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专利名称：一种检测生物硫化氢的荧光探针及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物检测领域，涉及一种检测生物硫化氢的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术：
硫化氢是一种无色、易燃、具有臭鸡蛋气味的气体，长期以来被认为是有毒物质。但近期的研究表明，哺乳动物可在硫化氢合成酶的催化作用下以高半胱氨酸或半胱氨酸为原料合成少量的硫化氢，并利用它作为信号分子调控血管舒张、炎症反应、葡萄糖代谢等生理过程。硫化氢是继一氧化氮、一氧化碳后第三个被发现的气体信使。它可以通过打开血管平滑肌中的ATP敏感性钾离子通道而扩张血管，从而达到降血压的效果。硫化氢还具有促血管生成、血管重塑、抗动脉粥样硬化、抗血小板凝聚等心血管保护作用，并对心脏、肾脏等器官的缺血一再灌注损伤具有保护作用。在炎症反应中，硫化氢可通过抑制NF-K B的激活而下调许多促炎症基因(如iNOS、C0X-2等)及炎症细胞分子、粘附分子的水平。哺乳动物体内硫化氢的合成障碍将导致阿尔海默症、高血压、糖尿病等疾病。目前，对硫化氢生理功能及作用机制的研究正在进一步进行中，而硫化氢释放剂也被作为具有潜在治疗效果的药物受到广泛关注。因而，发展快速、灵敏、简便的检测生物硫化氢的方法不仅对硫化氢的功能研究具有巨大的推动作用，同时也是筛选具有潜在治疗意义的硫化氢供体分子所必需的技术手段。传统的检测硫化氢的方法包括分光光度法及电化学法。但这两种方法的检测误差较大，而且只能测定血浆或组织匀浆中的硫化氢，不能用于测定细胞甚至活体组织中的硫化氢。荧光探针检测法是近两年来发展起来的新方法。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测生物硫化氢的荧光探针，是一种新型的特异性检测生物硫化氢的小分子荧光探针，其结构如式(I)所示。该荧光探针的特征在于它本身在生理环境中无荧光，但可与硫化氢特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，从而实现对硫化氢的特异性检测。
权利要求
1.一种检测生物硫化氢的荧光探针,结构如式I所示:
2.根据权利要求1所述的一种检测生物硫化氢的荧光探针的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现: (1)式II的制备:取(E)-3-(2-((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)-5-醛基)苯基-丙烯酸甲酯和1，3-二甲基氟硼二吡咯荧光团溶解于适量苯或甲苯中，加入0.2 mL醋酸和0.2mL哌啶，加热回流4-5小时，以分水器除去反应生成的水，待反应结束后，冷至室温，加水烊灭，粗产物以乙酸乙酯萃取，旋干，硅胶柱层析纯化； (2)式III的制备:将式II所示的化合物溶于乙腈，向该溶液中逐滴滴加5.0当量的40%浓度的氢氟酸水溶液，室温搅拌I小时后，反应液以乙酸乙酯稀释，以水洗涤，有机相浓缩后通过硅胶柱层析纯化； (3)式I的制备:在氮气的保护下，将式III化合物溶于干燥的二氯甲烷中，快速加入1.5当量氯铬酸吡啶嗡盐及2.5当量无水硫酸钠，室温搅拌6小时后，加硅藻土过滤除去固体不溶物，滤液旋干，硅胶柱层析纯化，得式I所示的荧光探针纯品； 反应式如下:
3.根据权利要求1所述的一种检测生物硫化氢的荧光探针在检测生物硫化氢中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现:在待检测体系中加入式I所示的荧光探针，使其终浓度为10 U M，37°C下孵育I小时，通过观察体系荧光强度实现检测目的；待检测体系选用血浆、匀浆液或细胞培养基，当待检体系为血浆或组织匀浆时，通过荧光分光光度计记录荧光强度；当待检测体系为活细胞时，通过流式细胞仪记录荧光强 度。
全文摘要
本发明提供一种检测生物硫化氢的荧光探针，其结构如式(I)所示。所述荧光探针本身在生理环境中无荧光，但可与硫化氢特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，从而实现对硫化氢的特异性检测。本发明的荧光探针稳定性好，能够长期保存使用，具有长的荧光激发波长(>500nm)，不会对生物体造成损伤，能够有效避免来自生物大分子背景荧光的干扰，检测信噪比高，灵敏度好，具有优秀的选择性，能在复杂生物样品中特异性地检测硫化氢，具有良好的生物膜通透性，因而能用于活细胞中硫化氢的检测。
文档编号G01N21/64GK103173212SQ20131006710
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者李新, 胡永洲, 张帅 申请人:浙江大学