专利名称：一种基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于重组表达流感病毒血凝素的真核 细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法。
背景技术：
特定血清型流感病毒感染、感染后恢复、隐性感染、以及疫苗接种的人或动 物，在其体液(如血清、支气管灌洗液、血浆、组织液等)中会出现流感病毒血凝素抗 体，通过检测特定血清型流感病毒的抗体，可以判断、诊断或确诊该人或该动物是否感 染(包括早期感染、隐性感染或感染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感 病毒疫苗、或评价其对特定血清型流感病毒的抵抗力等。目前检测待检样品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗体的方法，主要有 血凝抑制实验(HAI)和中和实验，即将某一特定血清型的流感病毒先与待检样品混合， 然后加入红细胞或敏感细胞中，判断待检样品是否能够抑制该病毒的血凝反应或细胞病 变效应来进行判定，其缺点是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隐患。在涉及病 毒的实验中，根据国家有关法规(国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》、卫 生部《人间传染的病原微生物名录》、《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验 活动生物安全审批管理办法》)及WHO的规定与建议，包括人H2N2以及部分禽流感病 毒的操作要求在BSL-III(P3)实验室进行，因此，上述方法的开展对实验室条件要求很 高，不适用于现场检测和规模检测。文献也有报道，利用表达流感病毒HA的假病毒颗粒来代替具有感染性的流感病 毒进行HAI实验，但技术过于复杂。除经典的HAI和中和实验外，也有用ELISA方法和乳胶凝集实验方法来进行检 测的报道。其中，ELISA方法是利用重组表达和纯化的流感病毒HA来检测相应的抗体， 这需要获保持抗原特异性的重组蛋白的表达与纯化，且由于流感病毒有众多亚型，即使 同种亚型的血清交叉反应强度不一，对不同血清型的HA抗原都进行重组蛋白的表达与 纯化，其工作量大、工艺要求高、批间稳定性差。乳胶凝集方法相对于现有的其它方法 (HAL·中和实验以及ELISA方法)而言，反应时间短、适合现场检测，但仍存在一些不 足。乳胶凝集实验方法是将重组表达和纯化的流感病毒HA蛋白偶联在惰性乳胶颗粒表 面，利用凝集反应进行检测流感病毒相应的抗体，这同样需要重组表达和纯化的流感病 毒HA，并需要获得保持抗原特异性的重组蛋白的表达与纯化，如需要检测不同血清型的 流感病毒HA抗体，就需要对不同毒株的HA进行重组表达和纯化，与ELISA方法一样， 存在工作量大、工艺要求高、批间稳定性差等问题。 由于检测流感病毒抗体对人或该动物是否感染(包括早期感染、隐性感染或感 染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感病毒疫苗、或评价其对特定血清 型流感病毒的抵抗力等有重要意义，而目前的HAI、中和实验、ELISA以及乳胶凝集等检测手段，或需要使用具有感染性的病毒，或需要特定的实验条件和设备，或工艺复 杂，或检测耗时长等缺点，因此，一种简便、快速、工艺相对简单易控的流感病毒抗体 检测方法具有广泛的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的检测流感病毒抗体技术中存在的工作量大、稳定性差、检测耗时长等问题，提供一种基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应 的流感病毒抗体的检测方法。本发明目的通过以下技术方案予以实现一种基于重组表达流感病毒血凝素(HA)的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体 检测方法，所述方法是将流感病毒血凝素基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表面重 组表达流感病毒血凝素蛋白，以此为凝集反应基质，该蛋白与待检样品中的流感病毒血 凝素抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应来检测待检样品中的流感病毒抗 体。流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感病 毒的HA可以分为16个亚型，同时，由于流感病毒HA的突变和进化，即使是同一亚型 的HA，其交叉反应性的强弱不一。因此，检测某一特定血清型流感病毒抗体时，使用 本发明的方法，将重组表达该特定血清型毒株的HA的真核细胞与待检样品进行凝集实验 即可。上述的流感病毒HA，是指甲型流感病毒的HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、 H8、H9、H10, HlU H12、H13、H14、H15、H16亚型，以及乙型流感病毒、丙型流 感病毒的血凝素，可以根据检测目的的需要使用某一特定血清型的HA或其部分。如是进行较广泛血清型的流感病毒抗体检测，则可以根据所检测的目的血清型 毒株的HA进行抗原性分析，选用抗原性保守或抗原交叉性强的HA蛋白的一部分进行 重组表达真核细胞的构建，利用凝集反应对较广泛血清型的流感病毒抗体检测。上述的 流感病毒HA，可以是某一流感病毒毒株HA或其中一部分，也可以是不同流感病毒毒株 的HA或其中一部分或不同HA的拼接或混合，也可以是对流感病毒HA进行了突变和修 饰，也可以是人工合成的天然不存在的序列，但其核心是重组表达产物具有流感病毒HA 的抗原性。上述的重组表达流感病毒血凝素(HA)的真核细胞，是指将编码有流感病毒HA 的基因片段导入真核细胞，在真核细胞表面重组表达流感病毒的HA。真核细胞可以是酵 母、哺乳动物细胞、昆虫细胞，以及其它的真核细胞，重组表达的流感病毒HA位于细胞 膜或细胞壁表面。其中，真核细胞优选哺乳动物细胞和昆虫细胞，其重组表达的流感病 毒血凝素可以有更为接近病毒感染人或动物所获得翻译后修饰、空间构型和抗原性，其 与流感病毒相应抗体的反应特异性更佳。进一步，优选哺乳动物细胞重组表达流感病毒 HA。重组表达可以是瞬时表达，也可以是稳定表达。编码有流感病毒HA的基因片段 可以是DNA，也可以是RNA，可以是单纯的含有启动子和编码序列的片段，也可以是质 粒，也可以是病毒载体，其可以仅编码流感病毒HA，也可以同时或独立混合编码其它蛋 白或多肽或肽段，其目的是将编码流感病毒HA的基因片段在真核细胞中获得重组表达。 导入真核细胞的方式可以使用电击、脂质体转染、病毒介导等，目的是将编码流感病毒HA的基因片段进入真核细胞以得到重组表达。上述的重组表达流感病毒血凝素(HA)的 真核细胞，其核心在于获得在细胞表面表达有流感病毒HA的真核细胞，其目的是利用所 表达HA的抗原性，通过凝集实验，检测流感病毒抗体。在本发明的一个实施方案中， 公布了重组表达流感病毒血凝素(HA)的真核细胞的方法。上述的重组表达流感病毒血凝素(HA)的真核细胞，作为用于凝集反应的颗粒 抗原基质，可以是天然的重组表达流感病毒血凝素的真核细胞，或是经过胰酶处理、机 械分散、酶解分散、神经氨酸酶处理、固定剂固定、稳定剂处理、防腐剂处理的等工艺 同时或选择性处理后的重组表达流感病毒血凝素的真核细胞，以更好的使“凝集反应基 质”进行保存、防止自凝、增加凝集反应检测的灵敏性和稳定性。在本发明的一个实施 方案中，公布了重组表达流感病毒血凝素(HA)的真核细胞的处理方法，以提高凝集反应 检测的灵敏性和稳定性。作为一种优选方案，所述流感病毒血凝素抗体为IgG、IgM> IgA、IgE> IgD中
的一种或几种的混合物。作为一种优选方案，所述真核细胞为酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞或其它真 核细胞，重组表达的流感病毒血凝素位于细胞膜或细胞壁表面。作为一种优选方案，所述待检样品为人或动物的体液，如血清、支气管灌洗 液、血浆或组织液。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明是以重组表达流感病毒HA的细胞为载体，利用凝集反应，检测待检样品 中是否存在相应流感病毒的抗体。利用RT-PCR克隆特定血清型流感病毒的HA基因或其 片段，构建真核表达载体，转染真核细胞，细胞表面会存在重组表达的HA，经醛化固定 后，该细胞即成为表面含有HA抗原的致敏颗粒，与待检样品混合后，如待检样品中含有 流感病毒的抗体，即会在数分钟发生凝集反应。该方法不涉及具有感染性的病毒颗粒； 相比ELISA、HAI和中和实验所需的数小时至数天，重组表达HA的细胞凝集反应仅需数 分钟，反应时间快速；利用通用引物和载体可对不同血清型的HA基因进行克隆与转染 表达，即可得到不同HA抗原的致敏细胞颗粒，可以更加广泛地对不同血清型流感病毒进 行检测。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。 实施例1重组表达流感病毒血凝素(HA)的真核细胞的制备本实施例以一株H5 亚型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1) 为例，进行重组表达流感病毒血凝素HA真核表达细胞的制备。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在广东省的鸡中分离得到的一株H5N1亚型流感 病毒，其HA的基因序列可在公共数据库GenBank上获得，其序列号为EU874899.2。 将该株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit提取病毒RNA，用Uni_12弓丨物 (5’ -AGCAAAAGCAGG-3‘)和 SuperScript III 或 M-MLV 逆转录酶进行逆转录，得到 病毒cDNA。根据该毒株HA的基因序列，设计一对用于HA全长基因克隆的引物，其引物序列具体如下上游引物H5HA-F，序列为5’ -GCAAAGCTTACCATGGAGAAAAT ACTTCTTC-3’，从5’端依次为3个保护性碱基、HindIII酶切位点、KOZAK序列、 起始密码子和配对区；下游引物H5HA-R，序列为5’ -CTCGGATCCTTAAATGCAAATT CTGCATTGTAAG-3，，从5’端依次为3个保护性碱基、BamH I酶切位点、终止密码
子和配对区 。利用这对引物，用高保真Taq酶对病毒cDNA进行PCR扩增，扩增HA片 段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，与表达载体pcDNA3分别进行使用Hind III和 BamH I双酶切，再次电泳回收后利用T4DNA连接酶将酶切回收后的HA片段与载体进行 连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布Amp抗性平板。菌落经PCR后，提取质粒 酶切鉴定和DNA测序，获得含有HA基因片段的真核表达质粒，即pcDNA-H5HA。含有pCDNA-H5HA质粒的细菌，经含有50 μ g/ml的氨苄青霉素(Amp)的LB培 养过夜后，用高纯度质粒提取试剂盒提取pcDNA-H5HA质粒。根据Lipofectamine 2000 试剂盒说明，将3 μ g pcDNA-H5HA质�：�10 μ 1 Lipofectamine2000转染复合物，转染一 个35mm直径培养皿含有生长密度约为80% -90%融合率的人胚肾HEK-239细胞，转染 后6h去除转染复合物，更换新鲜的完全培养基(含有10%胎牛血清的DMEM培养基)。转染后，HEK-239细胞即可瞬时重组表达HA，即得到瞬时重组表达流感病毒 HA的细胞。为进一步优化，可以筛选获得稳定重组表达HA的细胞在转染72h后将转染细 胞吹打分散，将细胞悬液的1/20接种一个新的35mm直径培养皿中，补充完全培养基至 3ml，经过夜贴壁后，补加G418至浓度为600 μ g/ml。此后每3至5天的更换一次含有 600 μ g/ml G418的完全培养基，约3周后可见筛选出现的抗性细胞集落。将抗性细胞集 落经胰酶消化后，按10-20个细胞/ml接种96孔板培养，加入含有600 μ g/ml G418的完 全培养基培养至长至单层后，进行传代，获得用于检测的备份培养96孔板。将检测用的 96孔板的细胞用4%多聚甲醛室温固定5分钟，经PBS漂洗后，加入抗H5亚型HA的抗 体为一抗、Cy3荧光标记的二抗进行免疫荧光检测，选择荧光阳性信号强、荧光阳性细 胞比例高的孔，对细胞继续重复的克隆化和免疫荧光，至阳性细胞比例接近100%，即可 得到稳定重组表达该毒株HA的细胞。实施例2重组表达流感病毒血凝素(HA)的真核细胞的处理瞬时或稳定重组表达该毒株HA的细胞，经培养后，用低浓度胰酶(0.05% )温 和消化细胞约5分钟，加入含有胎牛血清的培养基终止反应，将细胞悬液进行离心，去 除上清后用含有2% BSA的PBS进行重悬，获得胰酶处理后的细胞悬液。为防止HA可能引起的细胞自凝集，在胰酶处理后的细胞悬液中加入神经氨酸酶 (又称神经氨酸苷酶，Neuraminidase)进行处理，消除重组表达的HA与细胞自身受体的 作用，避免细胞自身凝集。即，将细胞悬液经离心后，用50mM柠檬酸钠(pH6.0)缓冲 液，将细胞按IO7个/ml进行重悬，每ml细胞悬液中加入200单位的神经氨酸酶，于37°C 条件下处理30分钟后离心，去除上清，用等体积的PBS重悬、离心进行洗涤2次，再次 加入等体积的PBS。上述经胰酶和神经氨酸酶处理的细胞悬液，加入等体积的10%的冷甲醛，于 4°C固定2小时。经离心、PBS重悬的方式进行3次洗涤。最后将细胞沉淀，按IO7个/ ml的浓度重悬于含有0.2%尼泊尔金酯、2%BSA、20%甘油的PBS缓冲液中，使其能够稳定地长时间保存，即得到了处理后的重组表达HA抗原的真核细胞。实施例3使用重组表达流感病毒血凝素的真核细胞进行凝集反应检测流感病毒 抗体将实施例2中的处理后的重组表达HA抗原的真核细胞悬液1滴(约50 μ 1)加 到洁净的载玻片上，然后加入50μ1的待检样品(血清、支气管灌洗液、血浆、组织液 等)，前后左右轻轻晃动载玻片或使用微量移液器吸头将其混勻，室温下1-3分钟观察是 否出现细胞凝集。 设立阳性血清和阴性血清对照，如对照样品符合预期结果，待检样品发生未凝 集时，说明待检样品中不含有与该毒株HA具有反应性的流感病毒HA抗体或抗体浓度低 于该方法所能达到的检测浓度。待检样品发生凝集时，说明待检样品中含有与该毒株HA具有反应性的流感病毒 HA抗体。此时可以进一步进行相对定量分析，即，将待检样品1进行连续的倍比稀释， 然后分别与实施例2中的处理后的重组表达HA抗原的真核细胞悬液进行凝集反应，得到 所能发生凝集的最高稀释度，设为dl。同样方法可得到待检样品2的凝集反应阳性最高 稀释度d2。以此横向比较不同待检样品中流感病毒HA抗体的浓度差异和相对比例。
权利要求
1.一种基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方 法，其特征在于所述方法是将流感病毒血凝素基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表 面重组表达流感病毒血凝素蛋白，以此为凝集反应基质，该蛋白与待检样品中的流感病 毒血凝素抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应来检测待检样品中的流感病 毒抗体。
2.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感 病毒抗体的检测方法，其特征在于所述流感病毒血凝素为完整全长的流感病毒血凝素蛋 白，或者是流感病毒血凝素蛋白的一部分，或者是流感病毒血凝素的抗原表位，或者是 将流感病毒血凝素蛋白或部分肽段中的部分氨基酸进行突变或修饰。
3.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病 毒抗体的检测方法，其特征在于所述重组表达流感病毒血凝素为单独的流感病毒血凝素 蛋白或部分肽段，或者是与其它蛋白、多肽、肽段进行融合表达或共同独立表达。
4.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病 毒抗体的检测方法，其特征在于所述重组表达为瞬时表达或者是稳定表达。
5.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病 毒抗体的检测方法，其特征在于所述真核细胞表面重组表达的血凝素为甲型流感病毒的 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、 H16亚型、乙型流感病毒或丙型流感病毒的血凝素。
6.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病 毒抗体的检测方法，其特征在于所述凝集反应基质为天然的重组表达流感病毒血凝素的 真核细胞，或者是经过胰酶处理、机械分散、酶解分散、固定剂固定、稳定剂处理、防 腐剂处理的方法同时或选择性处理后的重组表达流感病毒血凝素的真核细胞。
7.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病 毒抗体的检测方法，其特征在于所述流感病毒血凝素抗体为IgG、IgM, IgA、IgE、IgD 中的一种或几种的混合物。
8.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病 毒抗体的检测方法，其特征在于所述真核细胞为酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞或其它 真核细胞，重组表达的流感病毒血凝素位于细胞膜或细胞壁表面。
9.根据权利要求1 8中任意一条权利要求所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真 核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法，其特征在于所述待检样品为人或动物的体 液。
10.根据权利要求9所述的基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感 病毒抗体的检测方法，其特征在于所述体液为血清、支气管灌洗液、血浆或组织液。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于重组表达流感病毒血凝素的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法。本发明检测方法是将流感病毒血凝素基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表面重组表达流感病毒血凝素蛋白，该蛋白与待检样品中的流感病毒血凝素抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应来检测待检样品中的流感病毒抗体。本发明检测方法快速、稳定，可以更广泛、快速地检测不同血清型的流感病毒抗体。
文档编号G01N33/569GK102023215SQ201010297219
公开日2011年4月20日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者李康生, 李蕊, 王革非 申请人:汕头大学医学院
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