专利名称：一种区分土壤N<sub>2</sub>O微生物排放源的方法
技术领域：
本发明涉及土壤微生物分子生态学，具体的说是一种区分土壤N2O微生物排放源的方法。
背景技术：
氧化亚氮(N2O)是重要的三大温室气体之一，它的增温潜势是CO2的298倍(百年时间尺度上)，而且还参与了臭氧层的破坏。土壤被认为是陆地生态过程中的主要N2O排放来源，土壤排放N2O过程的区分一直以来是一个棘手的难题。土壤中产生N2O的过程较多，主要涉及到硝化、反硝化、硝化细菌的反硝化作用等，而且这些过程在土壤中可能同时发生。另夕卜，土壤产生N2O的过程受到许多因子的影响，如温度、水分含量、pH、可利用氮等，这些因子之间的相互作用、相互影响，使得土壤产生队0的过程变得更为复杂。事实上所检测到的土 壤排放的N2O是这些因子共同作用的结果。因此，准确地区分土壤的N2O排放源是有针对性地制定合理的土壤N2O减排措施的前提与依据。前期的研究多采用C2H2对土壤中硝化过程或反硝化过程进行抑制，测定土壤排放的N2O,可以估计硝化过程、反硝化过程对土壤排放N2O的相对贡献。由于在培养过程中土壤微生物对C2H2的分解会导致C2H2浓度不断下降，以至于不能完全抑制土壤的硝化作用，使实验的结果造成偏差。近年来，稳定同位素技术已被证明是研究土壤N2O排放的不同微生物过程相对贡献的有力工具。细菌的纯培养实验显示硝化细菌的硝化作用比反硝化细菌的反硝化作用对15N的同位素分馏作用大。这就意味着，假如当底物的同位素值相同时，硝化作用比反硝化作用产生的N2O的S 15N更偏向负值。基于此，有些学者研究了不同时期土壤排放N2O过程的转变。另外，有些研究对NH4+或N03_底物进行了 15N或18O的同位素标记，并施加到土壤中进行培养，测定被标记的N2O的排放，进而判断N2O的产生过程及其这些过程的相对贡献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种区分农田土壤N2O排放源的方法。为实现上述目的，本发明采用技术方案为一种区分土壤N2O微生物排放源的方法，将待分析土壤处理后测定其所排放N2O的同位素S 15N值以及土壤产生队0过程中相关微生物基因的拷贝数，基因丰度与S 15N-N2O的丰度值间相关性检验P〈0. 05的功能微生物群体，即为对土壤N2O排放起重要作用的微生物群体。所述土壤为农田土壤、森林土壤和草地土壤。所述待分析土壤在不含N2O的人造空气中培养。所述待分析土壤在不含N2O的人造空气中以25 28°C条件下，培养l_45h。将待分析土壤处理后，采用稳定同位素比率质谱仪测定其排放的N2O的同位素，以荧光定量PCR测定土壤产生N2O过程中相关微生物基因的拷贝数，基因丰度与8 15N-N2O的丰度值间相关性检验P〈0. 05的功能微生物群体，即为对土壤N2O排放起重要作用的微生物群体。本发明所具有的优点I.本发明提出了一种能够精确区分土壤中产生N2O的主要微生物群体的技术，即应用稳定同位素测定法结合土壤微生物分子生态学手段分析土壤N2O排放的同位素特征值与土壤功能微生物群体数量的相关关系，从而寻找对土壤排放N2O贡献较大的特定微生物群体。2.本发明采用土壤芯作为实验材料，减少了对土壤原来状态的扰动，也不需添加同位素标记物而扰动了土壤原有的状态，因此对土壤的N2O产生过程影响极小。3.由于土壤中不同的微生物组成对N2O产生的同位素分馏效应不同，所以可从微生物组成变化，结合N2O的同位素分馏效应，来分析土壤产生N2O的过程或与N2O产生过程相关的微生物群体。
4.本发明使用不含N2O的人造空气作为培养实验的背景气体，避免了空气中高浓度的N2O对实验结果的影响。
图I为本发明土壤培养方法的示意图(其中，I钢瓶；2空气减压阀；3三通阀；4软胶管；5空气泵；6胶塞；7玻璃瓶；8 土芯)。
具体实施例方式本发明对土壤排放N2O主要过程的微生物功能群体进行精确区分，可能为硝化过程的氨氧化细菌或氨氧化古菌，可能为反硝化过程的nirK型反硝化菌或nirS型反硝化菌等。土壤可以是玉米、大豆、高粱等作物的田间土壤。在作物的重要发育期采集作物田间土壤，如苗期、分枝(拔节)期、开(扬)花期、结荚鼓粒(灌浆)期、成熟期等。对土壤样品进行瓶培养，培养装置如图I所不，培养瓶7为体积为6. OL的玻璃瓶,8为用环刀米取的表层(TlOcm的土芯，用带有导管4的软胶塞6密封培养瓶。用真空泵5对瓶进行抽真空，然后用钢瓶I中不含N2O的人造空气冲洗培养瓶，这一过程可以用空气减压阀2及三通3实现，直至瓶中的气体中不含有N2O为止，然后将瓶置于室内，25 28°C条件下，培养l_45h。培养结束后，用稳定同位素比例质谱仪测定瓶中土壤排放N2O的8 15N值，用实时荧光定量PCR检测土壤中与N2O产生相关的功能基因丰度。这些基因主要为具有硝化或反硝化作用的细菌、古菌的功能基因，如硝化过程中氨氧化细菌、氨氧化古菌的编码单氨加氧
酶的基因-amoA、反硝化细菌的编码亚硝酸还原酶的基因-nirK和nirS等。不同功
能微生物群体对产生N2O过程中15N的分馏作用存在差异，因此通过分析功能微生物群体丰度与8 15N-N2O值的相关性，可以判断出哪种微生物群体对土壤排放N2O起重要作用。实施例本次试验在辽宁省沈阳市苏家屯区十里河镇进行，土壤为棕壤土，种植作物为大豆。N肥为尿素，种植时一次性施肥，施肥量为60kg N/ha。在整个大豆生长季的六个发育时期进行了土壤样品的采集，分别为种植后第19、35、52、66、99、115天，此时对应的大豆的发育期为发芽出苗期、苗期、分枝期、开花期、鼓粒期、成熟期。每次采样时间为上午9:00—11:00。具体采取方法为用木块垫在环刀之上，用锤子将环刀敲进土中直至环刀上沿与土壤齐平，后用铁锹将环刀从土壤中小心挖出，用一铁片将环刀下沿的土壤切平，用一层薄塑料袋将环刀的下沿包裹�。儆孟鹌ぬ自簦苑劳寥来踊返吨新┏觯⒓茨没厥笛槭掖糜谕寥赖呐嘌笛�。将采集来的18个环刀土芯，6个一组分为3组并称重(约2Kg 土)，然后分装于3个6L的玻璃试剂瓶中。用带有进气-出气孔的橡胶塞塞紧瓶子，瓶塞的进气口、出气口分别通过三通阀连接钢瓶(内含去除了 N2O的人造空气)和真空泵，通过三次真空泵抽真空一钢瓶充气的循环过程后，经气相色谱检测瓶中的气体均为不含N2O的空气(实验装置见图I)。将气体置换过的培养瓶放于实验桌上，室内环境下，平均温度为25-28°C，放置约40h。用注射器抽取培养瓶中的气体，注入预先抽真空的气体采样袋中。气体样品中的N2O浓度用配有电子捕获检测器(ECD)的气相色谱仪测定。气体样品中N2O的同位素S15N值用稳定同位素比率质谱仪测定(参见表I)。提取土壤样品的总DNA，运用实时荧光定量PCR仪测定土壤中总细菌的16SrDNA、氨氧化细菌的单氨加氧酶基因amoA、氨氧化古菌的单氨加氧酶基因amoA、反硝化细菌的铜 离子型(Cu2+)亚硝酸还原酶基因nirK和反硝化菌的细胞色素型(cdl)亚硝酸还原酶基因nirS的拷贝数(参见表I)。统计分析表明，土壤排放N2O的同位素S 15N值与土壤中氨氧化细菌的丰度存在显著相关性(r=0.80，p〈0.01)(表I )，而与其它菌群的丰度相关性不显著，表明氨氧化细菌是本试验土壤中与N2O产生主要相关的微生物群体。表I 土壤排放N2O的同位素S 15N值与土壤中N2O相关微生物基因丰度
权利要求
1.ー种区分土壤N2O微生物排放源的方法，其特征在于将待分析土壤处理后測定其所排放N2O的同位素S 15N值以及土壤产生N2O过程中相关微生物基因的拷贝数，基因丰度与S 15N-N2O的丰度值间相关性检验p〈0. 05的功能微生物群体，即为对土壤N2O排放起重要作用的微生物群体。
2.按权利要求I所述的区分土壤队0微生物排放 源的方法，其特征在于所述土壤为农田土壌、森林土壤和草地土壌。
3.按权利要求I所述的区分土壤队0微生物排放源的方法，其特征在于所述待分析土壤在不含N2O的人造空气中培养。
4.按权利要求I所述的区分农田土壤队0排放源的方法，其特征在于所述待分析土壌在不含N2O的人造空气中以25 28°C条件下，培养l_45h。
5.按权利要求I所述的区分土壤N2O排放源的方法，其特征在于将待分析土壤处理后，采用稳定同位素比率质谱仪測定其排放的N2O的同位素，以荧光定量PCR測定土壤产生N2O过程中相关微生物基因的拷贝数，基因丰度与8 15N-N2O的丰度值间相关性检验p〈0. 05的功能微生物群体，即为对土壤N2O排放起重要作用的微生物群体。
全文摘要
本发明涉及土壤微生物分子生态学，具体的说是一种区分土壤N2O排放源的方法。将待分析土壤处理后测定其所排放N2O的同位素δ15N值以及土壤产生N2O过程中相关微生物基因的拷贝数，基因丰度与δ15N-N2O的丰度值间相关性检验p<0.05的功能微生物群体，即为对土壤N2O排放起重要作用的微生物群体。本方法适用于区分某种土壤中排放N2O的微生物群体。
文档编号G01N27/62GK102758017SQ20121023948
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月11日 优先权日2012年7月11日
发明者夏宗伟, 孔双, 徐慧, 董丹, 陈冠雄, 韩斯琴 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所
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