专利名称：临床检验凝血酶原时间(pt)测定体外诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外诊断试剂盒，特别是一种临床检验凝血酶原时间(PT)测定体外诊断试剂盒。
背景技术：
凝血实验对于临床各科的疾病诊断具有很大的意义，除了对出血性疾病的筛选与诊断外，还用于对各种血栓性疾病与血栓前状态的检查和预测；弥散性血管内凝血(DIC)的实验诊断以及对各种抗凝治疗患者的用药指导和预后估计等。血栓与止血不仅涉及基础医学，且与多个临床学科(包括血液科、呼吸消化科、心血管科、神经科、妇产科、普通外科等)的疾病密切相关1)所有手术前检查外科手术、骨科手术、妇科手术等；检查病人出凝血机能，以免术中发生危险。2)监测抗凝及溶栓治疗如换瓣手术后、肝素治疗、口服抗凝剂、华法令、香豆素等，减少临床治疗出血发生率。3)弥散性血管内凝血诊断。4)先天及后天性凝血因子缺乏。5)纤维蛋白原缺乏所致的出血倾向。6)动脉粥样硬化。7)中医活血化瘀的诊疗研究。总之，在血液病、糖尿病、高脂血症、心脑血管病、外科手术治疗等领域的研究、诊断与治疗方面，血栓与止血检验均有重要意义。
传统的出血时间测定采用Duke氏法、IVY氏法和出血时间测定器法。Duke氏法虽操作简单，但穿刺深度、宽度难以标准化，且受穿刺部位毛细血管分布及血管收缩程度的影响致使实验的敏感性很差，不能达到诊断要求。文献记载，血小板低于3×109/L的患者阳性率仅为42％，vWD患者阳性率为32％。IVY氏法虽较Duke氏法敏感，但操作繁琐，又是损伤性的，且切口难以标准化，也不易推广。出血时间测定器法的灵敏度比前两者高，可操作复杂、费时，也不适合常规使用。凝血时间测定常规采用的玻片法、毛细血管法，操作也较简单，但都过于粗糙，重复性及敏感性较差，血友病漏检率高达90％，对临床难以提供可信的结果；而通常使用的试管法，也只是检查内在凝血系统某些因子的过筛试验，敏感性、准确性均比较差，仅能作为凝血障碍性疾病初筛时参考。此法对抗凝物质的监测效果较好，但对凝血物质缺乏的测定比较差。以前用于测定个别因子缺乏的一些纠正试验以及所谓的凝血活酶生成试验，因操作繁琐，敏感性也不高而趋于淘汰。而凝血酶原时间(PT)测定方法自创建以来，迄今为止仍然是检查外源性凝血因子及相关抑制物的重要筛选试验，是用来证实先天性或获得性纤维蛋白原、凝血酶原和凝血因子V、VII、X的缺陷或抑制物存在的重要项目，同时用于监测口服抗凝剂的用量和疗效的主要手段。
凝血酶原时间(PT)主要由肝脏合成的凝血因子I、II、V、VII、X的水平决定，在肝病中的作用尤为重要。急性肝炎PT异常率10％～15％，慢性肝炎为15％～51％，肝硬化为71％，重症肝炎为90％，是反映肝脏合成功能、储备功能、病变严重程度及预后的一个非常重要的指标。PT与血小板计数常用于评价进行肝活检与外科手术患者的出血倾向，如血小板＜50×109/L，PT延长超过正常4s是肝活检、外科手术包括肝移植的禁忌症。
由于实验室使用PT试剂质量上的不同，使得同一个患者在不同医院测定的结果相差悬殊，造成检测结果的不一致，影响对疾病的正确、及时诊断。因此，PT试剂的质量成了获得准确结果及诊断的关键。同时，由于试剂复溶后的稳定性差，增加浪费，导致医疗单位成本增加，患者负担加重。所以研制一种安全、可靠、准确、稳定的PT试剂，无疑将对临床诊断疾病有重要作用。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种检测凝血因子缺乏症和监控口服抗凝剂治疗，且安全、可靠、重复性好、稳定性佳的体外诊断试剂。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的一种临床检验凝血酶原时间(PT)测定体外诊断试剂盒，其特征在于它是由凝血活酶、缓冲液体系组成。
缓冲液体系由下述原料制成甘氨酸2～8％ 聚乙二醇-80000.4～1.0％氯化钙8～20mM 氯化钠 85～110mMTAPSO 20～45mMNaN3 1‰该缓冲液体系中甘氨酸的最适含量应选为5％。
该缓冲液体系中聚乙二醇-8000的最适含量应选为0.6％。
该缓冲液体系中氯化钙的最适浓度应选为13.7mM。
该缓冲液体系中氯化钠的最适浓度应选为100mM。
该缓冲液体系中TAPSO的最适浓度应选为30mM。
该凝血活酶的来源是兔脑粉。
本发明相比现有技术具有如下优点本发明通过兔脑粉提取凝血活酶，并用独特的缓冲液体系调节和稳定凝血活酶活性，与市售产品相比，在重复性和稳定性方面较好。经多家医院临床试验结果证实，本产品确实对临床疾病诊断起到了相当重要的作用。
具体实施例方式本发明的设计是由凝血活酶、缓冲液体系、使用说明书组成。
该缓冲液体系是由下述含量的原料制成甘氨酸2～8％ 聚乙二醇-80000.4～1.0％氯化钙8～20mM 氯化钠 85～110mMTAPSO 20～45mMNaN3 1‰其中，该缓冲液体系中甘氨酸的最适含量应选为5％，聚乙二醇-8000的最适含量应选为0.6％，氯化钙的最适浓度应选为13.7mM，氯化钠的最适浓度应选为100mM，TAPSO的最适浓度应选为30mM。本发明还将结合实例作进一步详述实施例一与市售PT试剂重复性比较将1g用丙酮脱水的兔脑粉加入20ml提取液中(含硫酸钡0.6g、0.63％氯化钠、0.25％曲拉通X-100)，45℃水浴振荡15min，提取混合液再以2500rpm，离心10分钟，以提取凝血活酶，提取液经过分装，冷冻干燥。缓冲液体系由下述含量的原料制成2～8％甘氨酸、0.4～1.0％聚乙二醇-8000、8～20mM CaCl2、85～110mM NaCl、20～45mM TAPSO、1‰ NaN3。
使用时，凝血活酶冻干品用一定体积的缓冲液复溶，同一正常质控血浆(PT值10～14秒)凝血酶原时间(PT)在太平洋TS400C血凝仪上测得。(表1)表1表明，本发明所讲的PT试剂与市售试剂相比，变异系数(CV)较�。馗葱越虾�。
表1
实施例二与市售PT试剂稳定性比较如例一所述凝血活酶冻干品用一定体积的缓冲液复溶，然后将复溶后试剂置于2～8℃保存。每天吸取一定体积的试剂，在太平洋TS400C血凝仪上测定同一正常质控血浆(PT值10～14秒)，市售试剂同步进行测定。(结果见表2)表2表明，本发明的PT试剂在复溶后的七天内测定结果稳定，到第八天时才变化，而市售试剂在第二天时就开始变化，这一结果对临床检验科来说，尤其是中小医院来说非常重要，因为它可以减少浪费，从而降低成本。
表2
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
权利要求
1.一种临床检验凝血酶原时间(PT)测定体外诊断试剂盒，其特征在于它是由凝血活酶、缓冲液体系组成。
2.按权利要求1所说的试剂盒，其特征在于缓冲液体系由下述原料制成甘氨酸2～8％ 聚乙二醇-8000 0.4～1.0％氯化钙8～20mM氯化钠85～110mMTAPSO 20～45 mM NaN31‰
3.按权利要求2所说的试剂盒，其特征在于缓冲液体系中甘氨酸的但最适含量应选为5％。
4.按权利要求2所说的试剂盒，其特征在于缓冲液体系中聚乙二醇-8000的最适含量应选为0.6％。
5.按权利要求2所说的试剂盒，其特征在于缓冲液体系中氯化钙的最适浓度应选为13.7mM。
6.按权利要求2所说的试剂盒，其特征在于缓冲液体系中氯化钠的最适浓度应选为100mM。
7.按权利要求2所说的试剂盒，其特征在于缓冲液体系中TAPSO的最适浓度应选为30mM。
8.按权利要求1所说的试剂盒，其特征在于凝血活酶的来源是兔脑粉。
全文摘要
本发明涉及一种临床检验凝血酶原时间(PT)测定体外诊断试剂盒。它是由凝血活酶、缓冲液体系组成，用于凝血因子缺乏的筛选试验和口服抗凝剂治疗的监控。其优点是安全简便、重复性好、稳定性佳，为临床诊断治疗提供可靠的实验数据，降低成本和减轻患者负担，提高血栓与止血基础研究的效率和水平。
文档编号G01N33/50GK1952169SQ20051003062
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者谢永华, 朱美萍 申请人:上海太阳生物技术有限公司
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