ila中那样， 将充满矿物油的泵与贮存器连接，再与微芯片连接。将微芯片1放置在加热器上，允许血液 最初5秒以200 μ 1/min的流量流动，然后为20 μ 1/min。b)将大约600 μ 1用柠檬酸抗凝固处理的受试体G的血液与6 μ 1 50mM花生四烯 酸(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即将贮存器充满血液。象实施例Ila中那样， 将充满矿物油的泵与贮存器连接，再与微芯片连接。将微芯片1放置在加热器上，允许血液 最初5秒以200 μ 1/min的流量流动，然后为10 μ 1/min。c)将大约600 μ 1用柠檬酸抗凝固处理的受试体G的血液与6 μ 1 50mM花生四烯 酸(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即将贮存器充满血液。象实施例Ila中那样， 将充满矿物油的泵与贮存器连接，再与微芯片连接。将微芯片1放置在加热器上，允许血液 最初5秒以200 μ 1/min的流量流动，然后为5 μ 1/min。d)将大约600 μ 1用柠檬酸抗凝固处理的受试体G的血液与6 μ 1 100 μ g/ml胶原 蛋白(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即将贮存器充满血液。象实施例Ila中那 样，将充满矿物油的泵与贮存器连接，再与微芯片连接。将微芯片1放置在加热器上，允许 血液最初5秒以200 μ 1/min的流量流动，然后为20 μ 1/min。e)将大约600 μ 1用柠檬酸抗凝固处理的受试体G的血液与6 μ 1 100 μ g/ml胶原 蛋白(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即将贮存器充满血液。象实施例Ila中那 样，将充满矿物油的泵与贮存器连接，再与微芯片连接。将微芯片1放置在加热器上，允许 血液最初5秒以200 μ 1/min的流量流动，然后为10 μ 1/min。f)将大约600 μ 1用柠檬酸抗凝固处理的受试体G的血液与6 μ 1 100 μ g/ml胶原 蛋白(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即将贮存器充满血液。象实施例Ila中那 样，将充满矿物油的泵与贮存器连接，再与微芯片连接。将微芯片1放置在加热器上，允许 血液最初5秒以200 μ 1/min的流量流动，然后为5 μ 1/min。实施例17)在服用IOOmg阿司匹林后6小时对受试体G进行实施例16中的实验a f。
实施例18)使用在服用IOOmg阿司匹林后6小时采集的受试体G的血液，按与实施例16d f相同方式进行实验，除了加入的胶原蛋白量增大为12μ 1或18μ 1。实施例16 18的结果示于图16 21。从这些结果显示出，通过将花生四烯酸或胶原蛋白加到柠檬酸处理的血液中并在 测定压力上升的同时允许得到的混合物在微芯片中流动，可以分析阿司匹林的抗血小板效 果。此外，如图19所示，揭示出在服用阿司匹林后采集的血液通过增大加入的胶原蛋白量 也可以引起压力上升。因此，揭示出本发明的方法不仅允许评价阿司匹林效果的有无，而且 允许评价血小板机能抑制的程度。因此，基于因成像能力带来的活化的血小板凝集体的视觉确认和压力上升的组合 诊断，可以更详细地掌握患者血小板的状况。实施例I9)按与实施例11 (a)相同方式进行实验，除了使用受试体H的血液。实施例2O)按与实施例19相同方式进行实验，除了最初5秒以200μ Ι/min的流量、然后以 7 μ 1/min的流量将矿物油从泵209注入贮存器，从而使贮存器内的血液以相同流量注入微 芯片1，同时测量矿物油的流入压力。实施例21)按与实施例19和实施例20相同方式进行测定，除了将分别为Ojyg/ml和 0. 8 μ g/ml的作为针对血小板膜上的受体6 1113/1113的抗体的1^0 1~0伍11 lilly)加到用 水蛭素抗凝固处理的血液中。实施例22)按与实施例19和实施例20相同方式进行测定，除了将分别为0. 01 μ g/ml和 0. 1 μ g/ml的作为血小板膜上的受体GPIb的抑制剂的OS-I (Biochemistry. 2008 Apr 22 ； 47(16) :4674-82)加到用水蛭素抗凝固处理的血液中。实施例19,20和21的结果示于图22和图23。图22表示在20 μ 1/min的流量下ReoPro的抑制效果，图23表示在7 μ 1/min的 流量下ReoPro的抑制效果。实施例22的结果示于图M和图25。图M表示在20 μ 1/min的流量下OS-I的抑制效果，图25表示在7 μ 1/min的流 量下OS-I的抑制效果。讨论)GPIIb/IIIa主要结合到纤维蛋白原并涉及到血小板凝集，GPrt是与vWF结合并涉 及到高剪切应力下的血小板粘合反应的受体。抑制血小板粘合反应的OS-I在高剪切应力下表现出强的抗血小板作用，而 ReoPro在低剪切应力下表现出相当强的抗血小板效果。符号说明A，B血小板监测装置；1，2，3微芯片；
100，200，300第一基板；101，201，301毛细管；102,202,302流路分割部；103，203，303流路分割壁;104,204，304入口；105，205出口；106，206，306血小板粘合面；107,207贮存器；108搅拌子；109，209泵；110，210笛一.基板；111，211照相机；112，212出口管；113搅拌器；114，214图像分析仪；115，215加热器；305气孔;307废液贮存部；308血液吸收材料
权利要求
1.一种检验血小板机能的方法，包括使抗凝固处理的血液经过在至少内表面的一部分 上具有血小板粘合面的毛细管，并观察或测定血液在所述毛细管内的行为来检验血小板机 能。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗凝固处理是使用柠檬酸、肝素或水蛭素进行 的处理。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述血小板粘合面由胶原蛋白涂层制成。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述血小板粘合面由玻璃制成。
5.如权利要求1 4中任一项所述的方法，其中所述抗凝固处理的血液经受弱血小板 活化处理。
6.如权利要求5所述的方法，其中通过将所述抗凝固处理的血液与未引起不可逆血小 板凝集的量的血小板活化试剂混合来进行所述弱血小板活化处理。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述血小板活化试剂是腺苷二磷酸，它与所述抗凝 固处理的血液混合至浓度为0. 001 5 μ Μ。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述血小板活化处理是花生四烯酸，它与所述抗凝 固处理的血液混合至浓度为0. 001 ImM。
9.如权利要求1 8中任一项所述的方法，其中所述毛细管内部的至少一部分具有包 括流路分割壁的流路分割部，所述流路分割壁沿着在所述毛细管内的血液流动方向延伸并 将所述毛细管的宽度分割成多个流路。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述流路分割部的各流路的宽度为10 200μ m。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述血小板粘合面设置在所述毛细管的流路 分割部中。
12.如权利要求1 11中任一项所述的方法，其中所述毛细管形成在微芯片内。
13.如权利要求1 12中任一项所述的方法，其中利用泵将所述抗凝固处理的血液导 入所述毛细管内，并利用压力传感器测量因血液流入所述毛细管内而施加在所述泵上的压 力，从而检验血小板机能。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述抗凝固处理的血液保存在与所述毛细管和所 述泵连接的血液收容部内，通过利用所述泵将比重小于血液的液体导入所述血液收容部内 而将血液导入所述毛细管内，并测量所述液体的流入压力，从而间接测量因血液流入所述 毛细管内而施加的压力。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述抗凝固处理的血液保存在与所述毛细管和所 述泵连接的血液收容部内，通过利用所述泵将血小板活化试剂导入所述血液收容部内而在 所述血液收容部内将抗凝固处理的血液与血小板活化试剂混合，并将与所述血小板活化试 剂混合的血液导入所述毛细管内，同时测量所述血小板活化试剂的流入压力，从而间接测 量因血液流入所述毛细管内而施加的压力。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述血小板活化试剂与所述抗凝固处理的血液混 合使得所述血小板活化试剂在抗凝固处理的血液和血小板活化试剂的混合物中的浓度沿 着线性浓度梯度或阶跃浓度梯度增大。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中抗凝固处理的血液和血小板活化试剂的混合 物被搅拌。
18.—种血小板机能检验装置，其包括在至少内表面的一部分上具有血小板粘合面 的毛细管；和设置在所述毛细管的至少一部分上的流路分割部，所述流路分割部具有流路 分割壁，所述流路分割壁沿着在所述毛细管内的血液流动方向延伸并将所述毛细管的宽度 分割成多个流路。
19.如权利要求18所述的血小板机能检验装置，其中所述毛细管形成在微芯片内。
20.如权利要求19所述的血小板机能检验装置，其中不少于两个毛细管形成在微芯片内。
21.如权利要求20所述的血小板机能检验装置，其中所述各毛细管具有10 150μ m 和50 200 μ m范围的不少于2种的宽度。
22.如权利要求18 21中任一项所述的血小板机能检验装置，其中所述装置具有送液泵。
23.如权利要求19 22中任一项所述的血小板机能测定装置，其中所述装置具有照相 机，用于拍摄所述微芯片内部的图像。
24.如权利要求19 23中任一项所述的血小板机能检验装置，其中所述装置具有在所 述微芯片内部的血小板粘合面下游的废液贮存部，所述废液贮存部用于保存已经通过所述 血小板粘合面的血液废液。
25.如权利要求M所述的血小板机能检验装置，其中所述废液贮存部的深度不小于 100 μ m0
26.如权利要求M或25所述的血小板机能检验装置，其中在所述废液贮存部的位置处 设置贯通至所述微芯片外部的孔。
27.如权利要求沈所述的血小板机能检验装置，其中在相应于所述微芯片的表面上的 孔的位置设置血液吸收材料。
全文摘要
本发明公开一种检验血小板机能的方法，其中通过使已经与弱血小板活化试剂混合的抗凝固处理的血液经过在至少内表面的一部分上具有血小板粘合面的毛细管，并观察或测定血液在所述毛细管内的行为来检验血小板机能。
文档编号G01N33/49GK102150042SQ200980135990
公开日2011年8月10日 申请日期2009年8月11日 优先权日2008年8月11日
发明者寺田真纪, 深泽征司, 细川和也 申请人:藤森工业株式会社
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