专利名称：诊断病毒感染的方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断病毒感染的方法和用于判断的试剂盒。
背景技术：
自从1928年发现青霉素以来，就有可能通过抗生素治疗大量的细菌感染，所述抗生素相继问世并且完善。不过，这一事实并不意味着包括细菌感染在内的所有感染都可以治疗。很多感染患者仍然需要治疗，并因此一直需要开发用于选择治疗方法的诊断方法。不过，在目前阶段，在临床上还没有用于区分细菌感染和病毒感染的明确而且快速的方法。
迄今为止，为了区分患者的细菌感染和其他感染，采用了患者的症状、外周血白细胞数量和C-反应蛋白值。所述C-反应蛋白是急性期反应物质之一，并且已知是用于诊断和逐步观察各种感染的指标。在健康成年人血液中，所述C-反应蛋白值为0.006mg/dL。当血液中所述C-反应蛋白值为1-10mg/dL时，被诊断为中度增加的疾�。⑶遥彼鲋滴�10mg/dL或更高时，被诊断为高度增加的疾病。当所述诊断是中度增加的疾病时，除了细菌感染之外，还怀疑患有慢性风湿�。苎祝缡龋裥灾琢觯募」Ｈ屯馍�。另外，当所述诊断是高度增加的疾病时，怀疑患有严重细菌感染和活动的风湿病[Clinical Test Method Summary(RinshoKensa Ho Teiyo)，出版者Kanehara Shuppan，500(1998)]。
如上文所述，利用用于诊断细菌感染的血液中的C-反应蛋白值难于理想地诊断细菌感染。
最近，作为病毒感染的特异性指标，MxA蛋白引起了人们的注意。MxA蛋白是由I型干扰素(IFN-α和IFN-β)在淋巴细胞内诱导的，在病毒感染时这种蛋白会增加，但是根本不受诸如IL-1，IL-6和TNF-α的其他炎性细胞因子的影响，这些细胞因子的产量在细菌感染和慢性炎性疾病中会增加[Eur J Immunol，20，2015(1990)]。因此，业已考虑将MxA蛋白在淋巴细胞中的表达用于检测所有病毒感染，并且报道了其临床应用的可能性。[Pediatr Res，41，647(1997)]。
在医学领域，存在这样的倾向将抗生素用于被怀疑患有细菌感染的患者[JAMA，273，213(1995)]。抗生素的这种应用导致了出现多种抗药性细菌的严重问题，如能够抗各种抗生素的甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。
抗生素的适当应用，预计不仅能够预防抗多种药物的细菌的出现，而且还能够抑制医疗成本的增加，这在目前也被认为是一个问题[Pedicatrics，108，1(2001)]。因此，明确区分病毒感染和细菌感染是重要的，但是，区分这两种感染的方法至今尚属未知。
发明内容
本发明的目的是提供用于诊断没有合并细菌感染的病毒感染的方法和用于所述诊断的试剂盒。
本发明涉及用于诊断没有合并细菌感染的病毒感染的方法，该方法包括测定生物学样品中的C-反应蛋白和MxA蛋白。
另外，本发明涉及用于诊断没有合并细菌感染的病毒感染的试剂盒，包括用于测定生物学样品中的C-反应蛋白的试剂和用于测定生物学样品中的MxA蛋白的试剂。
为了诊断没有合并细菌感染的病毒感染，测定所述C-反应蛋白和MxA蛋白。
所述用于测定C-反应蛋白的方法没有特别限制，只要它是于测定C-反应蛋白的方法就行。例子包括利用抗C-反应蛋白的抗体的免疫学测定方法。作为免疫学测定方法，包括任何方法，只要它利用抗原-抗体反应就行，如免疫测定，免疫印迹方法，凝集反应，补体-固定反应，溶血反应，沉淀反应，金胶体方法，层析方法或免疫染色方法，并且优选免疫测定。
所述免疫测定是通过利用各种标记过的抗原或抗体检测或测定抗体或抗原的方法。所述方法包括放射免疫测定(RIA)，酶免疫测定(EIA或ELISA)，荧光免疫测定(FIA)，发光免疫测定，物理化学测定(TIA，LAPIA，PCIA)，和流式细胞术等，这些方法的使用取决于标记所述抗原或抗体的方法。作为用于测定C-反应蛋白的方法，优选物理化学测定。
具体地讲，所述测定方法是通过将作为抗原的C-反应蛋白与抗体或抗血清结合而进行的，所述抗体特异性地结合在所述C-反应蛋白上，以便形成凝集物，并且检测所述凝集物。其他物理化学测定包括利用毛细管方法进行测定的方法，一维免疫扩散方法，免疫浊度测定，或乳胶免疫浊度测定等[Clinical Test Method Summary(Rinsho Kensa Ho Teiyo)，出版者Kanehara Shuppan，499(1998)]。
例如，在乳胶免疫浊度测定中，当抗原抗体反应是在通过利用相应的抗原或抗体进行过抗体或抗原固定的粒度为约0.1-1μm的聚苯乙烯乳胶上诱导时，在反应混合物中的散射光加强，而透射光减弱。所述C-反应蛋白可以通过测定吸光度或累计球浊度的改变确定。用于测定C-反应蛋白的具体试剂包括由Kyowa Medex公司生产的Determiner T CRP和ExtelCRP，和由Nitto Boseki公司生产的N-Assay TIA-CRP-H试剂盒等。
用于测定MxA蛋白的方法没有特别限制，只要它是于测定MxA蛋白的方法就行。例子包括利用抗MxA蛋白的抗体的免疫学测定方法。作为免疫学测定方法，可以使用任何方法，只要它利用抗原-抗体反应就行，如免疫测定，免疫印迹方法，凝集反应，补体-固定反应，溶血反应，沉淀反应，金胶体方法，层析方法或免疫染色方法。作为用于测定MxA蛋白的方法，优选免疫测定。
所述免疫测定是通过利用各种标记过的抗原或抗体检测或测定抗体或抗原的方法。所述方法包括放射免疫测定(RIA)，酶免疫测定(EIA或ELISA)，荧光免疫测定(FIA)，发光免疫测定，物理化学测定(TIA，LAPIA，PCIA)，和流式细胞术等，这些方法的使用取决于标记所述抗原或抗体的方法，并且优选流式细胞术。
作为用于流式细胞术的荧光标记，可以使用任何已知的荧光标记(Akira Kawaoi，荧光抗体方法(Keiko Koutai Ho)，由Soft ScienceInc.出版)。例如，可以使用FITC，和RITC等。
具体地讲，让能够特异性地结合MxA蛋白的抗体或抗血清与进行石蜡固定的外周淋巴细胞反应，然后让在所述淋巴细胞中表达的能特异性地结合MxA蛋白的抗体与荧光标记的合适的第二抗体反应，并且通过流式细胞术检测荧光强度的差异[WO96/05230，Allergy，56，895(2001)]。
本发明的用于诊断没有合并细菌感染的病毒感染的试剂盒，包括用于测定C-反应蛋白的试剂和用于测定MxA蛋白的试剂。本发明的试剂盒可以是用于测定C-反应蛋白的试剂和用于测定MxA蛋白的试剂的各个独立试剂盒的组合，以及将用于测定C-反应蛋白的试剂和用于测定MxA蛋白的试剂包括在一个试剂盒中的试剂盒。另外，在将用于测定C-反应蛋白的试剂和用于测定MxA蛋白的试剂包括在一个试剂盒中的试剂盒中，各个试剂的共同试剂可以共同使用。所述共同试剂包括用于生物学样品的稀释溶液，抗体固定的固相，反应缓冲液，洗涤液，标记过的第二抗体或其抗体片段，和用于检测标记的试剂等。本发明的试剂盒可以与适用于测定的工具组合，以便形成其他试剂盒。
即使结构或形式不同，任何试剂盒都包括在本发明的试剂盒中，只要它包括基本上与用于测定C-反应蛋白的试剂或用于测定MxA蛋白的试剂的独立组成成分相同的物质或基本上与它的一部分相同即可。
用于测定C-反应蛋白的试剂包括与C-反应蛋白反应的抗体，并且，如果必要的话，还包括用于生物学样品的稀释溶液，抗体固定的固相，反应缓冲液，洗涤液，标记过的第二抗体或其抗体片段，用于检测标记的试剂，和C-反应蛋白的标准物质等。
与C-反应蛋白反应的抗体没有特殊限制，只要它是C-反应蛋白反应的抗体就行，并且，其例子包括可通过商业渠道获得的山羊，兔、大鼠等的抗人C-反应蛋白多克隆抗体，以及鼠抗人C-反应蛋白单克隆抗体(由SIGMA公司生产)。
所述用于生物学样品的稀释溶液包括含有诸如BSA或酪蛋白的蛋白，还包括表面活性剂的水溶液和缓冲液等。
所述抗体固定的固相包括一种固相，其中，将抗体或抗体片段固定在通过对各种聚合材料塑形获得的材料上，以便适合所述用途。所述形状包括管，珠，片，细微颗粒，如乳胶，和棒等。所述材料包括聚合物材料，如聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚乙烯甲苯，聚丙烯，聚乙烯，聚氯乙烯，尼龙，聚甲基丙烯酸酯，明胶，琼脂糖，纤维素和聚对苯二甲酸乙二酯，玻璃，陶瓷，和金属等。作为固定抗体的方法，采用了已知方法，例如，物理方法，化学方法，或它们的组合。例子包括通过将抗体等疏水性地固定在用聚苯乙烯制成的用于免疫测定的96孔微量滴定板上获得的固相。
所述反应缓冲液可以是任何缓冲液，只要它能够与生物学样品中的抗原结合就行，并且，例子包括磷酸缓冲液，和Good缓冲液等。另外，如果必要，可以添加表面活性剂，诸如BSA或酪蛋白的蛋白，防腐剂，稳定剂和反应加速剂等。
所述洗涤溶液包括含有0.05％的Tween20等的磷酸缓冲液盐水(以下称之为“PBS”)。另外，如果必要，可以添加表面活性剂，诸如BSA或酪蛋白的蛋白，防腐剂，或稳定剂等。
标记过的第二抗体或其抗体片段包括通过将诸如辣根过氧化物酶，牛小肠碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶的标记酶结合在抗体或抗体片段上获得的抗体或抗体片段。如果必要，可以向第二抗体或其抗体片段中添加缓冲液，诸如BSA或酪蛋白的蛋白，或防腐剂等。
作为用于检测如上述标记酶的标记的试剂，例如，用于吸光度测定的物质，如对四甲联苯胺或邻苯二胺，荧光底物，如羟苯基羟苯丙酸酯或羟苯乙酸酯，或发光底物，如可以将鲁米诺用于辣根过氧化物酶，以及用于吸收光度测定的底物，如4-硝基苯基磷酸酯，荧光底物，如4-methylumbeliferyl phosphate等可用于碱性磷酸酶。
所述标准物质包括通过重组DNA技术获得的或从表达C-反应蛋白的生物学样品，细胞等中获得的C-反应蛋白。
用于测定MxA蛋白的试剂包括与MxA蛋白反应的抗体，并且，如果必要的话，还包括用于生物学样品的稀释溶液，抗体固定的固相，反应缓冲液，洗涤液，标记过的第二抗体或其抗体片段，用于检测标记的试剂，和MxA蛋白的标准物质等。
与MxA蛋白反应的抗体没有特殊限制，只要它是与MxA蛋白反应的抗体就行，并且，其例子包括通过杂交瘤FERM BP-4731生产的抗MxA蛋白抗体KM1135(WO96/05230)。
所述用于生物学样品的稀释溶液包括含有诸如BSA或酪蛋白的蛋白，还包括表面活性剂的水溶液和缓冲液等。
所述抗体固定的固相包括一种固相，其中，将抗体或抗体片段固定在通过对各种聚合材料塑形获得的材料上，以便适合所述用途。所述形状包括管，珠，片，细微颗粒，如乳胶，和棒等。所述材料包括聚合物材料，如聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚乙烯甲苯，聚丙烯，聚乙烯，聚氯乙烯，尼龙，聚甲基丙烯酸酯，明胶，琼脂糖，纤维素和聚对苯二甲酸乙二酯，玻璃，陶瓷，和金属等。作为固定抗体的方法，采用了已知方法，例如，物理方法，化学方法，或它们的组合。例子包括通过将抗体等疏水性地固定在用聚苯乙烯制成的用于免疫测定的96孔微量滴定板上获得的固相。
掺入所述用于测定MxA蛋白的试剂中的反应缓冲液可以是任何缓冲液，只要抗体固定的固相的抗体能够与生物学样品中的抗原结合就行，并且，例子包括磷酸缓冲液，和Good缓冲液等。另外，如果必要，可以添加表面活性剂，诸如BSA或酪蛋白的蛋白，防腐剂，稳定剂和反应加速剂等。
所述洗涤溶液可以是任何洗涤溶液，只要它能够洗涤不参与用于测定MxA蛋白的抗原-抗体反应的成分就行，例子包括胎牛血清和含有0.1％的叠氮化物等的PBS。另外，如果必要，可以添加缓冲液，表面活性剂，诸如BSA或酪蛋白的蛋白，防腐剂，或稳定剂等。
标记过的第二抗体或其抗体片段包括通过将诸如辣根过氧化物酶，牛小肠碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶的标记酶结合在抗体或抗体片段上获得的抗体或抗体片段。如果必要，可以向第二抗体或其抗体片段中添加缓冲液，诸如BSA或酪蛋白的蛋白，或防腐剂等。
作为用于检测如上述标记酶的标记的试剂，例如，用于吸光度测定的物质，如对四甲联苯胺或邻苯二胺，荧光底物，如羟苯基羟苯丙酸酯或羟苯乙酸酯，或发光底物，如可以将鲁米诺用于辣根过氧化物酶，以及用于吸收光度测定的底物，如4-硝基苯基磷酸酯，荧光底物，如4-methylumbeliferyl phosphate等可用于碱性磷酸酶。
标准物质包括通过重组DNA技术获得的或从表达MxA蛋白的生物学样品，细胞等中获得的MxA蛋白。
例如，作为用于本发明的生物学样品，可以使用血液。
在本发明中，测定了C-反应蛋白和MxA蛋白，并且根据每种观察值判断是否存在C-反应蛋白和MxA蛋白的表达，以便诊断没有合并细菌感染的病毒感染。
在这种情况下，C-反应蛋白阴性和MxA蛋白阳性的病例被诊断为没有合并细菌感染的病毒感染。另一方面，C-反应蛋白阳性和MxA蛋白阴性的病例被诊断为没有合并病毒感染的细菌感染。C-反应蛋白阳性和MxA蛋白阳性的病例被诊断为合并细菌感染的病毒感染。C-反应蛋白阴性和MxA蛋白阴性的病例被诊断为未知。
在本发明中，判断C-反应蛋白和MxA蛋白的每种观察值为阴性或阳性的标准，可以根据测定方法适当的确定。例如，当血液中的C-反应蛋白是通过免疫测定方法测定时，所述诊断是通过将低于1.0mg/dl的值视为阴性，并且将1.0mg/dl或更高的值视为阳性进行的。另外，当MxA蛋白是通过免疫测定方法测定时，获得了没有出现病毒感染的健康人的平均值和标准差，并且，所述诊断是通过将所述平均值+3SD或更高的值视为阳性，并且将低于上述值的值视为阴性进行的。
下面示出了具体实施例。
实施本发明的最佳方式实施例1以下测定是利用被怀疑患有任何感染的74个人的外周血样品进行的，并且从这些人体内采集血液样品用于各种测定。
将采集到的血液样品马上注射到血清提交唾液试管(serum-submitting spits tubes)中，用于测定C-反应蛋白值，并且用于其他一般测定，并且注射到装有肝素钠的唾液试管中，用于测定MxA蛋白，并且在当天处理。
血液中的C-反应蛋白值是通过使用由Nitto Boseki公司生产的N-ASSAY TIA CRP-H试剂盒，按照试剂盒附带的方法测定的。观察到的血液中C-反应蛋白值，是通过使用1.0mg/dl的值作为标准值，并且将低于1.0mg/dl的值视为阴性，将1.0mg/dl或更高的值视为阳性判断的。
按照以下方法分析MxA蛋白在淋巴细胞中的表达。
在用肝素收集200μl的外周血之后，用4％的低聚甲醛固定，用含有0.1％Triton X-100的裂解缓冲液破坏红细胞，并且使淋巴细胞膜透化。然后，用通过杂交瘤细胞FERM BP-4731生产的抗MxA蛋白抗体KM1135或作为对照抗体的抗鼠IgG1抗体的第一抗体进行染色。在洗涤之后，通过第二抗体显色，并且通过流式细胞计进行分析，并且将它的荧光强度和对照抗体的荧光强度的差别视为MxA蛋白值。将正常新生儿的脐血用于获得标准值，并且，为了方便起见，将其平均值+3SD或更高的荧光强度视为标准值。将表现出平均值+3SD或更低的患者诊断为在淋巴细胞中MxA蛋白的表达为阴性，而将表现出平均值+3SD或更高的患者诊断为在淋巴细胞中MxA蛋白的表达为阳性。
就发热而言，在采血当天最高体温为37.5℃或更高的患者被判断为发热，而最高体温为37.5℃或更低的患者被判断为不发热。
表1表示根据基于发热的判断，基于血液中C-反应蛋白值的判断，和基于淋巴细胞中MxA蛋白的表达的判断获得的结果。
表1
根据血液中C-反应蛋白值诊断为阳性的患者的比例，在发热的情况下为64.4％，在不发热的情况下为23.1％。另一方面，根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达诊断为阳性的患者的比例，在发热的情况下为68.8％，在不发热的情况下为61.5％。因此，发现根据血液中C-反应蛋白值的阳性诊断和根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达的阳性诊断是由于独立的判断标准，因此，示出了通过这两者的组合获得更多信息是可能的。
实际上，当通过组合根据血液中C-反应蛋白值的诊断和根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达的诊断对74位患者进行分析时，存在这样一些病例其中的发病原因可以在其疾病被诊断为简单的细菌感染或其发病原因未知的患者体内鉴定。
有31位患者发热，并且根据血液中C-反应蛋白值诊断为阳性，并且他们的疾病迄今为止被诊断为细菌感染。对所述31位患者来说，当组合根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达的诊断时，在淋巴细胞中MxA蛋白的表达为阳性的患者有19位。在这19位患者中，包括5例哮喘发作和5例可能的病毒增殖腺炎，并因此存在还被认为患有病毒感染的患者。这一事实表明，本发明的诊断方法优于常规诊断方法，在常规诊断方法中，出现发热，并且血液中C-反应蛋白值为阳性的病例被诊断为细菌感染。
另外，甚至在出现发热时，根据血液中C-反应蛋白值诊断为阴性的17位患者，迄今为止被诊断为未知。对所述17位患者来说，当组合根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达的诊断时，根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达而诊断为阳性的患者有14位。实际上，在这14位患者中，包括4例哮喘发作，2例病毒性肠胃炎(疑似)，和2例病毒性脑炎(疑似)。
不发热，并且根据血液中C-反应蛋白值诊断为阴性，并因此被诊断为没有患细菌感染的患者有20位。对所述20位患者来说，当组合根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达的诊断时，根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达诊断为阳性的患者有14位。
实际上，在这14位患者中，在5位患者中证实了病毒感染，并且证实4位患者患有RS病毒感染，一位患者患有先天性巨细胞病毒感染。
因此，即使在以往根据血液中C-反应蛋白值诊断为阴性，因此病因为未知的场合下，业已发现通过组合根据淋巴细胞中MxA蛋白的表达的诊断，可以方便地诊断病毒感染，并且很快确定治疗方案。
工业实用性根据本发明，提供了用于诊断没有合并细菌感染的病毒感染的方法，和用于所述方法的试剂盒。
通过利用本发明的用于诊断没有合并细菌感染的病毒感染的方法，和用于所述方法的试剂盒，通过同时分析C-反应蛋白和MxA蛋白，可以诊断没有合并细菌感染的病毒感染。
权利要求
1.一种用于诊断没有合并细菌感染的病毒感染的方法，该方法包括测定生物学样品中的C-反应蛋白和MxA蛋白。
2.一种用于判断没有合并细菌感染的病毒感染的试剂盒，它包括用于测定生物学样品中的C-反应蛋白的试剂和用于测定生物学样品中的MxA蛋白的试剂。
全文摘要
一种用于诊断没有合并细菌感染的病毒感染的方法，该方法包括测定生物学样品中的C－反应蛋白和MxA蛋白；用于判断没有合并细菌感染的病毒感染的试剂盒，该试剂盒包括用于测定生物学样品中的C－反应蛋白的试剂和用于测定生物学样品中的MxA蛋白的试剂。
文档编号G01N33/86GK1656378SQ03811489
公开日2005年8月17日 申请日期2003年3月20日 优先权日2002年3月22日
发明者宫胁利男 申请人:协和美帝克斯股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
