专利名称：一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片细胞核提取方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞核提取方法，具体地说，涉及一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片细胞核提取方法。属于细胞生物学领域。
背景技术：
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是利用流式细胞仪(flowcytometer)分析测定细胞核DNA含量的方法。流式细胞仪是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测分析仪器，被誉为实验室的“CT”。 该技术可对处于快速流动中的微小生物颗粒(细胞、细胞核、染色体等)进行多参数、快速定量分析和分选。在植物遗传和育种研究中，则可用于植物倍性鉴定、细胞核DNA数量(基因组大小)测定、生殖途径鉴定等。但是，由于植物细胞核的悬液制备困难，致使该技术在植物细胞生物学中的应用较为滞后。利用流式细胞仪可快速准确地鉴定各种植物的倍性，但分析鉴定的结果受到待检样品细胞核提取的浓度和纯度影响，如果样品核悬液中细胞核的浓度太低，则在分析图中出现的峰会很低，令结果无法判断；如果样品核悬液中杂质较多，分析图中出现的峰较宽， 杂质峰高，同样无法准确判断结果，因此待检样品细胞核提取的浓度和纯度决定流式细胞仪分析结果的可靠性。在已报道的研究中，普遍要求植物材料必须是嫩叶或幼嫩的茎尖组织，所以目前国内外在进行流式分析时样品的选择都以幼嫩组织为好，是因为其可以避免老组织内含有较高浓度的淀粉、多糖、磷酸钙和其他一些新陈代谢之类的粘性物质，而这些物质分布在细胞质中，使得细胞质紧密地和细胞核粘在一起，影响了细胞核的纯度，这些物质同时也加速了细胞核的老化，增加了样品的粘度，阻碍了流式细胞仪中鞘液的流动，使得其不能准确地检测出待测样品的倍性，因此流式细胞仪分析的准确性与植物细胞核提取方法有直接关系。由于粘度过高的植物材料，材料状态、取材部位和细胞核提取方法直接影响流式细胞仪的检测结果，目前基本上采取选择新鲜、幼嫩的植物材料并通过提取方法的改进来消除材料本身的粘性。李赞(1998)等苹果、草莓采取的是试管苗嫩茎或幼叶；刘庆忠 (2001)等人用离体苹果新梢叶片，测定样品单个细胞核的DNA总量；刘继红Q003)以二倍体粗柠檬幼嫩叶片为材料，尽管朱道圩O007)为了防止中华称猴桃叶中酚类和粘性物质的干扰，在前人工作基础上，修改和优化了细胞核提取液配方和提取方法，仍然采用的是猕猴桃不定芽苗顶部叶片。目前报道的实验方法局限于采用幼叶或其他幼嫩组织，发明人也利用前人的缓冲液和提取方法来准备细胞核悬液，用流式细胞仪分析苹果、葡萄、草莓和菠萝等的试管苗和幼嫩叶片，取得了很好的检测效果。但在分析田间苹果样品或细胞内黏性过高的样品时，测定效果较差，而且容易堵塞仪器管道。在我们收到外单位送检的样品中，85%都是较老的田间材料，以成熟叶片居多。选择新鲜、幼嫩的材料在果树生产、育种中仅仅局限于初春刚萌
3发的叶片和试管苗，因此利用流式细胞仪进行分析受到极大的限制。由此针对这些问题并借助前人的经验，发明人进行了细胞核提取液配方优化和提取方法的改进，旨在延长流式细胞分析周期，提高DNA分辨率，增加样品检测的准确性和成功率，降低核悬液中杂质的浓度，减少杂质对流式细胞分析的影响，并且在分析的过程中， 不会堵塞仪器管道，有利于流式细胞仪的保养。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片的细胞核提取方法， 该方法可延长流式细胞分析周期，提高DNA分辨率，增加样品检测的准确性和成功率，降低核悬液中杂质的浓度，减少杂质对流式细胞分析的影响，并且在分析的过程中，不会堵塞仪器管道，有利于流式细胞仪的保养。为了实现本发明目的，本发明提供一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片的细胞核提取方法，其所用的细胞核提取液组分为15-20mmol/L Tris，40_60mmol/L 的 KC1，10_20mmol/L 的 NaCl，2_5mmol/L 的 Na2EDTA, 10-20mmol/L MgSO4,40_50mmol/L 蔗糖和 0· 5_1· 0 % (v/v) Triton X-100，加 ddH20(去离子水)至200ml，调pH为7. 5-8后，加入200 μ 1的15mmol/L巯基乙醇。本发明所述细胞核提取方法中所用的染色缓冲液为在细胞核提取液中加入20mg/ L的RNA酶A和20mg/L PI (碘化丙啶)(即IL细胞核提取液中加入20mg的RNA酶A和 20mg PI)。本发明所述细胞核提取方法，其包括如下步骤1)先将果树成熟叶片用5-10% (V/V)次氯酸钠处理10-15分钟，再用预冷的乙醚处理30-50秒，并用所述细胞核提取液漂洗3-5次；2)然后将步骤1)处理的果树成熟叶片与所述细胞核提取液进行研磨，400-600目筛网过滤，滤液在1-4°C下离心(1500-2000rpm)5-10分钟，用所述细胞核提取液漂洗3_5 次，收集沉积细胞核；3)再用所述染色缓冲液进行悬�。椅潞诎荡Ψ胖茫旧�15-30min。步骤2)中每200mg叶片中加入l_2mL细胞核提取液。步骤3)中每200mg叶片用400-600 μ 1所述染色缓冲液进行悬浮。本发明所述细胞核提取过程均需在冰上进行操作，其可用于防止细胞核的完整和细胞核DNA降解。细胞核分离缓冲液的组成不仅与DNA含量分辨率有关，而且还会影响细胞核从细胞质中释放、分离后细胞核的完整性，以及DNA的染色。本发明采用果树成熟叶片，通过改良细胞核提取液配方和改进细胞核提取方法，获得了很好的检测结果。本发明在细胞核提取液中添加蔗糖有利于维持细胞核的完整性并防止它们聚集， 提高Triton X-100的处理浓度到1.0% (ν/ν)，促使细胞质分散并选择性地溶解叶绿体膜， 也有利于在核膜上打孔，以便荧光染料顺利进入；在细胞核提取之前，先用5-10%次氯酸钠处理10分钟，再用预冷的乙醚处理样品30秒，明显提高了细胞核的产量，利用流式细胞仪进行分析，取得了就较好的检测效果。本发明的方法适用品种及材料种类范围广，获得的细胞核纯度高，提取过程需要时间短，不会造成细胞核降解，有利于进行流式细胞分析，获得的流式图谱中峰细而高，受杂质峰的影响�。苋菀着卸洗熘参锏腄NA倍性。
图Ia为苹果采用现有缓冲液和提取方法进行流式细胞仪检测的图谱；图Ib为苹果采用本发明所述的缓冲液和提取方法进行流式细胞仪检测的图谱；图加为葡萄采用现有缓冲液和提取方法进行流式细胞仪检测的图谱；图2b为葡萄采用本发明所述的缓冲液和提取方法进行流式细胞仪检测的图谱；图3a为菠萝采用现有缓冲液和提取方法进行流式细胞仪检测的图谱；图北为菠萝采用本发明所述的缓冲液和提取方法进行流式细胞仪检测的图谱。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1采取田间富士苹果成熟叶片200mg，放入预冷的培养皿内，先用5%次氯酸钠处理10分钟，再加入3ml预冷的乙醚，30秒后立即倒去乙醚，迅速用冷的提取缓冲液洗涤 5次，放入加有2mL细胞核提取缓冲液的研钵中研磨，500目筛网过滤，滤液在4°C下离心 (2000rpm) 5分钟，漂洗3次，收集沉积细胞核。用400 μ 1染色缓冲液进行悬�。椅潞诎荡Ψ胖茫旧�30min，随即上机测定。细胞核提取液组分为15mmol/LTris，40mmol/L 的 KC1，20mmol/L 的 NaCl，5mmol/ L 的 Na2EDTA, IOmmo 1/L MgSO4, 50mmol/L 蔗糖和 1. 0% (v/v) Triton X-100，体积加 ddH20 至 200ml，调pH为7. 5后，加入200 μ 1的15mmol/L巯基乙醇。所用的染色缓冲液为在细胞核提取液中加入20mg/L的RNA酶A和20mg/L PI (碘化丙啶)。现有提取方法采取田间富士苹果成熟叶片200mg，放入预冷的培养皿内，放入加有2mL现有的细胞核提取缓冲液，用锋利的手术刀片将叶片切碎，再用500目筛网过滤，取 200 μ 1滤液并加入等量的染色缓冲液进行染色，15min后上机检测。现有的细胞核提取缓冲液15mmol/L的 Tris-HCl (pH7. 5)，80mmol/L 的 KCl， 20mmol/L 的 NaCl，20mmol/L 的 Na2EDTA, 15mmol/L 的巯基乙醇和 0. 05 % (ν/ν)的 Triton X-100。试验在河北省农林科学院昌黎果树研究所、国家苹果改良中心河北省分中心进行。所用机型为美国B-C(Beckman-C0Ulter)公司生产的Epics Altra流式细胞仪，光源为 15mff 488nm氩离子激光。经激发，染色的DNA分子促发荧光，测定装置测定其荧光强度，与测定装置相连的计算机分析软件即可对荧光强度进行分析，如图la、图Ib所示。图Ia中的杂质峰很高，所要检测的苹果细胞核DNA含量峰小且宽，直接影响了对其倍性的判断，经过对细胞和提取缓冲液改良和改进了提取方法，得到的图Ib显示，杂质峰的细胞核相对含量从153降低到66，所要检测的苹果细胞核DNA含量峰也明显变得细高， 从而很容易对所获得的结果进行分析。实施例2
采取田间玫瑰香、lt)和巨峰GX)葡萄成熟叶片200mg混合，先用8%次氯酸钠处理15分钟，再放入预冷的培养皿内，加入3ml预冷的乙醚，40秒后立即倒去乙醚，迅速用冷的提取缓冲液洗涤3次，放入加有ImL提取缓冲液的研钵中研磨，600目筛网过滤，滤液在 4°C下离心(2000rpm)5分钟，漂洗3次，收集沉积细胞核。用500 μ 1染色缓冲液进行悬�。� 室温黑暗处放置，染色15min，随即上机测定。细胞核提取液组分为20mmol/LTris，60mmol/L 的 KC1，10mmol/L 的 NaCl，2mmol/ L 的 Na2EDTA, 2Ommo 1/L MgS04，40mmol/L蔗糖和 0· 5% (v/v) Triton X-100，体积加 ddH20 (去离子水)至200ml，调pH为7. 8后，加入200 μ 1的15mmol/L巯基乙醇。染色缓冲液为在细胞核提取液中加入20mg/L的RNA酶A和20mg/L PI (碘化丙啶)。现有提取方法采取田间玫瑰香、说和巨峰GX)葡萄成熟叶片200mg，放入预冷的培养皿内，加入2mL现有的细胞核提取缓冲液，用锋利的手术刀片将叶片切碎，再用500 目筛网过滤，取200 μ 1滤液并加入等量的染色缓冲液进行染色，15min后上机检测。现有的细胞核提取缓冲液15mmol/L的 Tris-HCl (pH7. 5)，80mmol/L 的 KCl， 20mmol/L 的 NaCl，20mmol/L 的 Na2EDTA, 15mmol/L 的巯基乙醇和 0. 05 % (ν/ν)的 Triton X-100。所用的染色缓冲液为在细胞核提取液中加入20mg/L的RNA酶A和20mg/L PI (碘化丙啶)。如图2a、图2b所示。图加中出现的两个细胞核DNA含量峰都很低，杂质峰的细胞核相对含量达到167，说明用现有的细胞核提取缓冲液和提取方法，获得的细胞核悬浮液中杂质太多，经过改良细胞核提取液和改进提取方法，从图2b中可以看出，细胞核的浓度、纯度得到了提高。实施例3采取田间菠萝叶片200mg，先用10%次氯酸钠处理10分钟，再放入预冷的培养皿内，加入3ml预冷的乙醚，50秒后立即倒去乙醚，迅速用冷的提取缓冲液洗涤3次，放入加有 2ml提取缓冲液的研钵中研磨，400目筛网过滤，滤液在2°C下离心(1500r/min)、10分钟，漂洗3次，收集沉积细胞核。用600 μ 1染色缓冲液进行悬�。椅潞诎荡Ψ胖茫旧�30min，随即上机测定。如图3a、图北所示。细胞核提取液组分为20mmol/LTris，40mmol/L 的 KC1，10mmol/L 的 NaCl，5mmol/ L 的 Na2EDTA，20mmol/L MgSO4, 50mmol/L蔗糖和 1· 0% (v/v) Triton X-100，体积加 ddH20 (去离子水)至200ml，调pH为8. 0后，加入200 μ 1的15mmol/L巯基乙醇。染色缓冲液为在细胞核提取液中加入20mg/L的RNA酶A和20mg/L PI (碘化丙啶)。现有提取方法采取田间玫瑰香、lt)和巨峰GX)葡萄成熟叶片200mg，放入预冷的培养皿内，加入2mL现有的细胞核提取缓冲液，用锋利的手术刀片将叶片切碎，再用500 目筛网过滤，取200 μ 1滤液并加入等量的染色缓冲液进行染色，15min后上机检测。现有的细胞核提取缓冲液15mmol/L的 Tris-HCl (pH7. 5)，80mmol/L 的 KCl， 20mmol/L 的 NaCl，20mmol/L 的 Na2EDTA, 15mmol/L 的巯基乙醇和 0. 05 % (v/v)的 Triton X-100。
所用的染色缓冲液为在细胞核提取液中加入20mg/L的RNA酶A和20mg/L PI (碘化丙啶)。结果如图3a、!3b所示，图3a中获得的细胞核DNA含量峰较宽，几乎无法与杂质峰分开，从而无法对提取的细胞核含量进行分析，经过改良细胞核提取液和改进提取方法，从图北中可以看出，细胞核的浓度、纯度得到了提高，获得的峰变得高、细，不受杂质峰的影响，有利于对其进行分析。本发明筛选出一种适用于苹果成熟叶片细胞核流式细胞术分析的最佳缓冲液配方，改善苹果细胞核分离效果，为快速、正确鉴定苹果倍性提供了实验依据。并将其应用于葡萄和菠萝等果树田间叶片的倍性检测中，也取得了较好的检测结果，对比细胞核提取方法改进前和改进后的流式细胞分析结果，我们发现改进前的流式图谱中峰宽而低并受杂质峰的影响，很难对植物的DNA倍性进行判断，改进后的流式图谱中峰细而高，受杂质峰的影响�。苋菀着卸洗熘参锏腄NA倍性。因此改良的细胞核提取方法适用品种及材料种类范围广，获得的细胞核纯度高，提取过程需要时间短，不会造成细胞核降解，有利于进行流式细胞分析。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片细胞核提取方法，其特征在于，其所用的细胞核提取液组分为15-20mmol/L Tris, 40-60mmol/L 的 KCl，10_20mmol/L 的 NaCl，2_5mmol/L 的 Na2EDTA, 10-20mmol/L MgSO4,40_50mmol/L 蔗糖和 0. 5-1. 0% Triton X-100，体积加 ddH20 至 200ml， 调pH为7. 5-8后，加入200 μ 1的15mmol/L巯基乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞核提取方法中所用的染色缓冲液为在所述细胞核提取液内加入20mg/L的RNA酶A和20mg/L PI。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其包括如下步骤1)先将果树成熟叶片用5-10%(V/V)次氯酸钠处理10-15分钟，再用预冷的乙醚处理 30-50秒，并用所述细胞核提取液漂洗3-5次；2)然后将步骤1)处理的果树成熟叶片与所述细胞核提取液进行研磨，400-600目筛网过滤，滤液在1-4°C下1500-2000rpm离心5_10分钟，用所述细胞核提取液漂洗3_5次，收集沉积细胞核；3)用所述染色缓冲液进行悬�。椅潞诎荡Ψ胖茫旧�15-30min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中每200mg叶片中加入l_2mL细胞核提取液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中每200mg叶片用400-600μ1所述染色缓冲液进行悬浮。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞核提取过程均在冰上进行操作。
全文摘要
本发明提供了一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片细胞核提取方法，其所用的细胞核提取液组分为15-20mmol/L Tris，40-60mmol/L的KCl，10-20mmol/L的NaCl，2-5mmol/L的Na2EDTA，10-20mmol/L MgSO4，40-50mmol/L蔗糖和0.5-1.0％Triton X-100，体积加ddH2O至200ml，调pH为7.5-8后，加入200μl的15mmol/L巯基乙醇。本发明的方法适用品种及材料种类范围广，获得的细胞核纯度高，提取过程需要时间短，不会造成细胞核降解，有利于进行流式细胞分析，获得的流式图谱中峰细而高，受杂质峰的影响�。苋菀着卸洗熘参锏腄NA倍性。
文档编号G01N33/50GK102243150SQ201010175029
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者吴永杰, 吴雅琴, 李玉生, 程和禾, 赵艳华 申请人:河北省农林科学院昌黎果树研究所
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