专利名称：基于移动反应界面电泳的高通量蛋白质滴定方法
技术领域：
本发明涉及的是一种电化学方法分析材料的方法，具体是一种用于生物样品中蛋白质含量检测的基于移动反应界面(moving reaction boundary, MRB)电泳的高通量蛋白质滴定方法。
背景技术：
蛋白质是食品(如牛奶)中的主要营养成分之一。检测食品中蛋白总含量对于衡量食品营养价值、判定商品价格、评定食材质量等方面有很大的意义(Moore，J.C.，DeVries, J.W.，Lippj Μ.，Griffiths, J.C.，Abernethyj D.R.，2010，Comper.Rev.FoodSc1.Food Saf.，9，330-357.)。并且蛋白质含量分析在临床医学诊断中具有重要应用(康熙熊，临床电泳，人民卫生出版社，2006年)。凯氏定氮法已成为各种生物样品蛋白含量标准方法之一(Kjeldahl, J.Z.，1883，Anal.Chem.，22，366-382.)，其他方法还有 Dumas 法(Thudichum, J.L.ff.，Wanklyn, J.A.，1869，J.Chem.Soc.，22，277-292.)、染料结合法(CoIenbrander, V.F., Martin, T.G..1971, J.DairySc1., 54, 531-533) > 光谱法(Kennedy, J.F., White, C.A., Browne, A., 1985, J.FoodChem., 18, 95-112.)等。其中凯氏定氮法和Dumas法都容易受非蛋白氮(non protein nitrogen, NPN)的影响。许多不法分子在食品中添加NPN (如三聚氰胺、尿素)，如若用凯氏定氮法或Dumas法检测已添加NPN的食品的蛋白质含量，会导致测得结果比实际值高(Moore，J.C.，DeVries, J.ff., Lipp, Μ., Griffiths, J.C., Abernethy, D.R., 2010, Comper.Rev.Food Sc1.FoodSaf.，9，330-357.)。而三聚氰胺的过多摄入会引起肾结石、血尿，最后导致急性肾功能衰竭(Lam, C.ff., Lan, L., Che, X., Tam, S., Wong, S.S.Y., Chen, Y., Jin, J., Tao, S.H., Tang, X.M.，Yuen, K.Y.，2009，Clin.Chim.Acta, 402，150-155.)。尿素的添加会降低食品营养价值，甚至影响人类身体健康(Trivedi, U., Lakshminarayana, D., Kothari, 1., Patel, N., Kapse,H., Makhi j a, Κ., Patel, P., Panchal, C., 2009, Sensor Actuator.B-Chem., 140, 260-266.)。因此，有必要提出一种既可以准确测定蛋白含量，又不受NPN影响的测定食品等样品中蛋白含量的可靠方法。目前已经有一些分析方法可以减少NPN的影响，测定复杂样品中的某种特定的蛋白质，如亲和色谱法(Goshe, M.B., Conrads, T.P., Panisko, E.A., Angel I, N.H.，Veenstra, T.D.，Smith, R.D.，2001，Anal.Chem.，73，2578-2586.)、亲和毛细管电泳法(Armenta, J.M., Gu, B., Humble, P.H., Thulin, C.D., Lee, Μ.L., 2005, J.Chromatogr.A, 1097，171-178.)、生物传感器(Setford, S.J.，White, S.F.，Bolbot, J.A.，2002，Biosens.Bioelectron.，17，79-86.)等。尽管这些方法可以排除NPN的影响,但它们的专一'丨生导致只能测定样品中的一种或几种蛋白质，但对总蛋白含量的准确度不是很高。除此之外，这些方法往往需要昂贵的仪器设备，操作复杂，测定时间较长。在移动反应界面(moving reaction boundary, MRB)体系中，阳极端的H+和阴极端的OF在电场的作用下分别向阴极和阳极移动，当两离子相遇时会形成MRB0 MRB移动方向与这两种离子的流通量有关，当H+流通量大于OH_流通量时，界面移向阴极；反之，会向阳极移动；当两者流通量相等时，界面静止不动(Cao，C.X.，Zhou, S.L.，He, Y.Z.，Zheng, X.Y., Chen, ff.K., Qian, Y.T., 2000, J.Chromatogr.A, 891, 337-347; Cao, C.X., Fan, L.Y., Zhang, ff., 2008, Analyst, 133，1139-1157)。基于MRB理论，杨清等提出了一种用于准确测定酸喊浓度的电泳滴定技术(moving reaction boundary titration, MRBT) (Yang, Q., Fan, L.Y.，Huang, S.S.，Zhang, ff.，Cao, C.X.，2011，Electrophoresis, 32，1015-1024)。但仍然未见MRB/MRBT概念、技术和装置转化成生物技术与设备，并应用于生物样品(如牛奶、大豆、尿液和血清等)蛋白质含量的分析。经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN 102680556，
公开日2012-09-19，记载了一种用于测定蛋白质总浓度的可视化生物传感器装置，包括:电泳管，水平放置于一操作平台上；两个四通玻璃管，位于所述电泳管的两侧，且两个所述四通玻璃管的第一端口和所述电泳管的两端相连；两个恒流泵，其一端分别和两个所述四通玻璃管的第二端口相连；阳极电解液槽和阴极电解液槽，分别和两个所述恒流泵的另一端相连；阳极废液槽和阴极废液槽，分别和两个所述四通玻璃管的第三端口相连；电压供给装置，和两个所述四通玻璃管的第四端口相连；数据记录装置，位于所述电泳管的一侧。但该现有技术未对MRB移动速度与蛋白浓度存在的函数关系进行详细的阐述，同时未给出施加电压范围和背景电解质溶液的离子强度范围，此外涉及的滴定装置只能进行单管检测，通量较低，操作较为复杂，测定所需时间较长。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于移动反应界面电泳的高通量蛋白质滴定方法，详细阐述了 MRBT滴定蛋白原理，推导了 MRB移动速度与蛋白浓度存在的函数关系，该方法能够快速的检测蛋白质总量且抗干扰能力强。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过首先向容纳生物样品的电泳管中注入凝胶，使得待检测的蛋白质分子通过凝胶均匀地固定在电泳管中；然后进行碱滴定，即:向阴极电解液槽中注入碱溶液，施加电压，使得碱溶液中的阴离子OF与蛋白质游离酸性残基相遇并发生中和反应进而形成MRB，MRB移向阳极；滴定时，向电泳管中加入用于指示不同时间下MRB所处位置的指示剂，以进行可视化观测；之后，利用MRB移动速度与蛋白浓度存在的函数关系建立MRB移动速度与蛋白浓度的标准曲线，以得到的MRB移动速度，计算得到确定的蛋白浓度。所述的碱滴定替换为酸滴定，即:向阳极电解液槽中注入的酸溶液，施加电压，使得酸溶液中的阳离子H+与蛋白质游离碱性残基相遇并发生中和反应进而形成MRB，MRB移向阴极，从而得到MRB移动速度。所述的施加的电压范围为100-300V，此时，界面移动距离D与电泳时间t线性关系较好，相关系数R>0.998。施加电压100V以下时，界面移动速度较慢，界面移动距离D与电泳时间t线性关系较差；施加电压300V以上时，界面移动速度太快，产生的焦耳热较多，界面移动距离D与电泳时间t线性关系较差。所述的MRB移动速度与蛋白浓度存在的函数关系为=其中:ν.
权利要求
1.一种基于移动反应界面电泳的高通量蛋白质滴定方法，其特征在于，首先向容纳生物样品的电泳管中注入凝胶，使得待检测的蛋白质分子通过凝胶均匀地固定在电泳管中；然后进行碱滴定，最后利用MRB移动速度与蛋白浓度存在的函数关系建立MRB移动速度与蛋白浓度的标准曲线，以得到的MRB移动速度，计算得到确定的蛋白浓度； 所述的滴定是指:向阴极电解液槽中注入碱溶液，施加电压，使得碱溶液中的阴离子Off与蛋白质游离酸性残基相遇并发生中和反应进而形成MRB，MRB移向阳极；滴定时向电泳管中加入用于指示不同时间下MRB所处位置的指示剂，以进行可视化观测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的碱滴定替换为酸滴定，即:向阳极电解液槽中注入的酸溶液，施加电压，使得酸溶液中的阳离子H+与蛋白质游离碱性残基相遇并发生中和反应进而形成MRB，MRB移向阴极，从而得到MRB移动速度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，施加的电压范围为100-300V。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的MRB移动速度与蛋白浓度存在的函数
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的凝胶的浓度为10.0%以上，交联度为3.0%以上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的凝胶为聚丙烯酰胺凝胶，浓度范围为12.0%-18.0%，交联度范围为3.0%-5.0%，其组份为:丙烯酰胺、N-N’ -甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵和四乙基乙二胺。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的指示剂为酸碱指示剂或荧光指示剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的电泳管、阴极电解液槽和阳极电解液槽中均注入有背景电解质溶液，其中:碱滴定时，阳极电解液槽中的背景电解质溶液的成分和离子强度与电泳管的背景电解质溶液的成分和离子强度相同，阴极电解液槽中的背景电解质溶液的成分与电泳管中背景电解质溶液的成分相同，碱溶液和背景电解质溶液各成分离子强度之和与电泳管中背景电解质溶液的离子强度相同； 酸滴定时，阴极电解液槽中背景电解质溶液的成分和离子强度与电泳管的背景电解质溶液的成分和离子强度相同，阳极电解液槽中的背景电解质溶液的成分与电泳管中背景电解质溶液的成分相同，酸溶液和背景电解质溶液各成分离子强度之和与电泳管中背景电解质溶液的离子强度相同。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是，所述的碱滴定时，阳极电解液槽中包含的背景电解质溶液的离子强度范围为50-250mmol/L，阴极电解液槽中包含的碱溶液和背景电解质溶液的，总离子强度范围为50-250mmol/L ;酸滴定时，阴极电解液槽中包含的背景电解质溶液的离子强度范围为50-250mmol/L，阳极电解液槽中包含的酸溶液和背景电解质溶液，总离子强度范围为50-250mmol/L。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征是，所述的背景电解质溶液为钾离子、钠离子或者锂离子的电解质 溶液。
全文摘要
一种电化学方法分析材料的基于移动反应界面电泳的高通量蛋白质滴定方法，通过向容纳生物样品的电泳管中注入凝胶，使得待检测的蛋白质分子通过凝胶均匀地固定在电泳管中；然后进行碱滴定；最后利用MRB移动速度与蛋白浓度存在的函数关系建立MRB移动速度与蛋白浓度的标准曲线，以得到的MRB移动速度，计算得到确定的蛋白浓度。本发明能够快速的检测蛋白质总量且抗干扰能力强。
文档编号G01N27/44GK103175885SQ20131008908
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者曹成喜, 王后禹, 郭成叶, 颜健, 唐芸芸, 尹晓阳, 樊柳荫 申请人:上海交通大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
