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专利名称：一种毛细管色谱柱筛板制作和装填的新方法
技术领域：
本发明属于分离科学领域中的毛细管色谱和电色谱分离。
背景技术：
对于少量复杂样品的分离分析是从事该领域科技工作者所面临的巨大挑战和课题，也是该领域发展的重要的机遇和推动力。特别是人类、老鼠和水稻等基因组计划的完成和不同器官、组织、细胞以及亚细胞蛋白质组计划的逐步启动，对分离分析工作提出了愈来愈高的要求。一般生物样品的特点是量少，成分复杂，而人们又需要知道其中数以万计的生物大分子的定性、定量以及相互作用的信息，所以分离效率高且上样量小的分离方法——毛细管色谱和毛细管电色谱就成了必然的选择，而毛细管色谱柱的成功制作则是影响毛细管色谱和毛细管电色谱分离的重要因素，因此本专利提出的毛细管色谱柱筛板的制作和装填方法具有重要意义。
目前毛细管色谱柱筛板的制作和装填方法中存在以下问题。
1、毛细管色谱柱筛板的制作通常采用烧结法、就地聚合法、两通阀固定不锈钢筛板方法以及用粘和剂固定过滤膜方法，这些方法的共同缺点是费时费力，制作成本高，而且不易操作。除此之外，烧结法制作的筛板易于脱落而且烧结温度和时间不易掌握；就地聚合法制作筛板时操作步骤繁多，所需原料种类多，反应条件不易控制；用两通阀固定不锈钢筛板时，不锈钢筛板不易制作且不易与毛细管紧密配合；用粘和剂固定过滤膜至少需要24小时的固化时间，而且不易控制粘和剂在滤膜周围的分布。
2、通常装填毛细管色谱柱时，是将匀浆液首先装填于一个带有电磁搅拌的容器中，然后将该容器与毛细管联接并和提供压力的钢瓶或高压恒流泵相连。由于容器中的匀浆液需要电磁搅拌，所以需要较大的容器以便放入磁子，对于仅装填几毫克、甚至毫克以下色谱介质的毛细管而言，既浪费色谱介质，又使装卸困难，费时费力。
3、用较细的匀浆管装填毛细管时，通常采用超声波使色谱介质和溶剂匀浆化，不易达到目的，而且使装柱过程复杂化。
4、传统的装填毛细管色谱柱时，需要专门的装置和配件，增加实验成本和难度。
5、在用高压氮气提供压力时，由于不易提供较大的压力，所以难于装填较长的毛细管色谱柱，而且容易使毛细管色谱柱中色谱介质干裂，降低色谱分离效率。
6、在用真空抽提方法装填毛细管色谱柱时，由于一般真空泵难于提供较高的真空度，所以无法填充较长的毛细管色谱柱，而且需要配置专门的真空泵，增加装柱成本。
本发明的目的正是为了解决以上存在的问题，发明了一种新的毛细管色谱柱筛板的制作和装填的方法。其特点是简单、快速，成本低，分离效率高。

发明内容
毛细管色谱柱筛板制作和装填新方法是一种用于毛细管色谱柱筛板制作和装填的专用方法。如附图1所示，该方法主要包括两方面的内容1、毛细管色谱柱筛板制作。毛细管色谱柱筛板制作方法适用于装填各种色谱介质的各种规格的毛细管。筛板材料为孔径小于色谱介质颗粒直径的聚四氟乙烯膜或实验室中常用的有机溶剂过滤膜等具有一定强度的过滤膜。首先从选用的膜上裁剪直径与紧固毛细管的塑料管外径相同的滤膜数片，置于两通阀的一端，用带有刃环的空心螺母和弹性塑料管将出口端毛细管与滤膜一起固定于两通阀的一端，用同样方法将毛细管柱固定于另一端，如此，便制作成一个毛细管色谱柱筛板。装完柱后，用同样的方法可以制作另一端的筛板。
2、毛细管色谱柱装填装置。将一端有筛板的毛细管与可弯曲且具有足够耐压强度的不同规格不锈钢或工程塑料管以及能提供足够压力的、流速在10～0.001mL/min高压泵联接，用一橡皮筋将匀浆管固定于旋涡混合器一侧或凸面上，组成一个如附图1所示的装填毛细管色谱柱的装置。匀浆液的浓度一般为1～10mg/100μl，总体积可根据毛细管内径和需要装填的长度确定。将匀浆液超声大约20min后，可用类似移液管移液的方法吸入匀浆液，也可以先将匀浆管弯曲成U型，用加样枪加入匀浆液，再与毛细管柱和高压恒流泵联接。打开旋涡混合器数分钟后，选定一定流速，进行装柱。达到所需柱长后，停止装柱，对毛细管色谱柱进行冲洗、老化处理和柱效测定。


图11，两通阀；2，毛细管色谱柱；3，过滤膜；4，连接毛细管；5，加样枪；6，刃环和空心螺母；7，匀浆管；8，高压恒流泵；9，旋涡混合器A为毛细管色谱柱筛板制作示意图。裁剪直径与刃环锥端直径相同的过滤膜(3)并将其置于两通阀(1)内孔的一端，切割适当长度和内径的毛细管(20和(4)，按附图1A所示的方法，用带有刃环的空心螺母和塑料软管将毛细管和过滤膜固定于两通阀中，制成毛细管色谱柱筛板。
B为给匀浆管中加匀浆液。选择适当内径和长度的匀浆管(70，将其弯曲成U型，用加液枪5加入色谱介质匀浆液。
C为毛细管色谱柱装柱过程。用两通阀(1)将匀浆管(7)、毛细管(2)和(4)与高压恒流泵(8)连接，并将旋涡混合器(9)置于U型匀浆管的底部，开启旋涡混合器数分钟后，开启高压恒流泵装柱，直至所需长度为止。
具体实施例方式
1、反相毛细管色谱柱对肌红蛋白的胰蛋白酶裂解液的分离仪器戴安公司Nano LC色谱系统和Micromass公司Q-TOF Micro质谱仪毛细管色谱柱40cm×75μm i.d.；色谱介质C18反相色谱填料，3μm，120色谱条件流动相A，2％乙腈水溶液+0.1％甲酸；流动相B，20％乙腈水溶液+0.1％甲酸流速，0.2μl/min，检测波长，214nm；线性梯度，0-30min，100％A-60％B；30-35min，60％B-100％B；35-85min，100％B-100％B，85-90min，100％B-100％A，100％A延长到100min。
样品肌红蛋白的胰蛋白酶酶解液，浓度为5.6pmol/μl；上样量，5μl。色谱图见附图2。
2、反相毛细管色谱柱对血浆全蛋白的胰蛋白酶裂解液的分离仪器戴安公司Nano LC色谱系统和Micromass公司Q-TOF Micro质谱仪毛细管色谱柱40cm×75μm i.d.；色谱介质C18反相色谱填料，3μm，120色谱条件流动相A，2％乙腈水溶液+0.1％甲酸；流动相B，20％乙腈水溶液+0.1％甲酸线性梯度，0-30min，100％A-60％B；30-35min，60％B-100％B；35-85min，100％B-100％B，85-90min，100％B-100％A，100％A延长到100min。
样品肌红蛋白的胰蛋白酶酶解液，浓度为5.6pmol/μl；上样量，5μl。色谱图见附图3。
权利要求
1.毛细管色谱柱筛板制作和装填新方法是一种用于毛细管色谱柱筛板制作和装填的简单、快速、高效、成本低并且易于实施的专用方法，其特征在于毛细管色谱柱的装填装置由需要装填的各种规格的毛细管、各种色谱介质、两通阀和不同孔径的滤膜构成的筛板、可弯曲且具有足够耐压强度的不同规格不锈钢或工程塑料管、提供足够压力的、流速在10～0.001mL/min高压泵和旋涡混合器组成。所装填的毛细管色谱柱适用于小分子、生物大分子和多肽等的色谱分离或电色谱分离。
2.根据权利要求1所述的各种规格的毛细管，其特征在于它们为适合于毛细管色谱柱制作的各种规格和材料的毛细管，如不同规格的玻璃管、不锈钢管和工程塑料管等。
3.根据权利要求1所述的各种色谱介质，其特征在于色谱介质的形状是颗粒状或膜堆状，可用高压匀浆方法装填的各种色谱模式的色谱介质。
4.根据权利要求1所述的两通阀和不同孔径的滤膜构成的筛板，其特征在于耐酸碱、耐压力并能与所分离对象兼容的不锈钢、钛合金或各种工程塑料制作的不同规格、死体积小的两通阀，配合耐酸碱和有机溶剂并具有一定弹性、外径与毛细管外径略大的塑料管，将毛细管和具有足够强度和孔径小于所装填色谱介质颗粒直径的工程塑料膜，如聚四氟乙烯膜或有机溶剂过滤膜等固定于毛细管的一端或两端，构成毛细管色谱柱的筛板。也可用内径小于所装填色谱介质颗粒直径毛细管代替滤膜构成毛细管色谱柱一端的筛板，与小体积流通池相连接或与质谱相连接。
5.根据权利要求1所述的不同规格不锈钢或工程塑料管，其特征在于可根据所装填的毛细管的内径和长度及耐压要求选定不同长度、内径和壁厚的不锈钢或工程塑料管，装填不同浓度的色谱介质匀浆液。
6.根据权利要求1所述的高压泵，其特征在于可提供满足装柱所需压力和10~0.001mL/min流速的各种型号高压恒流泵。
7.根据权利要求1所述的旋涡混合器，其特征在于不同型号的旋涡混合器可通过在线或间断方式的旋涡震动，保证装柱过程中色谱介质和溶剂处于匀浆状态。
8.根据权利要求1所述的小分子、生物大分子和多肽等的色谱分离或电色谱分离，其特征在于毛细管色谱柱可用于复杂和少量小分子混合物或基因工程细胞提取液或分泌物质的高效分离，亦可用盐缓冲液从植物或动物体的提取物的分离以及多肽混合物的分离。
全文摘要
本发明涉及一种简单、快速、成本低地制作毛细管色谱柱筛板的新技术和可靠、高效的装柱方法。本发明与已有技术比较，具有以下优点1.本方法采用常用的高效液相色谱联接管作为匀浆管，不需要容积较大的专门装置，非常适合于装填仅需数毫克填料的毛细管色谱柱。同时采用旋涡混合器震荡，可克服采用超声波震荡时匀浆管中匀浆液不易保持匀浆状态的缺点，避免了填料分级，柱效高。2.本方法采用了可弯曲的不锈钢或工程塑料管，所以装填匀浆液时，可先将匀浆管弯曲成U型，再用加样枪加入超声过的匀浆液，便于操作，省时省力。3.本方法可采用实验室中常用的高压恒流泵进行装填，不需要专门的装柱机或高压氮气瓶提供压力，装柱效率高，成本低。
文档编号G01N30/56GK1532545SQ0312104
公开日2004年9月29日 申请日期2003年3月21日 优先权日2003年3月21日
发明者钱小红, 张养军, 王京兰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 中国人民解放军军事医学科学院放射医