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专利名称：实时连续检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实时连续检测装置，特别是涉及一种包括样品流入通道、样品 分析站(site)及样品排出通道的实时检测装置，所述样品分析站包括检测由可逆反应 (Reversible Process)的捕获识别成分及从样品内分析物_捕获识别成分的结合体产生 的信号的传感器。
背景技术：
不仅是在保健领域，在食品、环境、兽医、国防等各种领域中，将利用抗原-抗体附 着及核酸接合等独特的识别反应分析方法用于结构复杂的有机物，特别是蛋白质、荷尔蒙、 核酸、细胞等的检测。这是由于活体识别反应的较高的特异性和亲和力及分析原理的普遍 性，应用这种方式开发了各种分析系统。例如，从免疫分析系统的开发动态来看，开发了将微量滴定板(microtiterplate) 作为固定化矩阵使用的固相免疫分析(如enzyme-linkedimmunosorbent immunoassays ； ELISA)方法应用于各种诊断及分析领域(IrinaIonescu-Matiu等，J Virol Methods, Vol. 6(1) ,41-52 Μ, 1983 ；ChristopherHeeschen 等，Clinical chemistry, Vol. 45(10), 1789-1796页，1999)，基于细孔性薄膜(membrane)的无试药属性诊断工具箱(kit)的开发， 实现了不受场所的限制在家庭等场所也可以进行免疫分析(R. Chen等，1987，Clin. Chem. Vol.33，1521-1525 页；MPA Laitinen,1996，Biosens. Bioelectron.，Vol. 11，1207-1214 页；S. C. Lou 等，1993，Clin. Chem.，Vol. 39，619-624 页；S. H. Paek 等，Methods Vol. 22， 53-60 页，2000 ；S. H. Paek 等，BioChip J. Vol. 1，1-16 页，2007)。另一方面，还开发了医院临床实验室等专业机构用于精密检查的自动化诊断装 置，并积极研发可以决定核酸序列或定量分析蛋白质表现(expression)程度的生物传感 器阵列芯片，以及为了微细自动分析而执行样品预处理等按次序连续步骤的芯片实验室 (Lab-on-a-chip)(Kyeong-Sik Shin 等，AnalyticalChimica Acta Vol. 573-574,164-171 页，2006)。作为实用例，可以例举CombiMatrix公司(美国)的基因组学用于研究的定 制阵列(Custom Array)、Nanosphere公司(美国)的用于单一核酸变异(SNP)检测的 VerigeneIDplatform, AffyMetrix 公司(美国)的基因芯片系统(GeneChip System)、 Integrated NanojTechnologies公司(美国)的用于现场分析的电仪测试卡(BioDetect Test Card)等。近来，融合纳米技术和生命工程技术的纳米生物传感器技术成为21世纪的最 高科技技术而倍受瞩目，为了具有与此相关的核心技术，包括韩国国内，全球性研究活动 正在活跃地进行。诸多机构都集中在生物传感器的超高感应度的技术开发，但其报道 公开的技术水平还仅处于初步阶段的纳米传感器概念(Yi Cui等，Science, Vol. 293, 1289-1292 页，2001 ； Jong-in Hahm 等，Nanolett.，Vol. 4，51-54 页，2004)及基于震动型悬 臂(cantilever)的免疫分析(Y Arntz 等，Nanotechnology，Vol. 14，86-90 页，2003)等。如上所述的用于现有分析系统的抗体等的大部分识别成分与分析物质-识别成分结合后，为了分离其结合体必须经过洗涤过程。此时，为了减少形成了的结合体的流失， 必须使用解吸速度非常慢的识别成分，因此，已结合了的分析物质无法从识别成分离解 (dissociation)，大部分传感器无法连续使用，只能作为一次性的使用。近来，在葡萄糖监 控中，活跃展开了对无侵袭检测方法的研究(Ronald Τ. Kurnik等，Sensors and Actuators B =Chemical, Vol. 60，19-26页，1999)，特别是对有关医院的重病患者的疾病的指标物质的 连续测量的要求越来越高，但因技术上的问题无法满足其要求。但是，如果可以逆向应用分 析物质-识别成分之间反应时，就可以实现对各种病患的实时连续监控。如果可以对分析物质进行连续测量，则未来可以开发出贴身使用或者移植于体内 使用的生物传感器。使用这种传感器，则可以连续测量活体信息，可以对疾病发生概率相对 较高的高危群体(慢性疾病患者、老年人等)患者的感染病或生活习惯所导致的疾病等易 发病进行早期管理或监控。由此，上述分析工具将会在以普遍的计算机环境为基础的，标志 着医疗保健环境的U-医疗保健(Health Care)时代中‘随时随地’地提供医疗服务，这将 成为未来用于预防医学的必要工具(Anthony PF Turner,Nature Biotechnology,Vol. 15, 421-421页，1997)。如果U-医疗保健实现，则不但可以分离现有的作为得病之后的对应方 案的‘医院/治疗中心’模式，并且慢性疾病患者和老年人等都无需长期住院。为了克服上述以往技术中的问题点，发明人经研究认为，在分析物质的实时检测 装置中导入可逆反应性的捕获识别成分，并连续再利用时，根据参加反应的分析物质的浓 度测量实时产生的信号，可以实现对分析物质的连续测量，从而完成了本发明。

发明内容
发明要解决的技术问题由此，本发明的主要目的在于提供一种分析物质的实时连续检测装置，其导入可 逆反应性的捕获识别成分，从而可以连续再利用。本发明的另一目的在于提供一种用于分析物质的实时连续检测方法，其利用所述 实时连续检测装置实现。本发明的又一目的在于提供一种可逆反应性的捕获识别成分的筛选方法，其用于 所述实时连续检测装置。解决技术问题的手段根据本发明一实施例，本发明提供包括样品流入通道、样品分析站及样品排出通 道的实时检测装置，所述样品分析站包括检测从可逆反应性的捕获识别成分10及样品内 的分析物质11-捕获识别成分10的结合体所产生的信号的传感器(参照图1 (A))。在本发明中，所述‘分析物质’是指为了利用包括于样品分析站的传感器进行检测 而注入至传感器表面的物质，‘捕获识别成分’是指固定在所述传感器的传感器芯片上，可 以与分析物质特异性结合的物质。例如，分析物质为抗原或配合体(Iigand)时，捕获识别成分分别为对其抗原的抗 体或为对其配合体的受体，相反，如果分析物质为对抗原的抗体或对配合体的受体时，则捕 获识别成分分别为其抗原或配合体。在本发明中，所述可逆反应性的捕获识别成分是指，具有分离及附着速度都很快 的反应力学特性、并且具有高亲和力的识别成分(例如，抗体)，如果使用高附着及分离速度常数值的捕获识别成分，即使连续使用也可以维持高分析灵敏度。这里的‘亲和力’可 以作为平衡附着常数来表示，平衡附着常数(Ka)定义为附着速度常数(Ka)/分离速度常数 (Kd)。由于在本发明中使用同时具有可逆反应特性和高亲和力的抗体，所以可以实现‘高感 应度实时连续检测’。如果仅为了可逆反应特性，使用亲和力小于IXlOfiLAi0I的识别成分，就会因为 检测装置的测量灵敏度处于非常低的mmol/L水平，很难适用于显示绝大多数的疾病或症 状症候的生物标记(biomarkers)分析物质的检测。其理由是，识别成分的亲和力越低，可 测量的分析物质的浓度范围越大。例如，如果使用降低或保持稳定可逆反应性的识别成分 (如抗体)的附着速度常数，而分离速度常数太高的成分，则亲和力将降低至IXlOfiLAi0I 以下。因此，为了得到本发明的高亲和力可逆反应性的识别成分，必须导入特殊的筛选方 法。例如，固定的抗原与识别成分结合后，用中性缓冲溶液洗涤时，第一次筛选与识别成分 浓度比较残余活性值较低的识别成分(参照实施例1)，与此相对，再利用抗原固定的传感 器(如，表面细胞质基因共鸣传感器)测量附着速度常数及分离速度常数而实施第2次筛 选(参照实施例3)，从而可以有效生产高亲和力的可逆反应性的识别成分。由此，为了达到本发明目的，所述可逆反应性的捕获识别成分以具有快速反应的 力学特性，并且维持平衡附着常数为lX107L/mol以上的高亲和力为佳，优选为IXlO8L/ mol 至 lX1012L/mol，更优选为 lX109L/mol 至 lX1012L/mol 的高亲和力。本发明的实时连续检测装置中，所述可逆反应性的捕获识别成分具有与样品内分 析物质反应时的附着速度常数(Ka)优选为IX從！^户⑶？至IX IO8LmoHec、分离速 度常数(Kd)优选为1 X IO-3Sec-1至1 X liTsec—1范围的特征，同时还具有两个速度常数的比 例(ka/kd)优选为lXl(fL/mol以上的平衡附着常数(Ka)的特征。如果将具有如上特征的捕获识别成分使用于连续检测装置，则这两个附着及分离 速度常数都较高，检测装置的响应时间较快，因此，不但可以实现分析物质的实时检测，还 具有由于平衡附着常数也较高，可以提供较高的测量灵敏度的优点。但是，如果超过范围 时，特别是分离速度常数更低时，与捕获识别成分结合的分析物质的分离变得困难，在连续 测量时会导致非常长的响应时间，或者为了加快分离不可避免地需要使用危险条件(例 如，酸性PH)，而导致实时检测根本无法实现。另外，即使附着及分离速度常数在规定范围 内，如果平衡附着常数小于设定的范围时，则如上所述，分析灵敏度会下降，其实际应用受 到极大的限制。在上述可逆反应性的捕获识别成分中，作为对特定分析物质的典型的识别成分的 单克隆抗体(Monoclonal antibody)，通�？梢酝ü�对分析物质的动物产生免疫的杂交瘤 细胞(hybridoma)的方法(Kohler. G 等，Nature, Vol. 256，495-497 页，1975)、遗传因子 重组的方法(HP Fell等，PNAS, Vol. 86，8507-8511页，1989)、噬菌体展示的方法(phage display) (Nicholas A. Watkins 等，Vox Sanguinis, Vol. 78，72-79 页，2000)等生产，但是 为了筛选可逆反应性抗体，需要特殊的处理。作为抗体筛选方法广泛使用的固相免疫分析 中，由于为了去除反应后残留的残余成分而使用洗涤工序，因此，如果是反应结合体是在洗 涤时容易分离的可逆反应性抗体，则很难筛选。作为解决上述问题的一实施例，本发明使用 了设置有非标识传感器的筛选系统，所述非标识传感器是例如在反应及洗涤时可实时追踪 反应结合的表面细胞质基因的(plasmon)共鸣传感器。
将上述分析物质固定于传感器表面后，将生成的抗体稀释于运行缓冲液中连续注 入后，用相同的运行缓冲液洗涤，然后由表面上的抗原-抗体之间的附着以及分离反应而 形成、分离的结合体的密度被传感器实时测量。在本发明的一具体实施例中，为了筛选上述可逆反应性的捕获识别成分，使用了 基于表面细胞质基因的共鸣传感器的筛选系统。将适当稀释的一定浓度的抗体溶液注入系 统内，然后通过结合反应随着时间信号被增加，当洗涤时，也就是说抗体浓度为‘0’的条件 下结合体密度的变化是根据各个抗体的可逆反应特性而变化的(参照图幻。现有的绝大部 分免疫分析中，在洗涤工序中不被分离的不可逆性抗体(图2，20E7)与容易被分离的可逆 性抗体1B5相比绝对是更受欢迎。这是因为，从洗涤后残留于固相的抗原-抗体结合体可 以产生与分析物质的浓度成比例的信号，这种分析系统中很难再利用抗体，从根本上不可 能进行连续测量。但是，如果使用根据样品内的分析物质浓度和力学平衡状态可迅速实现 的附着和分离的可逆反应性抗体1B5，则可以连续再利用抗体，并可以实现分析物质的连续 监控。另外，在免疫分析时根据抗体反应特性差异的连续测量实现的可能性，可以试 着通过循环反复测量而更加明确(参照图幻。就呈现不可逆反应特性的抗体(图3， 20E7 ;ka = 1. IOX IO4Lmol—sec-1、kd = 1. 80X liTsec—1)来说，在提供抗体后在规定时间 内与固定的抗原进行持续的附着反应，由于在洗涤时无法完成分离，因此随着循环反复抗 原-抗体反应结合体逐渐累积而增加。另一方面，就呈现可逆反应特性的抗体(lB5;ka = 4. IsxiO6Lmor1Sec-1^kd = 3. 61 X IO-W1)来说，提供抗体后信号急速增加达到附着反应 平衡，并且在洗涤时立即分离使得信号恢复到初始标准线，这种附着/分离可逆反应形式 在循环反复时也呈现高度重复性。因呈现可逆反应性的抗体的抗原-抗体结合体分离速度变快，会存在亲和力(平 衡附着常数，Ka)减少所导致的分析灵敏度降低的忧虑，但如果附着及分离速度都比较快， 则不会影响亲和力。实际上，由于平衡附着常数(Ka)=附着速度常数GO/分离速度常数 (kd)，因此，根据上述方法筛选具有适当的反应力学特性，也就是说具有较高的附着及分离 速度常数的抗体，则可以维持较高的分析灵敏度。由此，为了维持高灵敏度，通常需要Ka > 1 X IO8Lmor1条件的抗体，高亲和力可逆反应性抗体可定义为具有ka > 1 X IO5Lmor1sec-1 以及kd > 1 X IO-3Sec-1特性的抗体。另一方面，作为测试可逆反应性抗体的亲和力的另一种方法，将抗体以标准浓度 连续稀释，并与固定于表面细胞质基因的共鸣传感器上的抗原反应而试着决定可能感应信 号的最低抗体浓度，就可以预测抗体的亲和力(参照图4)。特别是，测量到可逆抗原1B5在 pg/mL浓度范围以下也可以与抗原反应，其结果与现有的不可逆性抗体相比也呈现较高的 亲和力。而且，通过图4的结果来看，使用的可逆抗体在较广的浓度范围内与固定的抗原以 不同的平衡状态反应，可知非常适合生物传感器的制造。在本发明实时连续检测装置中，所述可逆反应性的捕获识别成分10为可以与作 为样品内的分析物质11的生命体的代谢物质、蛋白质、荷尔蒙、核酸、细胞、食品检测对象 物质、环境有害物质或国防化学生物放射性测量物质特异性结合的抗体、受体、核酸、酶、适 配子(Aptamer)、肽(ρ印tide)或分子印刷人工膜。本发明的实时连续检测装置中，所述传感器为直接检测分析物质11-捕获识别成分10结合体产生的信号的非标识传感器12 (参照图1(A))，或者为经过与分析物质11-捕 获识别成分10的结合体的密度成比例而产生信号的标识物质14而检测的标识传感器 15(参照图1(B))。在本发明中，所述非标识传感器将成比例于分析物质-捕获识别成分的结合体而 变化的传感器的质量、振子电阻、根据电荷分布变化的表面歪曲、能量传递等作为信号进行 测量。根据传感器表面的结合体质量变化呈现折射角差异的表面细胞质基因共鸣(surface ρlasmon resonance ；SPR)传感器(RobertKarlsson 等，Journal of Immunological Methods, Vol. 145，2四_240页，1990)、感应振子电阻或电荷分布的悬臂(cantilever) 传感器(Hans-Jurgen Butt、Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 180, 251-260 页，1996)、光波导(evanescent)传感器(R. G. Eenink等，Analytica ChimicaActa, Vol. 238,317-321页，1990)，还有利用纳米范围的线或间隔的纳米传感器(Fengli Qu等， Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22，1749-1755 页，2007)等可以作为非标识传感器 使用。并且，上述标识传感器为了与分析物质-捕获识别成分结合体成比例地产生信 号，追加反应标示有标识物质的检测识别成分后，测量从标识物质产生的信号。在本发明 中，所谓所述‘检测识别成分’的标识物质，是指标识物质能够与分析物质以物理或化学方 式结合，并进行特异性反应的物质。在这里，所述检测识别成分反应的分析物质分子上的位 置与捕获识别成分反应的位置不同，因此两种成分可以同时与分析物质反应。作为产生信 号的标识物质，可以使用荧光体、发光体、酶、金属粒子、塑料粒子、磁性粒子等，感应由这些 产生的荧光、发光、显色、电子化学、磁场等的传感器可以作为标识传感器使用。换句话说，使用上述非标识传感器时，样品中的分析物质通过流体通道连续流入 系统内与捕获识别成分反应，如果使用标识传感器，则样品内的分析物质事先与结合有标 识物质的检测识别成分反应后，通过流体通道连续流入系统内与捕获识别成分反应。在本发明实时连续检测装置中，所述样品分析站被筛选性地只透过样品内分析物 质11的半透膜16分割，在固定有捕获识别成分10的传感器表面一侧形成识别反应单元 17。所述识别反应单元17在使用标识传感器15时，在所述识别反应单元17内锁住与 具有无法通过半透膜16的尺寸的标识物质14结合的检测识别成分13，然后进行再利用。另外，为了与捕获识别成分10 —起被连续再利用，所述识别反应单元17内的检测 识别成分13也具有可逆反应特性。具体来说，上述样品分析站可以利用半透膜划分固定有捕获识别成分的传感器表 面一侧来形成识别反应单元(图1 (C)、(D))，包括于样品的分析物质尺寸较�。�可以通过膜 扩散传递到单元内，但尺寸较大的样品内杂质被过滤可以防止传感器表面的污染。所述识 别反应单元的设置，特别是在标识方式的分析系统时(图1(D))，将与尺寸较大的标识物质 结合的检测识别成分锁在单元内，从而也提供再利用效果。根据本发明另一实施例，本发明提供包括以下步骤的利用所述实时连续检测装置 的分析物质实时连续检测方法。(a)将包括分析物质的样品通过所述样品流入通道注入样品分析站内的步骤；(b)将所述分析物质与样品分析站内的可逆反应性的捕获识别成分10结合的步骤；(c)利用传感器检测通过所述分析物质和捕获识别成分的结合产生的信号的步 骤；(d)根据样品的持续流入或洗涤液的流入，所述分析物质和捕获识别成分的结合 被分离，分析物质通过所述样品排出通道排出的步骤；(e)连续再利用所述分离的捕获识别成分，重复所述(b)至(d)的步骤，从而实时 测量样品内分析物质的浓度变化的步骤。在本发明的实时连续检测方法中，所述(C)步骤中利用非标识传感器直接检测由 分析物质-捕获识别成分结合体产生的信号，或者通过与分析物质-捕获识别成分结合体 密度成比例地产生信号的标志物质，通过标识传感器测量信号。在本发明中，使用所述非标识传感器时，包括于样品的分析物质通过样品流入通 道连续流入样品分析站内，与捕获识别成分反应。在本发明中，使用所述标识传感器时，样品内的分析物质事先与结合有标识物质 的检测识别成分反应后，通过样品流入通道连续流入样品分析站内并与捕获识别成分反应 (连续步骤外露类型)；或者样品内的分析物质通过样品流入通道连续流入样品分析站内 后，与和识别反应单元内的标识物质结合的检测识别成分及捕获识别成分反应(识别反应 单元类型)。在本发明中，所述检测识别成分为连续步骤外露类型时，检测识别成分事先与分 析物质反应并被供给，因此具有结合稳定性高的不可逆反应特性，或者，如果是识别反应单 元类型时，检测识别成分为了与捕获识别成分一起被连续再利用，具有可逆反应特性。在本发明中，在使用识别反应单元类型的标识传感器时，利用接近的荧光物质 (标识物质)和荧光能量受体之间的能量传递被捕获识别成分和分析物质的反应所妨碍而 产生荧光信号的原理，或者如果使固定于酶分子(标识物质)上的分析物质与识别成分结 合的话，不将捕获识别成分固定于传感器上，而是用标识物质将已知活性被抑制的酶在液 相进行识别反应。根据本发明另一实施例，本发明提供包括以下步骤的用于所述实时连续检测装置 的可逆反应性的捕获识别成分的筛选方法。(a)准备捕获识别成分的步骤；(b)将所述捕获识别成分与固定于传感器表面的分析物质结合的步骤；(c)利用传感器检测通过所述捕获识别成分和分析物质的结合产生的信号的步 骤；(d)通过流入洗涤液分离所述捕获识别成分和分析物质的结合的步骤；(e)利用传感器检测通过所述分离后剩余的捕获识别成分和分析物质的结合而产 生的信号的步骤；(f)筛选所述(e)步骤中的检测信号低于所述(C)步骤中的检测信号的捕获识别 成分的步骤。在本发明的可逆反应性的捕获识别成分筛选方法中，所述传感器为表面细胞质基 因共鸣传感器、悬臂传感器、光波导传感器、光干涉传感器或纳米传感器其中之一的非标识 传感器。
在本发明的可逆反应性的捕获识别成分筛选方法中，与固定于传感器表面的分 析物质反应时，所述捕获识别成分优选具有附着速度常数GO为IX IO5Lmor1sec-1至 1 X IO8Lmor1sec-1,分离速度常数(kd)为1 X lO^sec"1至1 X lO^sec"1范围的特性，同时具有 平衡附着常数(KA = ka/kd)为lXl(fL/mol以上的高亲和力的特性的捕获识别成分。在本发明的可逆反应性的捕获识别成分筛选方法中，筛选如下的捕获识别成分， 在所述(a)步骤中被运行缓冲液稀释而连续注入的捕获识别成分，在所述(f)步骤中信号 随时间增加而减少的捕获识别成分。在本发明的可逆反应性的捕获识别成分筛选方法中，筛选如下的捕获识别成分， 在所述(a)步骤中所述捕获识别成分反复与洗涤液循环并被注入的捕获识别成分，在所述 (f)步骤中重复信号随时间增加后重新回到初始基准线的信号模式的捕获识别成分。上述本发明的分析物质实时检测装置，利用其分析物质的实时连续检测方法及用 于其的可逆反应性的捕获识别成分筛选方法，具有如下优点。在生物传感器或生物芯片的制造中，如果如本发明的根据分析物质的浓度再利用 迅速地可逆地反应的抗体，则与现有的一次性诊断芯片相比，构成部件及制造方法变得极 其简单。这减少了现有装置或系统中为了样品的供给及去除而需要的多个阀体和泵，可以 实现可实际贴身使用的小型的微量流体的流程方式的连续诊断系统。上述这样新概念的检测方法(或诊断方式)可以实现对疾病或症状的实时监控， 因此，可以克服当前几乎所有的免疫分析系统都具有的使用一次之后就只能废弃的性能上 的限制，可以对人体的慢性疾病或高危患者进行连续监控。并且，还可以解决在现有的诊断 体系中，为了获取诊断结果而需要等待较长时间、以及在需要由实验室来分析患者状态的 检测数据时，开始检查和获取诊断结果之间的时间差较长导致无法准确地诊断疾病或及时 治疗的问题。由此，本发明开发的实时连续检测装置及其检测方法作为早期诊断概念的新型预 防医学技术，可以满足转移医院以需求现场为中心的诊疗模式的变化，可以实现对慢性病 患者及老年人等高危群体患者的实时监控的连续诊断设备的开发和实用化。特别是在平均 寿命延长同时因出生率的降低而加速进入老龄化的社会，由于饮食习惯的欧美化，各种慢 性的生活习惯所导致的疾病越来越多，早期诊断非常有助于维持健康生活。特别是在将要 到来的U-医疗保健时代，将诊断系统内设于手机、医院、住宅等，或者贴身使用，连续诊断 方法可以作为实时测量并诊断活体信息的基础来源技术应用。另外，本发明的实时连续检测装置及其检测方法，可以应用于对生命体的代谢物 质、蛋白质、荷尔蒙、核酸、细胞、食品检查对象物质、环境有害物质或国防化学生物放射性 测量物质等的分析，将各个产业领域的产品群作为示例如下。在医疗诊断产业，可例举高危 人群(慢性疾病患者、老年人、重病患者)的连续诊断系统产品、糖尿病患者的感染症状连 续诊断系统产品、心血管病患者复发的连续监控系统产品、癌症治疗患者的复发连续监控 系统产品，以及座便器健康监控系统产品等。在人工脏器产业，可适用于人工胰腺控制系统 产品等人工脏器控制上。在公共卫生及国防产业，可以应用于恐怖分子的生物武器的连续 检测系统产品以及禽流感、非典病毒等人畜共患病的病原体的连续检测系统产品等。在环 保产业，可以例举江河、沿岸、海洋污染的连续监控系统产品等。在生物及食品产业，可以例 举生物工程的连续监控系统产品和食品生产工程的连续监控系统产品等。
效果根据本发明，可以通过连续再利用一定量的可逆反应性的捕获识别成分，实时测 量分析物质浓度变化。本发明的实时连续检测装置可以应用在生命体代谢物质、蛋白质、荷 尔蒙、核酸、细胞、食品检查对象物质、环境有害物质或国防化学生物放射性测量物质等的 检测或分析上，因此，可以应用于医疗、公共卫生、国防、环境、食品、兽医、生命工程产业上。发明实施的最佳方式以下对本发明的利用可逆反应性的捕获识别成分的实时连续检测装置进行具体 说明。1)利用非标识传感器的实时连续检测装置构建说明在构成实时连续检测装置(或实时连续检测系统)时，除了可逆反应性识别成分， 传感器技术也是其核心因素之一。如上所述，传感器种类分为非标识传感器和标识传感器， 在构建连续诊断系统时，从理论上来说使用细胞质基因共鸣传感器、悬臂传感器或光波导 传感器等非标识传感器的比较简单。连续检测装置的结构有很多种，但为了简单说明本发明的有用性，参照图1说明 具有在细胞质基因共鸣传感器芯片上固定可逆反应性抗体1B5而制造的非标识传感器的 连续检测装置。具有代表性的是，利用非标识传感器测量作为在金属和遗传介质界面上因光而产 生的电荷密度波长的表面细胞质基因共鸣的方法。所述表面细胞质基因共鸣与金属表面 非常接近而相互作用，因此，在该领域中因识别反应等产生的光学特性的变化会影响到导 致表面细胞质基因共鸣的光的入射角(J. Homola等，Sens. Actuators B, Vol. 54、3_15页， 1999)。由此，通过在传感器表面的分析物质和识别成分之间的反应，将引起表面细胞质基 因共鸣的光的入射角变化作为信号进行测量。以10 μ L/分钟的微细流体流速，向在表面细胞质基因共鸣传感器12上固定可逆 反应性抗体(1Β5 ； 10)的连续检测装置(图1(A))依次注入以磷酸缓冲溶液稀释而使得包 括不同浓度的分析物质(α 2-微球蛋白)的标准溶液，则传感器产生与浓度成比例的响应 信号(参照实施例6)。各个标准溶液是将信号每次回到基准线后注入，在指定条件下的测 量灵敏度敏感至0. Ing/mL以下，并且浓度响应时间以最终响应水平的95%为准，达到了非 常迅速的640秒(图5 (A))。为了测试分析特异性，用作为医疗临床样品的人体血清稀释而 制造相同浓度范围的分析物质后，重复相同的测试，结果获得了几乎类似的浓度响应(图 5 (B))，因此，构建的连续检测装置可以使用于医疗临床用诊断。并且，作为提高分析灵敏度的方法，可以使用附加导入与标识物质14结合的检测 识别成分13而增加分析物质11与捕获识别成分10之间的识别反应结合体的质量变化的 信号放大方法。作为检测识别成分13选择不可逆抗体20E7，与直径为30nm的金胶体粒子 物理结合，将所述结合体提前与分析物质标准溶液反应后注入至传感器内测量传感器的浓 度响应(参照实施例7)。作为参考，针对分析物质，不可逆抗体20E7可以与可逆抗体1B5 同时反应。其结果，使用信号放大方法，可以实现至少0. 00Ing/mL的分析物质检测，并且分 析灵敏度提高约100倍(图6)。如果为医疗临床样品，则特别需要减少其使用量，因此，将微细流体的流速降低至 现有实验条件的1/10 (即，1 μ L/分钟或1. 44mL/天)，并在相同条件下测量了随分析物质浓度的增减的传感器响应(参照实施例8)。测量传感器浓度响应的结果，分析灵敏度 (0. Ing/mL)和响应时间(640秒，最终响应的95%为准)与微细流体流速无关地稳定维持 (图7 (A))。并且，随微细流体流速变化的传感器浓度响应模式也无大变化，因此，在流体流 速差10倍的不同条件下求得的两种浓度响应曲线几乎一致(图7(B))。另外，在分析物质 浓度增加时测量的浓度响应与浓度降低时测量的浓度响应之间也无差异。如图5至图7，为了利用固定有可逆反应性抗体的传感器芯片获得Sra传感器对分 析物质浓度变化的响应，使用了在每次浓度变化时回到每次的初始条件及无分析物质的状 态后进行测量的‘重置(reset)模式’。为了说明可逆反应性抗体的再利用使用了 ‘连续模式’，其从传感器，对分析物质 的浓度每15分钟以阶梯式增加或降低10倍的两次重复性变化(0. Ol-lOOng/mL)，连续获取 了浓度响应(参照实施例9)。以指定的微细流体流速(1 μ L/分钟)注入至传感器内的分 析物质的变化浓度下，传感器响应在15分钟内到达了平衡状态，重复两次时呈现了高再现 性(图8(A))。图示以上述连续测量方式测量的传感器浓度响应的标准曲线(图8(B))与 ‘重置模式’测量的曲线相比多少有些差异，这种差异是因为传感器系统的运行方式的差异 所带来的。根据分析物质的种类，发病或症状发现时浓度增减变化类型(指数性或算术性) 可能会不同，因此，以‘连续模式’测量了传感器对增加或降低两倍或其以下的算术性浓度 变化的浓度响应(参照实施例10)。与对指数性变化的响应相同，传感器对算术性分析物质 浓度变化也呈现了类似的分析性能(图9)。尤其是从对较小的浓度变化也敏感而迅速反应 来看，基于可逆反应性抗体的生物传感器有待在未来广泛应用于要求精确分析的分析物质 测量上。作为说明连续诊断的分析物质，本发明选择了 α 2-微球蛋白，针对所述物质生产 特异的可逆反应性抗体说明了连续诊断技术。微球蛋白可以在三种不同疾病上，特别是在 肾病综合症的治疗及复发确认、阿尔兹海默症早期诊断及人工脏器移植后炎症反应和综合 症的临床诊断上作为生物标识使用。并且，肾病综合症的约90%只发生在儿童身上，是蛋白质与小便一起被排出的 肾脏疾�。�是因为肾小球的异常而流失蛋白质(Daniel A. Blaustein等，Primary Care Update for OB/GYNS，Vol2，204-206页，199 。大部分患者是因为身体或腿部浮肿而来 医院，根据情况会发展为肾硬化、肾衰竭、癌症等。此类疾病的诊断是通过CBC(c0mplete blood count)、肝功能检查、肾功能检查、微球蛋bia等血蛋白检查、小便检查等进行。如果 诊断为肾病综合征，为了治疗使用1-6个月泼尼松(prednisone)或类固醇，在此期间持续 进行小便检查或血液检查来观察其变化，以判断治疗效果。为了深入观察，需要定期来医院 进行血液及小便检查，特别是因为肾病综合征患者的90%为表现力较弱的儿童，因此，需要 对症状变化及身体异常的持续及彻底的检查及观察。由此，作为用于小儿肾病综合征治疗 效果及复发确认的未来技术，对微球蛋白等血蛋白的连续检测技术的开发是非常需要的。作为将微球蛋白作为生物标识应用的其他可能性，阿尔兹海默的发病率是60-70 名中1名，85岁以上人群中50%是属于老年综合征，需要通过早期诊断来预防。2006年，伦 敦King’ s College研究组通过血液检查发现，患有阿尔兹海默病的患者的两种蛋白质，即 补体因子-H的前体和α 2-微球蛋白的浓度增加，通过明确蛋白质浓度之差启示了早期诊断可能性(A. Hye等，Brain. Vol. 1 ，3042-3050页，2006)。以上述目的，通过微球蛋白的 连续检测早期诊断阿尔兹海默�。�则因为早期进行了疾病预防及治疗，与在发现症状后再 来医院相比，更能缓冲疾病的发展，提高生活质量。作为将微球蛋白作为生物标识应用的其他可能性，伴随人工脏器移植的炎症反应 或并发症的引发已成为公知的事实，但有关其诊断指标的研究结果并不多。2005年，美国 Duke大学医学中心公开了在心脏手术中使用心肺机之后α 2-微球蛋白浓度增加50%的研 究结果(Eric A. Williams 等，J ThoracCardiovasc Surg, Vol. 129，1098-1103 页，2005)， 此结果表示作为全身炎症反应的一个指标可以使用微球蛋白浓度变化。由此，在人工脏器 移植后的预测观察中，如果可以持续检测炎症反应发现生物标识，则与定期检查或并发症 症状发现后采取措施相比，可以在早期进行人工脏器更换或并发症治疗。包括上述疾�。�急慢性人体疾病通常以小时或日为单位较慢发展，因此，作为测量 疾病指标生物标识的传感器的响应时间通常以分钟为单位。如果与疾病发展时间相比，传 感器响应时间快10倍左右，则疾病发展会成为控制生物标识连续诊断工序的速率控制阶 段，因此，如图8及图9所示的传感器的微球蛋白浓度响应时间(约15分钟；最终响应的 95%标准)满足连续检测条件。更迅速的传感器响应时间(例如，秒单位)对连续诊断时 的分析性能无任何影响，只是在不同概念的一次性传感器(例如，血糖传感器)时，具有可 以缩短采取的样品的测量时间的效果。2)利用标识传感器的诊断系统构津可能件说明作为标识传感器的示例，最多以荧光体作为信号产生源使用，可以通过将捕获识 别成分10固定于固体表面(图I(B)及(C))或在识别反应单元17内通过液相反应而检 测，此时，由信号产生源荧光物质(donor)放射的光利用有某些能量受体(acceptor)靠近 而存在时被吸收而不会放射到外部的原理(Siaw等，J. Cl in. Pathol, Vol. 30,526-531页， 1977)。作为其应用，可以设计成如抗原-抗体附着的识别反应调节荧光物质与能量受体之 间的能量传递，利用受光部件(发电二极管、电荷耦合掐(charge coupled device)、发电倍 增管(photomultiplier tube)等)检测荧光信号。作为标识传感器的另一实施例可以将酶作为标识物质使用，使用固定于传感器表 面的捕获识别成分10(图I(B)及(C))或酶分子上附着抗体则活性被抑制的几种酶，则可 以在识别反应单元17内进行液相反应。为了将所述酶用于免疫分析，与分析物质(即， 抗原)结合而与抗体反应，则其酶的活性被抑制(Se-Hwan I^aek等，Biotechnology and bioengeering, Vol. 56，221-231页，1997)。酶产生的信号，可以根据被选择的酶及其特 异性，可以用吸光率测量传感器(分光光度计)、受光传感器(发电二极管、电荷耦合掐 (chargecoupled device)、发电倍增管(photomultiplier tube)等受光部件)、电化学传感 器(电极)等装置测量。作为标识传感器的另一实施例，可以将磁性粒子作为标识物质使用，利用固定于 传感器表面的捕获识别成分10(图I(B)及(C))，可以测量分析物质和识别成分之间反应 的磁场((A. Perrin 等，Journal of ImmunologicalMethods，Vol. 224，77-87 页，1999)。作 为磁场测量传感器GMR/TMR及Hall部件具有代表性，其耗电较少、尺寸小而轻，可以集成设置。如上所述，结合可逆反应性抗体和传感器技术构建连续诊断系统，则无分析灵敏度的丢失，可以连续在利用抗体而实施测量分析物质。说明的连续诊断系统的浓度响应时 间以最终响应的95%为准，不能应用于以10分钟为单位浓度以秒单位变化的分析物质的 测量，只能应用于相对慢于分单位变化的分析物质的测量。尤其适合其浓度超过指定上限 时要求发出警报的分析对象。可应用的领域包括对疾病或症状的连续诊断及人工脏器控 制、生物恐怖药物连续检测、环境污染连续监视及生物工程连续检控领域等。〈发明实施的具体内容〉以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例仅是用于说明本发明，并不 用于限制本发明的范围。实验材料为本发明的实施例使用的材料及购买处如下。表面细胞质基因共鸣传感器芯 片(BIACORE CM5 ；组成成分玻璃母体，30nm厚度金薄膜，IOOnm厚度的葡聚糖(dextran) 层)、氨基偶联(amine coupling)试剂(包括 lOOmMN-hydroxysuccinimide (NHS)、400Mmn_ ethyl-N' - (dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)>IMethanolamine hydrochloride> pH8. 5)、40%丙三醇(glycerol)从GEhealthcare公司(瑞典)购买。老鼠单一克隆抗 体Q0E7、3D1 不可逆反应性)与α2-微球蛋白(a 2-macroglobulin、tetramer)是从 AB Frontier公司(韩国)购买。牛血浆脂质蛋白质(bovine serum albumin)、乙酸钠 (sodiumacetate)、磷酸钠(sodium phosphate)、氯化钠(sodium chloride)、氨基乙酸 (glycine)、人体 AB 型血清(human serum, AB plasma)、酪蛋白(casein)、金纳米粒子(gold nanoparticle, 30nm)、抗老鼠氯抗体-horseradishperoxidase (HRP)聚合物，及 3, 3，、5， 5，-tetramethylbenzidine(TMB)是从Sigma公司(美国)购买。共IgG抗体定量药剂 (mouseIgG core ELISA)由KomaBiotech公司(韩国)提供。其他所有药剂使用分析用等 级。实施例1、老鼠单一克隆可逆反应性抗体的生产生产单一克隆抗体的杂交瘤细胞的制造是根据一般的标准方法实施。具体地， 将α 2-微球蛋白作为免疫源注射到出生6周的雄性BALG/c老鼠的腹腔进行免疫后，以 两周为间隔推注三次。推注三次后第三天杀死老鼠，取出脾脏，将获得的脾细胞与骨髓瘤 (myeloma)细胞株(Sp2/0_Agl4)实施细胞融合，并从此筛选出杂交瘤细胞。杂交瘤细胞制造了合计384种的克�。�利用各个克隆生产的含抗体培养液执行了 对免疫源的反应性测试和总IgG抗体量的决定。为了测试与免疫源的抗体反应性，将克 隆培养液分别移动到在固定有用IOmM磷酸缓冲溶液(含HOmMNaCl ；pH值7. 4)稀释的 α2-微球蛋白Q.5yg/mL)的96-微板孔内进行反应。洗涤后，使得用含0. 5%酪蛋白的 IOmM磷酸缓冲溶液(酪蛋白-PBQ稀释的羊抗鼠抗体-HRP聚合体(1/5000)进行反应。再 次洗涤后，将HRP基质溶液(含有3%过氧化氢水(10 μ L)和lOmg/mL TMB (100 μ L ；稀释 于dimethylsulfoxide溶剂)的0. OSM醋酸缓冲溶液，Ph5. 1 (IOmL))添加至各个孔进行酶 反应，15分钟时添加2M硫酸而停止反应。在各个孔产生的显色信号是利用微板块读取机 (VERSAmaxTM.Molecular Devices公司，美国)在450nm吸光度下测量。并且，为了决定总 IgG，利用mouse IgG core ELISA工具(kits)根据制造公司提供的过程进行分析。根据两个分析结果，筛选了 7种同时满足抗体反应性测试时吸光度2. 0以下(下 位50% )及总IgG抗体量0. 1 μ g/mL以上(上位10% )条件的杂交瘤克隆。
棚列2、#龍1棘碰十牛仆汲配洽細靴作为表面细胞质基因共鸣传感器芯片购买的BIACORE CM5根据制造商提供的协 议，利用IOOmM NHS和400mM EDC对芯片表面进行活性化。固定于芯片表面的配合体(抗 原或抗体)的量是根据协议介绍计算并决定，利用IOmMsodium acetate (pH 4.0)缓冲溶液 将配合体稀释为一定浓度后，注入(流速=5yL/分钟)至传感器芯片内进行固定化。20 分钟后，注入6分钟IMethanolamine hydrochloride (pH8. 5)溶液使得传感器残余表面失 活。表面细胞质基因共鸣传感器系统(BIACORE 2000 ；GE healthcare公司，瑞典) 的运行是根据制造商提供的BIACORE 2000使用协议，根据测试目的，样品运行缓冲液 (running buffer)选用磷酸缓冲液或人体血清。作为设置于传感器系统内的传感器芯片 购买BIACORE CM5，在该芯片的1号流体通道上设置了作为对照品的牛血清白蛋白，2号流 体通道化学固定了配合体。在所有实施例中一致地将流体流向维持为从1号通道至2号通 道，以从2号通道的信号值(resonance unit ；RU)除去1号通道的噪音值的方式求得了纯 信号值。在所有实施例中，反应单元内温度一致维持25°C。棚列3、禾丨臓面麵臓贼口鸟泖隱細πτ繩謹秘纖以可逆反应性抗体筛选为目的，制造了如实施例2的在1号流体通道固定了 IOOg/ HiL浓度的牛血清白蛋白，在2号流体通道固定lOOg/mL浓度的α 2-微球蛋白的传感器芯 片。将所述传感器芯片设置于表面细胞质基因共鸣测量系统后，将IOmM磷酸缓冲液作为 样品运行缓冲液，以5μ L/分钟速度注入而维持平衡状态。在实施例1中通过抗体反应性 测试和总IgG抗体量决定筛选的7种杂交瘤克隆分别用IOmM磷酸缓冲液(PBS、ρΗ7. 4)适 当稀释。根据制造商提供的分析程序(BIACOREoperation 2000)，将各个抗体样品35 μ L 向设置于传感器系统内的传感器芯片内注入420秒而进行附着反应后，向磷酸缓冲溶液注 入210秒进行了分离反应。对同种抗体的分析结束后，将15yL的IOmM氨基乙酸缓冲液 (pHl. 5)注入180秒钟，使传感器表面再生。附着及分离反应方式是使用制造商提供的编辑 程序(BIAevaluation 2.0)进行分析，并计算附着速度常数(ka)、分离速度常数(kd)及平 衡附着常数(Ka)。以下表示出了 7种测试杂交瘤克隆的附着速度常数GO、分离速度常数 (kd)及平衡附着常数(Ka)。[表1]被筛选2次的杂交瘤克隆的反应特性克隆名称附着速度常数(ka) L · mol—sec-1分离速度常数(kd)， sec"1平衡附着常数(KA), L/mol1Β5 1. 13 X IO'"3. 61 XlO (1. I-IX 10.'1F82. 24 X 1(Γ3. 87 X 10 '、'δ. 79、 1U~Α2, 1-143. 74Χ1 :7. 73 X 10·:..1. s I ‘ in"Τ4-2, 23. 21 X lOr5. 41 X JO"" Γ,, κ·； ■ JuΤ1-12,7「). 1δ ·< IO11. 79 X 10 " j 二·讣■ 10·23Ε101. 31 X IOi1. 82 X 10 -7. ^iJ < IO-9Α36. 371. 00X10"56. 37 X IO5在测试的7种杂交瘤克隆中2种克隆(1B5及1F8)呈现出高亲和力的可逆反应 性，其中1B5克隆产生的抗体呈现出高于IX IO9LAioI的高亲和力，因此，认为符合本发明 目的，选择并与呈现典型的不可逆反应性的抗体20E7比较反应特性(图2)。在附着反应 时，1B5比20E7明显快速到达平衡状态，在分离反应时1B5抗体呈现出降低至几近初始值的 形状的曲线，相反，20E7呈现几乎没有分离的曲线图。因上述特性上的区别，在要求洗涤的 以往的一次性免疫分析中首选在洗涤时也不会分离的不可逆反应性20E7，相反，根据抗体 的浓度因力学平衡反应迅速附着或分离的1B5抗体可以使用于通过再利用的连续测量。由 此，提供了本发明中作为基础材料的可逆反应性抗体的存在，首先证明了与以往抗体的本 质上的特性差异。作为参考，1B5抗体和20E7抗体都对α 2-微球蛋白呈现特异反应性，附 着于所述抗原分子上的其他抗原决定基(印itope)，可以与相同的抗原分子同时反应。实施例4、可逆反应性抗体的附着/分离重复反应方式比较利用实施例3种制造的传感器芯片，在相同实验条件下求得可逆反应性1B5抗体 的附着/分离重复反应方式，并将此与不可逆反应性20E7的方式进行比较。将用IOmM磷 酸缓冲液稀释的抗体溶液(lOOng/mL 1B5或20ng/mL 20E7) 17. 5 μ L以5 μ L/分钟的流速 向传感器芯片内注入210秒来进行附着反应，之后注入磷酸缓冲液进行了 110秒钟分离反 应。在所述相同的附着/分离反应条件下，对各个抗体重复6次。结束各个抗体的分析后， 均勻注入180秒钟IOmMglycine (pH值1. 5)的缓冲液15 μ L，使得传感器表面再生。BIACore 2000测量系统的运行和数据编辑如实施例2中所述。分析结果，在图3中被预测呈现可逆反应性的1Β5抗体仅在抗体供给后1分钟内 信号增加，到达了与固定的抗原的附着反应平衡状态，并且在供给磷酸缓冲液时立即分离， 信号恢复至初始值。这样的附着/分离可逆反应方式重复6次时，呈现出高重现性。被预 测呈现不可逆反应性的20Ε7抗体在抗体供给后的规定时间内呈现出虽慢却持续的附着反 应，在供给磷酸缓冲液时未完成分离反应。由此，抗原-抗体反应结合体随附着/分离重复 反应逐渐累计，呈现出信号以阶梯式增加的图案。实施例5、可逆反应性抗体的反应下限浓度的决定利用在实施例3中制造的传感器芯片及相同的实验方法，测量了对可逆反应向 1Β5抗体浓度变化的表面细胞质基因共鸣传感器的响应。利用IOmM磷酸缓冲液，将1Β5抗 体稀释为0. 5pg/mL至0. 5 μ g/mL范围的浓度。将稀释的各个抗体溶液17. 5 μ L以5 μ L/分钟的流速注入210秒钟来进行附着反应，之后，注入110秒磷酸缓冲液进行分离反应。在 相同条件下，从低浓度抗体溶液至高浓度抗体溶液依次进行分析，再逆顺序分析而完成一 次循环测试。循环测试结束后，通过与实施例4相同的方法再生传感器表面。在图4中，在使用的抗体浓度范围内，表面细胞质基因共鸣传感器的信号在抗体 溶液浓度阶段性增加时成比例地增加，在浓度阶段性降低时成比例地降低。特别是，在抗体 浓度范围pg/mL以下也呈现出与固定于传感器芯片的抗原反应，与以往的用于免疫分析的 不可逆反应性抗体相比，其亲和力并不差。由此，预测设置有具有如1B5的反应特性的抗体 的免疫分析系统会呈现优越的分析灵敏度，并且其抗体从Pg浓度单位至μ g单位为止呈现 反应性，因此，以后利用于免疫传感器制造时预计会有较宽的测量范围。棚列6、胃柯繩盼·免藤龍胃会充白_聿为了构建利用可逆反应性抗体的α 2-微球蛋白测量用连续步骤外露类型非标 识传感器(图1(A))系统，使用了表面细胞质基因共鸣传感器系统(BIAC0RE 2000)和固 定有可逆反应性抗体的BIACORE CM5传感器芯片。如实施例2中所述，在1号流体通道以 100 μ g/mL浓度固定牛血清白蛋白，在2号流体通道以10 μ g/mL浓度固定可逆反应性1B5 抗体来制造了传感器芯片。用IOmM磷酸缓冲液稀释与所述固定于传感器表面的抗体进行 特异性反应的分析物质-微球蛋白，制造了 O-lOng/mL浓度范围的标准样品。将各个标准 样品(150 μ L)以10 μ L/分钟的流速向设置于传感器系统内的传感器芯片内注入900秒来 进行附着反应后，注入120秒钟磷酸缓冲液而进行分离反应。在对各个样品的分析结束后， 如实施例4，使得传感器表面再生，用人类血清代替磷酸缓冲液作为稀释溶液和样品运行缓 冲液使用，并在与上述相同的条件下重复实验。利用表面细胞质基因共鸣传感器，在免疫分析领域首次构建了基于可逆反应性抗 体的分析系统，所述分析系统在采用的分析物质浓度为0. Ι-lOng/mL范围内呈现出浓度响 应，其典型的测量灵敏度的检测下限浓度为0. Ing/mL以下(图5(A))。为测试所述系统的 分析特异性，将接近医疗临床测试条件的人类血清作为样品运行缓冲液及标准样品稀释溶 液进行测量的结果(图5(B))，呈现与使用磷酸缓冲液的时候(A)非常类似的浓度响应。由 此可知，基于可逆反应性抗体1B5的传感器系统在测量灵敏度和特异性方面非常优越，尤 其是可以适用于实际的医疗临床测试中。实施例7、使用标识有金纳米粒子的检测抗体的信号放大实施例7. 1.检测抗体-金纳米粒子的聚合体的制造根据将柠檬酸钠(sodium citrate)作为还原剂的标准方法制造金胶体(直 径约 30nm)的悬浮液(Suspensions)(L. A. Dykman, Α. Α. Lyakhov, V. Α. Bogatyrev, S. Y. Chchyogolev. Colloid，60，700，1998)。具体地，在玻璃烧瓶中放入IOOOmL的3次去离 子水后，添加氯化金溶液(tetrachloroauricacidUOmL。为了帮助反应，使用热板加 热溶液，为了制造金胶体，添加了将0. 2μπι的过滤器作为还原剂过滤的柠檬酸钠溶液 40mL。刚刚添加了柠檬酸钠后，溶液从浅黑色变成红色。加热10分钟后停止反应，在常温 下慢慢冷却后进行冷藏保管在之后的实验中使用。在制造的金纳米粒子悬浮液(ImL)中加入0. 5M碳酸盐(carbonate)缓冲液(pH 值9. 6 ;1 μ L)将PH值调节到8. 0左右。在该溶液中添加用IOmM磷酸缓冲液(PB ；不包括 NaCL)稀释至150 μ g/mL浓度(100 μ L)的不可逆反应性抗体20E7 (参照图2)。在室温下反应一个小时后，添加包括5%酪蛋白的PB (酪蛋白-PB ；122 μ L)，并在室温下再反应一个 小时。将该混合液在16000rpm条件下离心分离30分钟后，废弃上部清澈液体，在沉淀物中 加入酪蛋白-PB (400 μ L)溶解。再次在16000rpm条件下离心分离30分钟后，废弃上部清 澈液体，加入酪蛋白_ΡΒ(50μ L)进行溶解，使得以金粒子为基准浓缩为20倍。^MM 7. 2.采用信号放大时 ΥτΗ斤系统浓Itn向应用人体血清稀释作为分析物质的α 2-微球蛋白制造了 O-lOng/mL浓度范围的 标准样品，各个样品在注入至设置于传感器系统的传感器芯片内之前，与实施例7. 1中制 造的检测抗体-金纳米粒子聚合体lOng/mL在室温条件下反应10分钟。将该反应混合物 (150 μ L)以IOyL/分钟速度向实施例6中制造的传感器芯片内注入900秒来进行附着反 应后，以相同的速度注入120秒人体血清进行分离反应。对各个样品的分析结束后，如实施 例4，使得传感器表面再生。在图5中，采用上述信号放大步骤的分析系统的浓度响应与实施例6中求得的非 标识传感器系统的浓度响应相比明显增加，实际上分析灵敏度从0. Ing/mL水平(图5(B)) 变为0. OOlng/mL，提高了约100倍。利用本发明公开的信号放大方法，对样品内的低浓度存 在的分析物质也可以进行测量，因此，利用可逆反应性抗体的连续检测方法可以广泛应用 于各种分析物质测量。实施例8.流谏降低时的分析系统浓度响应方式就医疗临床样品来说，尤其需要减少其使用量，因此，将微细流体的流速降低至以 往的1/10求分析系统的浓度响应。利用与实施例6中相同的传感器芯片，除了流速的降低， 其他条件都相同的条件下进行实验。作为样品运行缓冲液和标准样品使用了人体血清，流 速维持在IyL/分钟。标准样品筛选O-lOOng/mL浓度范围，将样品(15yL)注入至传感器 芯片内进行900秒钟附着反应后，注入磷酸缓冲液进行420秒钟分离反应。分析方式采取 从低浓度到高浓度依次分析标准样品之后再回到低浓度的循环形式。分析系统的运营和数 据编辑与实施例4相同地进行，分析结束后，如上述使得传感器表面再生。在图1中，随分析物质浓度的增减的传感器响应与分析物质浓度成比例(图 7(A))，与在流速快10倍的条件下获得的结果相比，其响应方式的分析灵敏度为约0. Ing/ mL，响应时间为640秒(以最终响应95%为准)，呈现稳定维持。并且，以曲线图比较(图 7 (B))浓度响应，则在被测试的流速范围内并没有呈现明显的区别，并且在分析物质浓度增 加时和浓度降低时测量的浓度响应之间也无区别。作为特别事项，流速相对较快时(10μ L/ 分钟)在高浓度标准样品分析过程中出现的多余响应现象(参照图5，分析物质浓度= lOng/mL时的响应)在流速降低时(1 μ L/分钟)明显缓和(参照图7，分析物质浓度= 10ng/mL或其以上时的响应)。实施例9、对指数性浓度变化的连续测量为了测量可逆反应性抗体的附着及分离反应，在上述实施例中使用了在各个样品 分析之间注入样品运行缓冲液(未包含分析物质)的重置模式，相反，在本实施例中为了说 明可逆反应性抗体的再利用，使用了样品连续分析模式。传感器芯片使用了实施例6中制 造的传感器芯片，用人体血清稀释微球蛋白而制造了 O.Ol-lOOOOng/mL范围的标准样品。 将标准样品依次以1 μ L/分钟速度注入至传感器芯片内，连续求得了分析物质浓度每900 秒以阶梯式增加、降低10倍的循环变化重复两次时传感器的浓度响应，传感器系统在连续模式下的运行与传感器系统制造商设置的重置分析工序不同，样品注入并不通过注入口， 而是利用样品运行缓冲液供给通道执行。连续供给样品时，为了防止标准样品注入之间的 断开或空气入侵，在之前残余样品溶液中添加指定的分析物质浓缩液或稀释液来调整为下 一样品的标准浓度，并持续混合而获得均勻的浓度。用收集装置收集分析后被流出的样品，各个分部根据以微孔板(mi crowell plate)为固定化母体的三明治酶免疫分析，确认了标准样品的分析物质浓度。其采用的分 析方法是，针对用IOmM磷酸缓冲液(包括140mM氯化钠；pH值7. 4)稀释的α 2-微球蛋白， 将不可逆反应性的3D1单一克隆抗体(lyg/mL;100yL)加入至各个微孔板内而固定。洗 涤后，加入含有0.5%酪蛋白的IOmM磷酸缓冲液(酪蛋白_PBS)200yL，对未固定的孔残余 表面进行封阻(blocking)。再次洗涤后，在利用收集装置按时间收集的分部溶液(30yL) 中追加注入含有0.5%酪蛋白及0. tween的IOmM磷酸缓冲液(酪蛋白-tween-PBS ； 70 μ L)，将所有样品(100 μ L)加入固定有抗体的孔进行反应。洗涤后，将相对于α 2-微球 蛋白具有不可逆反应性的20Ε7单一克隆抗体上结合有HRP的20E7-HRP聚合体(1 μ g/mL ； 100 μ L)用酪蛋白-tween-PBS进行稀释，注入至孔进行反应。再次洗涤后，将HRP基质溶液 (参照实施例1)加入至各个孔来执行酶反应后，在15分钟后添加2M硫酸停止反应。在各 个孔产生的显色信号是利用微板读取机(VERSAmaxTM、Molecular Devices公司，美国)在 450nm吸光度下进行测量的。在连续测量后收集为连续测量提前计算而设定的各个标准样品的浓度，如上所述 通过免疫分析而确认实际浓度的结果，计算值与分析结果之间有10%以内的差异，因此，将 计算值应用于曲线图的制定。对以指定的微细流体流速(lrnL/分钟)注入至传感器内的标 准样品内分析物质浓度的增加或降低的传感器响应，在15分钟以内达到了平衡状态，两次 重复循环时，呈现较高的再现性(图8(A)；在O.Ol-lOOng/mL浓度范围测试的结果)。图示 通过所述连续测量方式测量的传感器浓度响应的标准曲线(图8(B))与以重置模式测量的 曲线有所区别，已经明确这是因为传感器系统的运行上的区别所致。通过以上结果可知，对 分析物质浓度变化的连续测量实际上是可行的，并也启示了临床试验上的应用可能性。^mm小儿肾癌标识劝路阳农应用根据分析物质的种类，发病或者症状发现时的浓度的增减变化方式(指数性或算 术性)可能有些不同，因此，如实施例9，以连续模式测量了对增加并降低两倍或其以下的 算术性浓度变化的传感器浓度响应。在本实验中使用了以诊断将作为模范分析物质筛选的 α 2-微球蛋白作为生物标识使用的小儿肾癌为目的的最佳条件。即，为了减少血清样品是 用来，用酪蛋白-PBS稀释分析物质而制造标准样品，其浓度范围决定为可疑维持最佳分析 性能的l-20ng/mL范围。以1800秒为间隔将各个标准样品注入至各个传感器芯片，流速调 节为IyL/分钟。在图9中，传感器对算术性水平的连续浓度变化的响应与对指数性变化相同，呈 现出迅速的响应时间和连续测量再现性。尤其，从对微小的浓度变化也敏感而迅速反应来 看，基于可逆反应性抗体的生物传感器今后可以广泛应用于需要精确分析的分析物质的测 量上。尤其，α 2-微球蛋白的临床有效浓度变化范围为3-10mg/mL，如果将血清样品直接使 用于连续测量，则一天需要1.44!^(1口17分钟注入速度为基准)。由此，需要最少化样品 量，因此，本实施例中使用IO6倍的稀释，稀释为较低的浓度范围，使得在实际临床测试时实现1. 44nL/天左右的极少量血清消耗。并且，在所述分析条件下可以实现对分析物质浓度 变化的信号变化幅度的增加，即可以提高分析精确度。工业利用性如上所述，通过本发明可以连续再利用一定量的可逆反应性识别成分来实时测量 分析物质浓度变化。这表示，如果再利用根据分析物质浓度迅速可逆反应的抗体，则与先前 的一次性诊断片相比，其构件及制造方法明显简化。另外，可以对疾病或症状进行实时监 控，可实现对慢性疾病或高危患者的连续监控。除此之外，还可以适用于人工脏器控制装 置、恐怖分子的生物武器连续检测系统产品、人畜共患病的感染病原体连续检测系统产品、 环境污染源连续监控系统产品、生物工程连续监控系统产品、食品生产工艺连续监控系统
)口口 寸。


图1是本发明中在样品分析站内连续再利用捕获识别成分10来测量分析物质 的浓度变化的(A)连续步骤外露类型非标识传感器；(B)连续步骤外露类型标识传感器； (C)识别反应单元类型非标识传感器；及(D)识别反应单元类型标识传感器的模式示意图。图2是作为本发明中捕获识别成分的示例，为了分析由老鼠杂交瘤克隆体产生 的呈现可逆反应性的抗体(1B5)和呈现典型的不可逆反应性的抗体O0E7)的附着及分离 反应特性，通过传感器表面上固定有的抗原，即分析物质(以α2_微球蛋白作为范例)的 表面细胞质基因共鸣传感器系统测量的曲线图及由此决定的速度常数与附着平衡常数的 比较示意图。图3是为了利用图2中的传感器系统对基于两种抗体1Β5及20Ε7的反应特性 之差的连续测量实现可能性进行测试，对其循环反复测量结果进行比较的曲线图。图4是为了利用图2中的传感器系统对作为可逆反应性抗体的1Β5的对抗原的 亲和力进行测试，对抗体进行连续稀释，并根据浓度的增减与固定于传感器上的抗原反应 而获得的结果示意图。图5是为了评估可逆反应性抗体1Β5能否应用于医疗临床用诊断，将1Β5抗体 固定于传感器表面后，将抗原，即分析物质随浓度增加与固定的抗体反应，作为样品运行缓 冲液使用(A)磷酸缓冲溶液及(B)人类血清而获得的结果的比较示意图。图6是为了提高图5中传感器系统的分析灵敏度，附加导入直径为30nm的金胶 体粒子作为标识物质14、以及与不可逆抗体20E7的聚合物作为检测识别成分13，而获得的 信号放大结果示意图。图7是使用图5中的传感器系统，为了使样品使用量最小化，在将传感器芯片内 的微细流体流动速度降低为以往实验条件的1/10的条件下，根据分析物质浓度的增减的 传感器响应结果示意图。图8是为了示例可逆反应性抗体的再利用，以连续测量模式运行传感器表面固 定有抗体1B5的表面细胞质基因共鸣传感器系统，重复两次对分析物质(α 2-微球蛋白) 的浓度连续增加、降低10倍的的变化，用传感器求得㈧浓度响应结果及⑶曲线图的标 准曲线示意图。图9是利用图8中的传感器系统，传感器对分析物质的浓度增加或降低两倍或两倍以下的数学浓度变化的浓度响应结果示意图。符号说明
10捕获识别成分
11分析物质
12非标识传感器
13检测识别成分
14标识物质
15标识传感器
16半透膜
17识别反应单元
权利要求
1.一种分析物质的实时连续检测装置，包括样品流入通道、样品分析站及样品排出通 道，其特征在于，所述样品分析站包括检测从可逆反应性的捕获识别成分及样品内的分析 物质-捕获识别成分的结合体所产生的信号的传感器。
2.根据权利要求1所述的分析物质的实时连续检测装置，其特征在于，所述可 逆反应性的捕获识别成分具有在与样品内的分析物质反应时附着速度常数GO为 1 X IO5Lmor1Sec-1 至 1 X IO8Lmor1Secr1,分离速度常数(kd)为 1 X KT3SecT1 至 1 X lO—secT1 范 围的可逆反应特性，同时具有平衡附着常数(KA = ka/kd)为lXl(fL/mol以上的高亲和力。
3.根据权利要求1所述的分析物质的实时连续检测装置，其特征在于，所述可逆反应 性的捕获识别成分可以与作为样品内的分析物质的生命体的代谢物质、蛋白质、荷尔蒙、核 酸、细胞、食品检查对象物质、环境有害物质或国防化学生物放射性测量物质进行特异性结 合的抗体、受体、核酸、酶、适配子、多肽或分子印刷人工膜。
4.根据权利要求1所述的分析物质的实时连续检测装置，其特征在于，所述传感器为 直接检测由分析物质-捕获识别成分的结合体所产生的信号的非标识传感器，或是对经过 与分析物质-捕获识别成分的结合体的密度成比例而产生信号的标识物质进行检测的标 识传感器。
5.根据权利要求4所述的分析物质的实时连续检测装置，其特征在于，所述非标识传 感器为表面细胞质基因共鸣传感器、悬臂传感器、光波导传感器、光干涉传感器或纳米传感ο
6.根据权利要求4所述的分析物质的实时连续检测装置，其特征在于，所述标识传感 器是使用荧光体、发光体、酶、金属粒子、塑料粒子、磁性粒子或纳米粒子作为标识物质的荧 光、发光、显色、电化学或磁场检测传感器。
7.根据权利要求1所述的分析物质的实时连续检测装置，其特征在于，所述样品分析 站被筛选性地只透过样品内分析物质的半透膜分割，在固定有捕获识别成分的传感器表面 一侧形成识别反应单元。
8.根据权利要求7所述的分析物质的实时连续检测装置，其特征在于，使用标识传感 器时，在所述识别反应单元内锁住与具有无法通过半透膜的尺寸的标识物质结合的检测识 别成分，然后进行再利用。
9.根据权利要求8所述的分析物质的实时连续检测装置，其特征在于，为了与捕获识 别成分一起被连续再利用，所述识别反应单元内的检测识别成分也具有可逆反应性。
10.一种使用权利要求1至9中的任意一项的实时连续检测装置的分析物质的实时连 续检测方法，其特征在于，包括如下步骤(a)将包括分析物质的样品通过所述样品流入通道注入样品分析站内的步骤；(b)将所述分析物质与样品分析站内的可逆反应性的捕获识别成分结合的步骤；(c)用传感器检测由所述分析物质和捕获识别成分的结合所产生的信号的步骤；(d)根据样品的持续流入或洗涤液的流入，所述分析物质和捕获识别成分的结合被分 离，分析物质通过所述样品排出通道排出的步骤；(e)连续再利用所述分离的捕获识别成分，重复所述(b)至(d)的步骤，从而实时测量 样品内分析物质的浓度变化的步骤。
11.根据权利要求10所述的分析物质的实时连续检测方法，其特征在于，在所述(c)步骤中，使用非标识传感器直接检测由分析物质-捕获识别成分的结合体所产生的信号，或 者通过与分析物质-捕获识别成分的结合体的密度成比例地产生信号，通过标识传感器测量信号。
12.根据权利要求11所述的分析物质的实时连续检测方法，其特征在于，使用所述非 标识传感器时，包括于样品的分析物质通过样品流入通道连续流入样品分析站内，与捕获 识别成分反应。
13.根据权利要求11所述的分析物质的实时连续检测方法，其特征在于，使用所述标 识传感器时，样品内的分析物质事先与结合有标识物质的检测识别成分反应后，通过样品 流入通道连续流入样品分析站内并与捕获识别成分反应(连续步骤外露类型)；或者，样品 内的分析物质通过样品流入通道连续流入样品分析站内后，与和识别反应单元内的标识物 质结合的检测识别成分及捕获识别成分反应(识别反应单元类型)。
14.根据权利要求13所述的分析物质的实时连续检测方法，其特征在于，在连续步骤 外露类型时，所述检测识别成分事先与分析物质反应并被供给，因此具有结合稳定性高的 不可逆反应特性；或者，在识别反应单元类型时，所述检测识别成分为了与捕获识别成分一 起被连续再利用，也具有可逆反应特性。
15.根据权利要求13所述的分析物质的实时连续检测方法，其特征在于，在使用识别 反应单元类型的标识传感器时，利用接近的荧光物质(标识物质)与荧光能量受体之间的 能量传递被捕获识别成分与分析物质的反应所妨碍而产生荧光信号的原理，或者在固定于 酶分子(标识物质)上的分析物质与识别成分结合时，不将捕获识别成分固定于传感器上， 而是用标识物质将已知活性被抑制的酶在液相进行识别反应。
16.一种用于权利要求1至9中的任意一项的实时连续检测装置的可逆反应性的捕获 识别成分的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤(a)准备捕获识别成分的步骤；(b)将所述捕获识别成分与固定于传感器表面的分析物质结合的步骤；(c)利用传感器检测通过所述捕获识别成分和分析物质的结合所产生的信号的步骤；(d)通过流入洗涤液分离所述捕获识别成分与分析物质的结合的步骤；(e)利用传感器检测通过所述分离后剩余的捕获识别成分和分析物质的结合而产生的 信号的步骤；(f)选择所述(e)步骤中的检测信号低于所述(c)步骤中的检测信号的捕获识别成分 的步骤。
17.根据权利要求16所述的可逆反应性的捕获识别成分的筛选方法，其特征在于，所 述传感器为选自表面细胞质基因共鸣传感器、悬臂传感器、光波导传感器、光干涉传感器、 纳米传感器的非标识传感器。
18.根据权利要求16所述的可逆反应性的捕获识别成分的筛选方法，其特征在于， 所述捕获识别成分与固定于传感器表面的分析物质反应时，具有附着速度常数GO为 1 X IO5Lmor1Sec-1 至 1 X IO8LmoF1Sec"1,分离速度常数(kd)为 1 X KT3SecT1 至 1 X lO—secT1 范围的可逆反应特性，同时具有平衡附着常数(KA = ka/kd)为力5 IXlOVmol以上的高亲和 力。
19.根据权利要求16所述的可逆反应性的捕获识别成分的筛选方法，其特征在于，在所述(a)步骤中，所述捕获识别成分被搬运溶液稀释而连续注入，在所述(f)步骤中，选择 信号随时间增加而减少的捕获识别成分。
20.根据权利要求16所述的可逆反应性的捕获识别成分的筛选方法，其特征在于，在 所述(a)步骤中，所述捕获识别成分与洗涤液反复循环并被注入，在所述(f)步骤中，选择 信号随时间增加后重新回到初始基准线的信号模式的捕获识别成分。
全文摘要
本发明涉及一种分析物质的实时连续检测装置，包括样品流入通道、样品分析站及样品排出通道，所述样品分析站包括检测从可逆反应性的捕获识别成分及样品内的分析物质-捕获识别成分的结合体所产生的信号的传感器。根据本发明，可以通过连续再利用一定量的可逆反应性的捕获识别成分来实时测量分析物质浓度变化。本发明的实时连续检测装置可以应用在生命体的代谢物质、蛋白质、荷尔蒙、核酸、细胞、食品检查对象物质、环境有害物质或国防化学生物放射性测量物质等的检测或分析上，因此，可以应用于医疗、公共卫生、国防、环境、食品、兽医、生物技术产业上。
文档编号G01N35/00GK102105798SQ200980123299
公开日2011年6月22日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月18日
发明者白世焕, 赵贤奎 申请人:高丽大学校产学协力团