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专利名称：基于蛋白a固定化抗体的微珠免疫分析方法
技术领域：
本发明涉及免疫检测方法，特别涉及一种基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析 方法。
背景技术：
蛋白A是葡萄球菌蛋白A (staphylococcus protein A, SPA)的简称，是一种从金 黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁中分离的蛋白质。蛋白A主要有5个结合 抗体的功能域，每个结构域大约由58个氨基酸残基组成(1、Karen L. A, Julia D. B, Emily S.S.aureus IgG—bindingproteins SpA and Sbi :Host specificity and mechanisms of immune complex format ion, Mo lecular Immuno logy, 2008,45 1600-1611 ；2、逢少蕉，梁浩， 宋淑亮，葡萄球菌蛋白A活性机制与现代应用，生命的化学，2008，28卷第6期，748-751)。现有的双抗夹心法存在的主要缺陷在于在抗体偶联过程中，由于抗体的倒伏， 造成抗体分子的失活，从而使其无法对抗原进行正确的识别。蛋白A可以与抗体的Fc端 特异性结合，这种结合不会影响抗体的活性，且能使抗体分子识别抗原的区域F(ab)端暴 露出来，使抗体的活性能够得到较好的保持，有利于后续的检测。蛋白A与抗体Fc端的 结合没有选择性，导致其能与信号分子FITC (fluorescein isothiocyanate)标记的抗体 直接结合，从而导致假阳性的出现。利用酶切技术及荧光标记技术对信号分子FITC进 行处理，切去抗体的Fc端并标记上FITC，从而降低检测中的背景荧光(3、Brogan K L， Wolfe K N,Jones PA,et al. Directoriented immobilization ofF(ab&prime ；)antibody fragments on gold. Analytica Chimica Acta, 2003,496 (1-2) 73-80 ；4> SjOdahl J. Repetitive Sequences in Protein A from Staphylococcusaureus. Arrangement of Five Regions within the Protein, Four being Highly Homologous andFc-Binding. European Journal ofBiochemistry, 1977, 73 (2) 343-351 ；5> HiiseyinA, Nilay B, Ziibeyde B. Antibody purification with protein A attached supermacroporous poly(hydroxyethylmethacrylate)cryogel, Biochemical Engineering Journal,2009, 45 201-208)。

发明内容
本发明的目的在于提供一种能够实现氨基微珠上抗体分子定向偶联的基于蛋白A 固定化抗体的微珠免疫分析方法。所述基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法包括以下步骤1)用桥联试剂对氨基微珠表面进行处理，再将蛋白A在缓冲液中偶联到氨基微珠 上；2)将偶联了蛋白A的氨基微珠与AFPfelphafetoprotein，甲胎蛋白)抗体1进行 孵育，得抗体固定化微珠；3)将抗体固定化微珠与人血清样品进行孵育，使抗体固定化微珠特异性识别人血清样品中的抗原AFP，得结合了抗原AFP的抗体固定化微珠；4)将结合了抗原AFP的抗体固定化微珠与AFP抗体2进行孵育，使抗原AFP与AFP 抗体2结合，得处理后的抗体固定化微珠；5)将FITC标记的能够识别AFP抗体2的二抗与步骤4)所得的处理后的抗体固定 化微珠进行孵育，检测荧光强度，即得人血清样品中的AFP，完成基于蛋白A固定化抗体的 微珠免疫分析。在步骤1)中，所述桥联试剂可采用戊二醛溶液等，所述戊二醛溶液的体积比浓度 可为5% 15% ；所述处理的条件为温度25 40°C，时间1 3h ；所述缓冲液可采用常规 PBS溶液等，所述偶联的温度可为25 40°C，偶联的时间可为1 3h ；在进行偶联前，还可用硼氢化钠对桥联试剂处理后的氨基微珠进行再次处理，再 次处理条件为将氨基微珠浸入6%的硼氢化钠水溶液中lh。在步骤2)中，所述孵育的温度可为4 20°C，孵育的时间可为5 28h ；所述AFP 抗体1可为鼠抗人AFP抗体。在步骤3)中，所述孵育的温度可为37°C，孵育的时间可为1 3h ；进行孵育前还 可将步骤2)所得抗体固定化微珠进行如下处理用含30mol/L DMP ( 二甲基庚二酸亚胺脂——二盐酸化物)的硼酸缓冲液对微珠 进行处理2次，每次45min，最后用含有乙醇胺的硼酸缓冲液终止反应。在步骤4)中，所述孵育的温度可为37°C，孵育的时间可为2 5h ；所述AFP抗体 2可为兔抗人AFP抗体；在步骤5)中，所述孵育的温度为4 10°C，孵育的时间为1 3h ；进行孵育前还 可使用胃蛋白酶将FITC标记的能够识别AFP抗体2的二抗进行酶切；所述能够识别AFP抗 体2的二抗可为羊抗兔抗体。本发明所述基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法与现有双抗夹心方法相 比，具有诸多优势。首先，现有双抗夹心方法在固定抗体过程中可能导致抗体的倒伏，使抗 体识别抗原的F(ab)端功能域被掩盖，无法正常识别抗原，降低了氨基微珠识别抗原的能 力。而本发明基于蛋白A特异性识别抗体Fc端的特性，能够使抗体的F(ab)端功能域完全 暴露出来，使检测效果得到显著改善。同时，通过使用胃蛋白酶对识别抗原的第二个抗体进 行切割，再用FITC对切割后的抗体进行标记，将其作为信号分子来降低检测背景。由于胃 蛋白酶的切割会切去抗体Fc端，相当于将荧光标记抗体与蛋白A结合的位点切除，理论上 荧光标记抗体就不可能直接偶联到微珠上，降低了非特异性吸附，避免了假阳性的出现，提 高了检测的精确度。


图1为不同浓度AFP的检测曲线。在图1中，横坐标为人血清样品通过计算得 到的AFP浓度(ng/ml)，纵坐标为流式细胞仪测出的荧光强度；拟合曲线函数为F(X)= 1312. 13+2. 089X，相关系数(R2)达到了 0. 9967。图2为FITC标记荧光光谱图，在图2中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光信号 值；曲线1为未切割的FITC标记的抗体，购自北京中衫金桥；曲线2为切割后的FITC标记 的抗体(胃蛋白酶切割购自北京中衫金桥的FITC标记的抗体即得)；曲线3为去离子水。
图3为FITC标记紫外吸收光谱图，在图3中，横坐标为激发光的波长(nm)，纵坐标 为紫外分光光度计测出的信号值A ；曲线1为未切割的FITC标记的抗体，购自北京中衫金 桥；曲线2为申请人制备的FITC标记的抗体；曲线3为切割后的FITC标记的抗体(胃蛋白 酶切割购自北京中衫金桥的FITC标记的抗体即得)。图4为不同抗体的荧光强度对比图。在图4中，横坐标为抗体，纵坐标为荧光强 度；1为切割后的FITC标记的抗体(胃蛋白酶切割购自北京中衫金桥的FITC标记的抗体 即得)；2为申请人制备的FITC标记的抗体；3为未切割的FITC标记的抗体，购自北京中衫 金桥；图中的a是检测正常人血清的结果，b是检测AFP浓度为80ng/ml的人血清的检测结^ ο
具体实施例方式实施例11)用5%的戊二醛于25°C对氨基微珠表面进行处理Ih ；2)利用醛基与氨基的希夫碱反应与蛋白A进行偶联，将蛋白A分子修饰到氨基微 珠表面，偶联缓冲液为PBS溶液，偶联温度为25°C，时间为3h ；3)利用硼氢化钠将蛋白A与微珠形成的碳氮双键进行还原，处理条件为将氨基 微珠放入6%的硼氢化钠水溶液中处理Ih ；4)利用蛋白A与抗体Fc端定向结合的特点，在磷酸缓冲液中将抗体与氨基微珠进 行孵育过夜，孵育温度为4°C，即得抗体固定化微珠；5)运用DMP (二甲基庚二酸亚胺脂——二盐酸化物)对抗体固定化微珠进行固定， 处理方法为用DMP含量为30M的硼酸缓冲液对微珠进行处理2次，每次45min，最后用含有 乙醇胺的硼酸缓冲液终止反应；6)将抗体固定化微珠与人类血清进行混合孵育，温度为37°C，时间为Ih ；7)将抗体固定化微珠与兔抗人AFP混合孵育，孵育温度为37°C，时间Ih ；8)将抗体固定化微珠与FITC标记的羊抗兔抗体混合孵育，孵育温度为4°C，时间 2h ；9)用流式细胞仪对微珠荧光强度进行检测，从而检测血清样本中的AFP(参见图 1)。该实施例主要是通过蛋白A活化的微珠对血清样品中的AFP进行检测，在图1 中，纵坐标的值为流式细胞仪测出的荧光强度值，横坐标是人血清样品通过计算得到的 AFP浓度。随着AFP浓度的降低，血清样品的荧光信号值下降，其拟合曲线函数为F(x)= 1312. 13+2.089X，相关系数(R2)达到了 0.9967。在横坐标所示浓度范围内进行检测时，血 清样品的荧光信号与浓度几乎呈线性关系。在流式细胞仪的检测过程中，每个样品检测10000个微珠的信号值，再计算平均 值，结果具有统计学意义，图1中荧光强度值均为扣除背景荧光后的数值。实施例21)取三组氨基微珠，用5%的戊二醛于25°C对氨基微珠表面进行处理Ih ；2)利用醛基与氨基的希夫碱反应与蛋白A进行偶联，将蛋白A分子修饰到氨基微 珠表面，偶联缓冲液为PBS溶液，偶联温度为25°C，时间为3h ；
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3)利用硼氢化钠将蛋白A与微珠形成的碳氮双键进行还原，处理条件为将氨基 微珠放入6%的硼氢化钠水溶液中处理Ih ；4)利用蛋白A与抗体Fc端定向结合的特点，在磷酸缓冲液中将抗体与氨基微珠进 行孵育过夜，孵育温度为4°C，即得抗体固定化微珠；5)运用DMP (二甲基庚二酸亚胺脂-二盐酸化物)对抗体固定化微珠进行固定，处 理方法为用DMP含量为30M的硼酸缓冲液对微珠进行处理2次，每次45min，最后用含有乙 醇胺的硼酸缓冲液终止反应；6)将抗体固定化微珠与人类血清进行混合孵育，温度为37°C，时间为Ih ；7)将抗体固定化微珠与兔抗人AFP混合孵育，孵育温度为37°C，时间Ih ；8)用FITC对切割的羊抗兔抗体进行标记；9)将3组微珠分别用未切割的FITC标记羊抗兔抗体，切割后的FITC标记羊抗兔 抗体，购买的FITC标记羊抗兔抗体孵育，孵育温度为4°C，时间2h ；10)用流式细胞仪对微珠进行荧光强度的检测，检测血清中的AFP。该实施例主要是通过对荧光标记的抗体进行切割，去掉其Fc端，进一步降低背 景，增大信噪比，切割后的背景较未切割降低了很多(参见图2、图3)，并且可以检测出到更 低浓度的样品，提高检测的可靠性(参见图4)。
权利要求
基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，包括以下步骤1)用桥联试剂对氨基微珠表面进行处理，再将蛋白A在缓冲液中偶联到氨基微珠上；2)将偶联了蛋白A的氨基微珠与AFP抗体1进行孵育，得抗体固定化微珠；3)将抗体固定化微珠与人血清样品进行孵育，使抗体固定化微珠特异性识别人血清样品中的抗原AFP，得结合了抗原AFP的抗体固定化微珠；4)将结合了抗原AFP的抗体固定化微珠与AFP抗体2进行孵育，使抗原AFP与AFP抗体2结合，得处理后的抗体固定化微珠；5)将FITC标记的能够识别AFP抗体2的二抗与步骤4)所得的处理后的抗体固定化微珠进行孵育，检测荧光强度，即得人血清样品中的AFP，完成基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析。
2.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤1)中，所述桥联试剂为戊二醛溶液，所述戊二醛溶液的体积比浓度为5% 15%。
3.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤1)中，所述处理的条件为温度25 40°C，时间1 3h ；所述偶联的缓冲液为常规PBS 溶液，所述偶联的温度为25 40°C，偶联的时间为1 3h。
4.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤1)进行偶联前，用硼氢化钠对桥联试剂处理后的氨基微珠进行再次处理，再次处理条 件为将氨基微珠浸入6%的硼氢化钠水溶液中lh。
5.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤2)中，所述孵育的温度为4 20°C，孵育的时间为5 28h ；所述AFP抗体1为鼠抗人 AFP抗体。
6.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤3)中，所述孵育的温度为37°C，孵育的时间为1 3h。
7.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤3)中进行孵育前，将步骤2)所得抗体固定化微珠进行如下处理用含30mol/L 二甲基庚二酸亚胺脂-二盐酸化物的硼酸缓冲液对微珠进行处理2次， 每次45min，最后用含有乙醇胺的硼酸缓冲液终止反应。
8.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤4)中，所述孵育的温度为37°C，孵育的时间为2 5h ；所述AFP抗体2为兔抗人AFP 抗体。
9.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤5)中，所述孵育的温度为4 10°C，孵育的时间为1 3h。
10.如权利要求1所述的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法，其特征在于在 步骤5)中，进行孵育前使用胃蛋白酶将FITC标记的能够识别AFP抗体2的二抗进行酶切； 所述能够识别AFP抗体2的二抗为羊抗兔抗体。
全文摘要
基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法。涉及免疫检测方法，提供一种能够实现氨基微珠上抗体分子定向偶联的基于蛋白A固定化抗体的微珠免疫分析方法。包括以下步骤用桥联试剂对氨基微珠表面进行处理，将蛋白A偶联到氨基微珠上，再与AFP抗体1进行孵育，得抗体固定化微珠；将抗体固定化微珠与人血清样品进行孵育，结合了抗原AFP的抗体固定化微珠与AFP抗体2进行孵育，FITC标记的能够识别AFP抗体2的二抗与抗体固定化微珠进行孵育，检测荧光强度，即得人血清样品中的AFP。
文档编号G01J1/00GK101936987SQ20101028503
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者周雷激, 赵征寰 申请人:厦门大学