专利名称：一种检测磺胺类药物残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种检测磺胺类药物残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用。
背景技术：
磺胺类药物常作为饲料添加剂或动物疫病治疗药物被广泛应用，不合理的用药会导致磺胺类药物在动物性食品中的残留，影响食品安全，进而�：θ死嗟慕】担鞴栽诙镌葱允称分械幕前防嘁┪锊辛粝蘖孔龀隽嗽嚼丛窖细竦墓娑āＵ攵允称泛退橇现谢前防嘁┪锊辛舻募觳夥椒òǜ咝б合嗌�、气相色谱、高效液相色谱-质谱、气相-质谱、薄层色谱法、毛细管电泳法。胶体金免疫层析法具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合大量样品现场监测。因此更适于快速检测磺胺 类药物在动物组织中的残留。申请号为CN200610019642. I的中国发明专利公开了一种检测磺胺类药物残留的免疫胶体金试纸条；申请号为CN200810089431.4的中国发明专利公开了一种检测磺胺甲噁唑残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法；申请号为CN200910189654. 2的中国发明专利公开了一种检测磺胺嘧啶残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法；申请号为CN200610019642. I的中国发明专利公开了一种磺胺二甲嘧啶胶体金检测卡及其生产和使用方法。这些公开的专利方法均只能检测一种或几种磺胺类药物。申请号为CN201020579015. 5的中国实用新型专利公开了一种检测磺胺类药物残留的胶体金试纸卡，该试纸卡尽管能够检测13种磺胺类药物的残留，检测限在5-20ng/ml之间，但是对于多达20多个品种的磺胺类药物来说，还是远远不够的。
发明内容
本发明的目的在于针对目前的磺胺类药物残留检测试纸条一次性检测药物不够多的问题，提供一种能一次性检测16种磺胺类药物残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用。本发明是基于一种能同时识别16种磺胺类药物的高灵敏度单克隆抗体(该单克隆抗体是由杂交瘤细胞4E5分泌的，杂交瘤细胞4E5由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0:C201148)，通过制备胶体金，标记纯化后的抗体，优化各项层析条件等完成的。上述目的是通过以下技术方案实现的一种胶体金试纸条，包括吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在塑料衬板上，所述金标垫包被有胶体金标记的能识别磺胺类药物的单克隆抗体，所述检测线包被有磺胺包被原，所述质控线包被有羊或兔抗鼠IgG。
所述的能识别磺胺类药物的单克隆抗体是由杂交瘤细胞4E5所分泌的，所述杂交瘤细胞4E5于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:C201148。所述的磺胺包被原是由磺胺二甲嘧啶(SM2)与卵清蛋白(OVA)形成的偶联物(SM2-0VA)。所述的胶体金试纸条的使用方法，包括用样品提取液对组织样品前处理和用胶体金试纸条进行检测的步骤，所述样品提取液的PH值为7. 6 - 8，其配制方法为准确称取KH2PO4 0.41g, K2HPO4 5. 59g，超纯水溶解，定容至lOOOmL，所述前处理的方法为称取匀浆的组织样品lg，加入样品提取液10ml，振荡5分钟至混匀，吸取上清液。所述组织样品为猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、鱼肉、虾肉、猪肝、鸡肝、鸡蛋、蜂蜜中的一种或多种。
所述的胶体金试纸条在磺胺类药物残留检测中的应用。具体步骤如下(I)复苏杂交瘤细胞4E5，免疫小鼠，制备单克隆抗体，并利用辛酸硫酸铵进行纯化。(2)利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，优化标记条件，制备胶体金标记的能识别磺胺类药物的单克隆抗体；(3)将包被原SM2-0VA和羊或兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上；(4)将待测样品用样品提取液提�。檬灾教跫觳狻＜觳馐保粞分杏谢前防嘁┪铮蛞┪锵群徒禾褰鸨昙堑牡タ寺】固褰岷希酱锛觳庀呤保呀岷狭嘶前防嘁┪锏慕禾褰鸨昙堑牡タ寺】固寰筒换嵊氚辉谙跛嵯宋啬ど系陌辉�(SM2-0VA)发生结合，就不会在检测线处形成肉眼可见的红色沉淀线，胶体金标记的单克隆抗体继续向前泳动，富集在质控线上，形成红色沉淀线，判为阳性结果。若样品中不含有磺胺类药物，检测时，胶体金标记的单克隆抗体就会与包被在硝酸纤维素膜上的包被原(SM2-0VA)发生结合，在检测线处形成肉眼可见的红色沉淀线，未反应完的胶体金标记的抗体继续向前泳动，富集在质控线上，形成红色沉淀线，判为阴性结果。本发明的有益效果是灵敏度高、检测范围广，可同时检测多达16种磺胺类药物。操作简单迅速，加样5min-10min内即可观察显色结果,易于大范围应用。
图I是本发明的技术路线图。图2是本发明胶体金试纸条的结构示意图，图中1 一吸收垫；2 —硝酸纤维素膜；3 一金标垫；4 一样品垫；5 —检测线；6 —质控线；7 —塑料衬板。图3是本发明胶体金试纸条的显色示意图，图中a —阴性、b —阳性、c 一无效，其中T为检测线，C为质控线。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。实施例I胶体金试纸条的制备
I. I单克隆抗体的制备及纯化I. I. I腹水的制备在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0. 5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI 1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC N0:C201148的杂交瘤细胞4E5扩大培养的细胞，并将细胞数调至I X IO6个/mL，每只小鼠腹腔接种0. 5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。I. I. 2单克隆抗体的纯化参照朱立平等《免疫学常用实验方法》人民军医出版社2000版中的方法取所得的小鼠腹水5ml与适量的二氧化硅混合，加入等体积的巴比妥缓冲液，室温振荡Ih后，室温静置30min，取上清于洁净离心管中，4°C，3000 r/m离心IOmin ；取上清液8ml，加入16ml 0. 06mol醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4. 5，充分搅拌下缓缓加入辛酸132W后，室温搅拌30min，然后转入4°C冰箱充分沉淀2h，4°C，15000 r/m离心30min，得上清液22ml，加入2. 2ml 0. IM的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7. 6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0. 277g/ml，4°C冰箱充分沉淀2h后，4°C，12000r/m离心30min，弃上清，沉淀用5ml 0. IM的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5000ml 0. OlM pH7. 2磷酸盐缓 冲液(PBS)充分透析后，再对2000ml蒸馏水透析，最后对3000ml三蒸去离子水透析，将充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇一 20000 (PEG - 20000)浓缩至3ml，然后4°C，12000r/m离心30min，弃沉淀，收集上清液，测得蛋白浓度为I. 6mg/ml。经SDS-PAGE电泳鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度为98%。该单克隆抗体可用于制备检测磺胺类药物残留的试剂。I. 2胶体金、胶体金标记的单克隆抗体的制备I. 2. I溶液的配制(I)氯金酸的配制用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml 1%氯金酸溶液配方IOg氯金酸；双蒸去离子水定容至1000ml。(2)柠檬酸三钠的配制用双蒸去离子水溶解柠檬酸三钠，配成1%溶液，0. 22Mffl膜滤过，置4°C备用,有效期四个月，双蒸去离子水定容至1000ml。(3) 0. IM碳酸钾的配制用双蒸去离子水配制，0. 22Mm膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。IOOOml 0. IM碳酸钾溶液配方13. 8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。(4) 2% PEG-20000的配制用双蒸去离子水配制，0. 22Mm膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000ml2% PEG-20000溶液配方20g PEG-20000 ;双蒸去离子水定容至1000ml。(5)标记洗涤保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)，0. 05%叠氮钠(NaN3)，0. OlMPH 7.2 PBS溶液，0.22Mm膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000ml标记洗涤保存液配方20g BSA, 0. 5g NaN3, 0. OlM pH7. 2 PBS 溶液定容至 1000ml。I. 2. 2胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0. 01%，置电炉煮沸，按每IOOml 0. 01%氯金酸加入2ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。I. 2. 3胶体金标记的单克隆抗体的制备将20ml胶体金加入50ml小烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌,加入0. IM的K2CO3调节至最佳pH处。缓慢逐滴加入杂交瘤细胞4E5所分泌的单克隆抗体,搅拌反应30min。加入10%的BSA溶液，使BSA终浓度达到1%，持续搅拌lOmin。4°C条件下静置lh。将标记好的单克隆抗体复合物以10000r/min,4°C离心30min,弃去上清；沉淀用含1%BSA的IOmM磷酸盐缓冲液(PB，pH值约为7. 0)重悬于原体积，重复离心两次；沉淀用配好的含1%BSA的IOmM的PB (含0. 02%NaN3)缓冲液重悬于原体积1/10中，4°C保存备用。I. 3金标垫3的制备封闭液的配制2% BSA，0. 1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),0. 05% NaN3>0.01M pH 7.2 PBS溶液，0.22Mm微孔滤膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000 ml封闭液配方20g BSA, 0. 5g NaN3,lml Triton X-100,0. OlM pH7. 2PBS 溶液定容至 1000ml。金标垫3的制备将金标垫3浸泡于封闭液中30min后，于37°C烘干。然后将制备好的胶体金标记单克隆抗体均匀铺在金标垫3上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4°C备用。I. 4试纸条样品垫4的制备
封闭液的配制2%BSA, 0. 1% Triton X-100,0. 05% NaN3>0. OlM pH 7.2 PBS 溶液，0. 22Mm微孔滤膜滤过，置4°C备用，有效期四个月。1000 ml封闭液配方20g BSA,0. 5gNaN3'Iml Triton X-100,0. OlM pH7. 2PBS 溶液定容至 1000ml。样品垫4的制备将样品垫4浸泡于封闭液中30 min后，于37°C烘干，封装，置4°C备用。I. 5试纸条的组装将吸收垫I、硝酸纤维素膜2、金标垫3、样品垫4按图2所示依次层叠粘贴在塑料衬板7上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装。4 8°C保存，有效期一年；常温保存，有效期6个月。实施例2胶体金试纸条的使用方法及应用2. I胶体金试纸条检测方法的优化将包被原溶解，配制成lmg/ml的母液，稀释成lmg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml、0. 4mg/ml—系列的浓度，利用IOil g/L浓度的磺胺甲氧嗪标准品检测，同时利用PBS检测作为阴性对照，当药物检测线完全不显色，阴性对照检测线显色明显时，选择此时的包被浓度作为胶体金试纸条包被原的包被浓度。将羊或兔抗鼠IgG 稀释成 lmg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml、0. 4mg/ml、0. 2mg/ml 浓度，包被在硝酸纤维素膜上，作为质控线。质控线与检测线显色情况尽量保持一致，要求阴性空白两条检测线条带显色清晰，根据显色情况，最终确定三种不同试纸条上羊或兔抗鼠IgG的包被浓度。包被原稀释一系列浓度于硝酸纤维素膜上，干燥后组装试纸条，利用稀释到10 V- g/L的甲氧咕嗪检测，当检测线包被浓度大于0. 8mg/ml时,检测磺胺甲氧咕嗪IOy g/L标准品，检测线显色，检测结果为阴性，包被浓度小于等于0. 8mg/ml时，检测结果为阳性，同时空白对照检测线显色也会相应的变浅，最终选择磺胺包被原的包被浓度为0. 8mg/mlo将羊或兔抗鼠二抗稀释成一系列浓度，显色结果与检测线显色相比较，最终选择0. 2mg/ml作为未标记羊或兔抗鼠IgG的包被浓度。2. 2样品前处理方法样品提取液的配制(pH7. 6-8. 0):准确称取KH2PO4 0. 41g，K2HPO4 5. 59g，超纯水溶解，定容至1000mL。牛奶样品处理方法新鲜牛奶样品直接稀释10倍后，滴加4滴于样品孔中；5 IOmin内判断结果。组织样品处理方法称取匀浆的组织样品(猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、鱼肉、虾肉、猪肝、鸡肝或鸡蛋)1. 0±0. Olg至IOml离心管中，加入提取缓冲液IOml,振荡5min至混勻,用滴管吸取上清液，滴加4滴于样品孔中；5 IOmin内判断结果。蜂蜜样品处理方法取蜂蜜I. 0±0. Olg至50ml离心管中，加入提取缓冲液9ml，振荡5min至混勻,用滴管吸取上清液,滴加4滴于样品孔中；5 IOmin内判断结果。注意本方法对样品的稀释倍数为10。2. 3胶体金试纸条检测步骤每次使用试纸条检测时均需要设置对照用移液器或者滴管滴加100 UL水或者阴性的样品于样品口中。 样品检测方法将待测样品处理后，取IOOyL加入加样孔中，通过样品检测试纸条和对照试纸条检测线的显色情况比较来判断待测样品的阴阳性。阴阳性判断标准如样品检测试纸条和对照的检测试纸条颜色深浅一致或者略浅，结果判断为阴性；如果样品检测试纸条检测线没有出现或者检测线明显浅于对照试纸条检测线，结果判断为阳性。2. 4胶体金试纸条性能参数的确定2. 4. I 检测限取经仪器检测(仪器方法按照“GB/T 20759-2006畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法”进行)为阴性的待测组织(猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、鱼肉、虾肉、猪肝、鸡肝、鸡蛋、蜂蜜或牛奶)样品各20份，分别添加各磺胺药至不同的浓度。取3个批次的胶体金试纸条进行测定，室温条件下操作，肉眼观察进行判定，以出现阳性结果的最低浓度为检测限。实验结果表明，添加浓度为20ii g/kg时，添加磺胺邻二甲氧嘧啶的样品质控线检测清晰，检测线无显色；添加浓度为30y g/kg时，添加磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶的样品质控线检测清晰，检测线无显色；添加浓度为40y g/kg时，添加磺胺甲基嘧啶的样品质控线检测清晰，检测线无显色；添加浓度为50ii g/kg时，添加磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲基异嘧啶的样品质控线检测清晰，检测线无显色；添加浓度为70 y g/kg时，添加磺胺噻唑的样品质控线检测清晰，检测线无显色；添加浓度为80 u g/kg时，添加磺胺地索辛、磺胺喹噁啉的样品质控线检测清晰，检测线无显色；添加浓度为90 ii g/kg时，添加磺胺二甲嘧啶的样品质控线检测清晰，检测线无显色；添加浓度为IOOy g/kg时，添加磺胺甲氧哒嗪的样品质控线检测清晰，检测线无显色；添加浓度大于250y g/kg时，添加磺胺甲噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺异噁唑的样品质控线检测清晰，检测线无显色。因此，可以判定本检测卡在各组织的检测限如表I所示。表I本检测试纸条对不同组织中各药物的检测限
药物检测限(y g/kg) 药物检测限(y g/kg)
磺胺邻二甲氧嘧唆~20磺胺噻唑70
2. 4. 2 特异性
用3个批次的检测试纸条对磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧唆、磺胺二甲嘧唆、磺胺氯吡嗪、磺胺地索辛、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺喹噁啉、磺胺异噁唑、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺噻唑等16种磺胺类药物(添加浓度为检测限浓度)和沙丁胺醇、喹乙醇、恩诺沙星、环丙沙星、土霉素、四环素、氯霉素、泰乐菌素、链霉素、庆大霉素等10种其他药物标准品的阳性添加组织样品(浓度均为100 U g/kg)进行检测，每种药物有10份样品。结果如表2所示。表2不同药物交叉反应实验结果
权利要求
1.一种胶体金试纸条，包括吸收垫(I)、硝酸纤维素膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)，所述硝酸纤维素膜(2)上设有检测线(5)和质控线(6)，所述吸收垫(I)、硝酸纤维素膜(2)、金标垫(3)、样品垫(4)依次粘贴在塑料衬板(7)上，其特征在于所述金标垫(3)包被有胶体金标记的能识别磺胺类药物的单克隆抗体，所述检测线(4)包被有磺胺包被原，所述质控线(5)包被有羊或兔抗鼠IgG。
2.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于所述的能识别磺胺类药物的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC N0:C201148的杂交瘤细胞4E5所分泌的。
3.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于所述的磺胺包被原是由磺胺二甲嘧啶与卵清蛋白形成的偶联物。
4.如权利要求I一 3任何一项所述的胶体金试纸条的使用方法，其特征在于包括用样品提取液对组织样品前处理和用胶体金试纸条进行检测的步骤，所述样品提取液的PH值为7. 6 — 8，其配制方法为准确称取KH2PO4 O. 41g，K2HPO4 5. 59g，超纯水溶解，定容至IOOOmL,所述前处理的方法为称取匀浆的组织样品lg，加入样品提取液10ml，振荡5分钟至混匀，吸取上清液。
5.如权利要求4所述的胶体金试纸条的使用方法，其特征在于所述组织样品为猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、鱼肉、虾肉、猪肝、鸡肝、鸡蛋、蜂蜜中的一种或多种。
6.权利要求I一 3任何一项所述的胶体金试纸条在磺胺类药物残留检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种胶体金试纸条，该试纸条由吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠粘贴在塑料衬板上构成，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述金标垫包被有胶体金标记的能识别磺胺类药物的单克隆抗体，所述检测线包被有磺胺包被原，所述质控线包被有羊或兔抗鼠IgG。本发明还公开了一种胶体金试纸条的使用方法及其在磺胺类药物残留检测中的应用。本发明的胶体金试纸条可用于对牛奶、猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、鱼肉、虾肉、猪肝、鸡肝、鸡蛋和蜂蜜等组织样品进行磺胺类药物残留检测，能同时检测16种磺胺类药物，具有检测灵敏度高，特异性强，操作简便，快速准确和费用低廉的特点。
文档编号G01N33/577GK102768279SQ201210177239
公开日2012年11月7日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者刘振利, 彭大鹏, 彭庆娟, 王玉莲, 袁宗辉, 陈冬梅, 陶燕飞 申请人:华中农业大学
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