亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：弓形虫间接血凝诊断试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及畜牧业诊断试剂领域，特别是一种弓形虫间接血凝诊断试剂，本发明还涉及该试剂的制备方法。
背景技术：
弓形虫IHA间接血凝诊断试剂作为检测弓形虫病的一种手段，在我国得到广泛的应用，为我国畜牧业的发展做出了显著的贡献。目前已有的弓形虫间接血凝诊断试剂可分为(1)弓形虫虫体抗原IHA间接血凝诊断试剂；(2)弓形虫膜抗原IHA间接血凝诊断试剂。用虫体抗原及膜抗原制备间接血凝试剂时，从虫体获得的抗原量少，且不能作早期诊断。

发明内容
本发明的目的在于克服用虫体抗原及膜抗原制备间接血凝试剂时，从虫体获得的抗原量少，且不能作早期诊断的缺点，提供一种由弓形虫代谢分泌抗原制备弓形虫IHA间接血凝诊断试剂及其制备方法，这种间接血凝诊断试剂可用于对弓形虫病的检测及弓形虫病的普查方面。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的一种弓形虫间接血凝诊断试剂，其特征在于由弓形虫代谢分泌抗原制成。
其制备方法为(1)将1×10^5-1×10^6弓形虫速殖子，腹腔接种20-25克体重小鼠，经72-96小时，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70-75％酒精内体表消毒；每只小鼠用2-3毫升PH7.2PBS缓冲液洗腹收集虫体；将所收集的腹腔液以3000-4000rpm离心30-40分，收集上清液；将上清液在-15--20℃放置24-48小时，冻融化开后再次以3000-4000rpm离心30-40分钟，离心2-3次，收集上清液；上清液即为弓形虫代谢分泌抗原；用1.5-2.1mg/ml稀释度的弓形虫代谢分泌抗原致敏醛化鞣酸化后的红细胞，即制成弓形虫间接血凝诊断抗原；(2)将蛋白质含量为1.5-2.1mg/ml代谢分泌抗原，与等量的5％鞣酸化红细胞悬浮混合后在37℃水浴箱中感作30-40分钟，其间每5-8分钟摇荡一次，离心弃上清，然后沉淀，用PH7.2 0.15M PBS以3000-4000rpm离心洗涤3-5次，每次3-5分钟，再以含2％灭活正常兔血清NRS的PH7.2 0.15M PBS，如上离心洗涤2-3次，沉淀物用加有0.1％叠氮钠、2％灭活正常兔血清NRSPH7.20.15M PBS配成1％致敏红细胞悬液，用冻干机冻干，抽真空，即可制成代谢分泌抗原弓形虫IHA间接血凝诊断试剂。
本发明的优点为(1)容易获得抗原，经过数次离心即可获得代谢分泌抗原，不必象获得虫体抗原那样须经过超声波振荡破碎虫体等途径。(2)获得的抗原量大，同样数量的接种小鼠，可获得8-10倍于虫体抗原量的代谢分泌抗原量。(3)检测出血清抗体的最早时间比虫体抗原间接血凝诊断试剂检测出的时间提前2天。
表1不同蛋白含量E/SA致敏的红细胞悬液与不同稀释度血清的凝聚试验




由表1看出，蛋白含量在0.6-3.0mg/ml的E/SA致敏红细胞悬液，可与阳性血清的多数稀释孔发生明显的凝聚反应。根据试验结果，选用蛋白质含量在1.5-2.1mg/ml的E/SA致敏红细胞，经反复试验，结果稳定。
表2两种诊断试剂对人工感染弓形虫兔血清抗体的检测结果比较


从表2看出，用弓形虫E/SA制备的间接血凝诊断试剂检测人工感染兔血清，不同稀释度血清的凝集情况与虫体抗原制备的间接血凝诊断试剂的检测结果基本一致，而检测出的血清抗体的最早时间前者比后者提前2天。
具体实施例方式
实施例12004年6月5日以1×10^6弓形虫速殖子/只，腹腔接种20-25克体重小鼠20只，6月8日，小鼠出现了精神沉郁、被毛粗乱等症状，将小白鼠脱颈致死，浸泡于70％酒精内进行体表消毒。每只小鼠用2毫升PH7.2PBS缓冲液洗腹收集虫体。共收集腹腔液45ml，将所收集的腹腔液以每分钟3000转的速度离心40分钟，收集上清，上清置-20℃冰箱内，6月10日从冰箱取出上清，融化后再以每分钟4000转的速度离心3次，每次离心30分钟，收集上清，检测上清蛋白含量为21.37mg/ml。上清即为弓形虫代谢分泌抗原。6月11日将弓形虫代谢分泌抗原分别稀释成1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml，取抗原含量分别为1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml的弓形虫代谢分泌抗原各100ml，分别与100ml5％醛化鞣酸化的绵羊红细胞混合，在37℃的水浴箱中感作30分钟，其间每5分钟摇动1次，感作完成后离心弃上清，然后沉淀用PH7.2 0.15M PBS以3000rpm离心洗涤5次，每次5分钟，再以含2％灭活正常兔血清(NRS)的PH7.2 0.15MPBS，如上离心洗涤3次。沉淀物用500ml加有0.1％叠氮钠、2％灭活正常兔血清(NRS)PH7.2 0.15M PBS配成1％致敏红细胞悬液。分别取抗原含量为1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml的弓形虫代谢分泌抗原制备的1％致敏红细胞悬液，检测已知的弓形虫阴性、阳性血清，结果抗原含量为1.5mg/mll的弓形虫代谢分泌抗原制备的1％致敏红细胞悬液检测的阳性血清在1∶1024时75％凝集，1∶4096时25％的凝集，抗原含量为1.8mg/mll的弓形虫代谢分泌抗原制备的1％致敏红细胞悬液检测的阳性血清在1∶1024时100％凝集，1∶4096时50％的凝集，抗原含量为2.1mg/mll的弓形虫代谢分泌抗原制备的l％致敏红细胞悬液检测的阳性血清在1∶1024时100％凝集，1∶4096时50％的凝集，根据中华人民共和国农药行业标准NY/T573-2002弓形虫病诊断技术的规定，这三种抗原含量制备的弓形虫间接血凝试验(IHA)试剂完全符合要求。
实施例22004年11月13日以1×10^5弓形虫速殖子/只，腹腔接种20-25克体重小鼠20只，11月17日，小鼠出现了精神沉郁、被毛粗乱等症状，将小白鼠脱颈致死，浸泡于75％酒精内进行体表消毒。每只小鼠用3毫升PH7.2PBS缓冲液洗腹收集虫体，共收集腹腔液45ml，将所收集的腹腔液以每分钟4000转的速度离心30分钟，收集上清，上清置-15℃冰箱内，11月18日从冰箱取出上清，融化后再以每分钟3000转的速度离心2次，每次离心40分钟，收集上清，检测上清蛋白含量为18.26mg/ml。上清即为弓形虫代谢分泌抗原。11月19日将弓形虫代谢分泌抗原分别稀释成1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml，取抗原含量分别为1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml的弓形虫代谢分泌抗原各100ml，分别与100ml5％醛化鞣酸化的绵羊红细胞混合，在37℃的水浴箱中感作40分钟，其间每8分钟摇动1次，感作完成后离心弃上清，然后沉淀用PH7.2 0.15M PBS以4000rpm离心洗涤3次，每次3分钟，再以含2％灭活正常兔血清(NRS)的PH7.2 0.15M PBS，如上离心洗涤3次。沉淀物用500ml加有0.1％叠氮钠、2％灭活正常兔血清(NRS)PH7.2 0.15M PBS配成1％致敏红细胞悬液。分别取抗原含量为1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml的弓形虫代谢分泌抗原制备的1％致敏红细胞悬液，检测已知的弓形虫阴性、阳性血清，结果抗原含量为1.5mg/mll的弓形虫代谢分泌抗原制备的1％致敏红细胞悬液检测的阳性血清在1∶1024时75％凝集，1∶4096时25％的凝集，抗原含量为1.8mg/mll的弓形虫代谢分泌抗原制备的1％致敏红细胞悬液检测的阳性血清在1∶1024时100％凝集，1∶4096时50％的凝集，抗原含量为2.1mg/mll的弓形虫代谢分泌抗原制备的1％致敏红细胞悬液检测的阳性血清在1∶1024时100％凝集，1∶4096时50％的凝集，根据中华人民共和国农药行业标准NY/T573-2002弓形虫病诊断技术的规定，这三种抗原含量制备的弓形虫间接血凝试验(IHA)试剂完全符合要求。
权利要求
1.一种弓形虫间接血凝诊断试剂，其特征在于由弓形虫代谢分泌抗原制成。
2.一种制备如权利要求书1所述的弓形虫间接血凝诊断试剂的方法，其特征在于采用下列步骤完成(1)将1×10^5-1×10^6弓形虫速殖子，腹腔接种20-25克体重小鼠，经72-96小时，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70-75％酒精内体表消毒；每只小鼠用2-3毫升PH7.2PBS缓冲液洗腹收集虫体；将所收集的腹腔液以3000-4000rpm离心30-40分，收集上清液；将上清液在-15--20℃放置24-48小时，冻融化开后再次以3000-4000rpm离心30-40分钟，离心2-3次，收集上清液；上清液即为弓形虫代谢分泌抗原；用1.5-2.1mg/ml稀释度的弓形虫代谢分泌抗原致敏醛化鞣酸化后的红细胞，即制成弓形虫间接血凝诊断抗原；(2)将蛋白质含量为1.5-2.1mg/ml代谢分泌抗原，与等量的5％鞣酸化红细胞悬浮混合后在37℃水浴箱中感作30-40分钟，其间每5-8分钟摇荡一次，离心弃上清，然后沉淀，用PH7.2 0.15M PBS以3000-4000rpm离心洗涤3-5次，每次3-5分钟，再以含2％灭活正常兔血清NRS的PH7.2 0.15M PBS，如上离心洗涤2-3次，沉淀物用加有0.1％叠氮钠、2％灭活正常兔血清NRSPH7.20.15M PBS配成1％致敏红细胞悬液，用冻干机冻干，抽真空，即可制成代谢分泌抗原弓形虫IHA间接血凝诊断试剂。
全文摘要
一种弓形虫间接血凝诊断试剂及其制备方法，由弓形虫代谢分泌抗原制成。将1×10
文档编号G01N33/569GK1932518SQ20051009604
公开日2007年3月21日 申请日期2005年9月16日 优先权日2005年9月16日
发明者张德林, 李学瑞, 王艳华, 李惠萍, 杜重波 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所