专利名称：一种新型的动物乳腺炎检测方法及检测仪的制作方法
技术领域：
本发明属于泌乳动物乳腺炎检测的技术，更具体的说是泌乳动物亚临床乳腺炎的早期检测技术。
背景技术：
乳腺炎是泌乳家畜中最常见的疾�。磕甓蓟岣橐荡淳叽蟮木盟鹗В硐治疾〖倚蟮哪讨柿亢湍滩肯灾档停瘟品押凸芾矸言黾�。乳腺炎根据其临床程度分为临床型和亚临床型。临床乳腺炎造成乳房红肿，或伴有全身和乳房局部症状。产出有凝块、絮片以及水样奶，可以用肉眼立即检出；而亚临床型(或非临床)乳腺炎的检出则需要借助仪器或其它化学方法。家畜亚临床乳腺炎占乳房炎发病率的90%，是�：γ谌榧倚蟮闹匾膊≈弧＜笆奔觳獬鲅橇俅踩橄傺祝涂梢约笆笨刂萍膊〉慕徊椒⒄梗岣咧瘟菩Ч�。从而降低个体病畜对整体畜群感染的机会，减小经济损失。乳腺炎的诊断方法有乳液的细胞学检查，电导率测定，pH值的检查，乳清电泳诊断法，酶检测法，PCR检测法等。加州乳腺炎检测法(CMT)是目前使用较普遍的一种简便、快速的方法，但此法仅可用于临床乳腺炎的定性检测，由于其灵敏度差，假阳性的检出率可高达50%，不能用于亚临床乳腺炎的检测。实验室用一种叫流式细胞仪来检测乳液的体细胞数，其原理是当乳液样品通过仪器的单细胞通道时，仪器可自动记录通过的体细胞数，但是这种仪器价格昂贵，体积大，不能用于现场的病牛检测。市场上曾有一种使用检测牛奶电导率的装置(MSA-D-Tec)来检测乳腺炎，此方法是根据牛奶中的电解质(Na+和Cl—)随着奶中的体细胞数增加而升高的原理而设计的，此方法简便、快速。但灵敏度比较差，假阳性的检出率也高，而且每次测定都需要用被测牛的奶样进行仪器校正，另外，实验证明并非所有感染乳腺炎牛奶的电导率均会升高，而牛奶导电性的升高也并非完全来自于患有乳腺炎的奶牛。近年来，出现了一种使用检测奶样中髓过氧化酶(myoloperoxidase，ΜΡ0)的技术来诊断亚临床乳腺炎，它是根据奶样中的体细胞数和MPO的浓度有较群强的相关性(相关系数值0.91)，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)对奶样中的MPO的检测来判断乳房内中性粒细胞的活性状态，可对奶牛的亚临床乳腺炎做出早期诊断，但此技术操作复杂，费时，仅局限于实验室的检测。牛奶体细胞电子测定仪(PortaSCC)是近来出现在国内市场诊断临床和亚临床乳腺炎的一美国产品，此仪器的设计来源于人体白细胞的体外检测技术，即通过测定体细胞膜表面生物酶与特异底物的反应，这种反应能够使试纸颜色发生变化，牛奶样品中的体细胞数越多，颜色越深。此仪器的特点是，现场实施，操作简便；但仪器成本高，检测需时长，样本的测试条件要求严格。
发明内容
本发明的目的在于提供一种技术设计新颖、操作简便、检测迅速、成本低的泌乳动物乳腺炎的检测技术，可以克服上述乳腺炎检测技术的缺陷。本发明的技术内容如下测定把在患病家畜奶液中加入反应试剂后形成的混合凝胶通过一层纤维过滤膜的时间，来检测患病家畜奶液中的体细胞数，从而进一步评估家畜感染乳腺炎的程度。它的原理是，家畜感染乳腺炎后，奶中体细胞数随之增加。将一种带负电皂化物(SDS)与奶样混合，奶中体细胞的核酸DNA会释放出来，并与此种带负电皂化物相互反应结合形成凝胶，体细胞的数量越多则凝胶形成越多，导致奶液的粘稠度增加，通过纤维过滤膜的时间便长。以本发明所提供的方法而设计的检测仪可以定量地测出奶中的体细胞数，快速辩别临床和亚临床乳腺炎。装置设计由图1至图5组成本发明提供的检测方法是通过样本容器和微处理器共同完成的。本设计是通过直接采用电信号中断记时的方法对细胞数进行测试的一种设计，也可以通过其他的信号中断如电容、电磁、光、等信号中断记时的方法对细胞数进行测
试ο
装置设计总体组装图如图1和图2所示。包括1.仪器盒上盖；2.电源开关；3.样本容器信号输入输出端与微处理器接口件a ;4.仪器盒底座；5.样本容器台；6.仪器盒底座上接口件(3，7)的安装孔；7.样本容器信号输入输出端与微处理器接口件b;8.样本容器组合；9.微处理器控制板；10重新计数�。�11.显示器。样本容器组合如图3和图4所示组成，包括12.样本容器上盖；13.信号输入输出端与仪器接口件a，14.信号传导通路a，15.样本凝胶纤维过滤膜.16.底座，17.底座上的过滤薄膜支撑架，18.信号传导通路b，19.信号输入输出端与仪器接口件b，20.样本接受部漏斗，21.传感器监视口，22.样本容器把手，23.样本容器和信号输入输出端与仪器接口件的装配孔。微处理器控制示意图如图5所示。
图6、图7和图8图为实施例1-4结果示意图，分别为不同体细胞浓度下，牛奶样本形成的混合凝胶通过不同孔径样本凝胶纤维过滤膜(样本接受部漏斗20，传感器监视口 21.)的时间与体细胞数呈线性增长的关系，图6、图7、图8的横坐标为体细胞数，纵坐标为时间。
具体实施例方式本发明的操作过程如下把样本牛奶和反应试剂按比例均勻混合30-60秒后，形成混合凝胶，将形成的混合凝胶倒入样本容器(样本容器组合8)内，混合凝胶从样本容器的漏斗狭窄口(样本接受部漏斗20)经过纤维过滤膜(样本凝胶纤维过滤膜15)。在混合凝胶从样本容器的下端漏斗狭窄口(传感器监视口 21)经过时，传感器就会产生反应信号， 该信号由信号输入输出端与仪器接口件(13禾Π 19)经信号传导通路(14禾Π 18)传入微处理器(9)，微处理器开始记录时间，当混合凝胶从样本容器的漏斗狭窄口全部流过时，传感器端的反应信号就会消失，微处理器把混合凝胶经过过滤器的记录时间进行处理并计算出细胞数，并在微型显示器(11)上显示出来。传感器可以采用各种电感，电容，电磁，光传感器， 等开关信号。本发明使用试剂SDS的浓度一般为-5%，较好为3%，优选为2%。奶样本与试剂SDS的比例为1 0.5-3，较好为1 0.75-2，优选为1 1。本发明使用的纤维过滤膜的平均孔径为1-20 μ m,较好为1-10 μ m,优选为1-5 μ m。本发明可用于现场患病个体牲畜的奶样的检测，也可用于大罐储存奶液含体细胞
4数的检测，从而鉴定储存奶液的质量。本发明的检测方法与现有技术相比所具有的积极效果在于仪器设计简单，成本低，检测时间短，精确度高，便于样本的准备和样本容器的清洗，同时对待测奶样本来源，如保存时间长短，样本杂质含量均无严格要求。下面结合实施例对本发明做进一步的描述。实施例1配制已知体细胞数的模拟乳腺炎牛奶。收集500ml新鲜牛血液，然后转入含有抗血凝因子的离心管内，冰上静置10分钟，离心300Xg(4°C )，倒掉血情，用PBS缓冲液清洗细胞，使用Ficoll-Isopaque方法分离白细胞，用细胞计数器测定细胞含量。选市场出售的优质牛奶(体细胞数低于5万/ml)，用流式细胞仪来检测此牛奶的体细胞数，然后将分离好的白细胞(体细胞)按量加到牛奶中，制成含有已知体细胞数的模拟乳腺炎样本牛奶，样本牛奶应4 °C保存。实施例2取Iml含体细胞数25万/ml的模拟乳腺炎牛奶于玻璃试管一内，从玻璃试管一内取0. 5ml含体细胞数25万/ml的模拟乳腺炎牛奶于玻璃试管二内，加0. 5 ml体细胞数低于5万/ml的优质牛奶于玻璃试管二内，混合均勻，此试管二内的体细胞数为12. 5万/ml， 从试管二内取0. 5ml样本加到玻璃试管三内，加0. 5ml体细胞数低于5万/ml的优质牛奶于玻璃试管三内，混合均勻，此试管三内的体细胞数为6. 25万/ml，从试管三内取0. 5ml样本，弃掉。加0.5ml体细胞数低于5万/ml的优质牛奶于玻璃试管四内，样本试管四为空白对照(零)，将上述每一样本试管内加0. 5ml的2%试剂SDS，混合均勻1分钟。将孔径为 3 μ m的样本凝胶纤维过滤膜通过检测部件放入拿出帮助口放入样本容器内，开启检测仪， 将样本试管混合物倒入样本容器内进行测定。实验结果如图6所示。实施例3参照实施例2制备含不通体细胞数的模拟乳腺炎牛奶，分别为，8百万/ml，6百万 /ml，4百万/ml，2百万/ml和1百万/ml，加0. 5ml每一样本于一玻璃试管内，加0. 5ml体细胞数低于5万/ml的优质牛奶于一玻璃试管内，作为空白对照(零)，将上述每一样本试管内加0. 5ml的2%试剂SDS，混合均勻1分钟。将孔径为8 μ m的样本凝胶纤维过滤膜通过检测部件放入拿出帮助口放入样本容器内，开启检测仪，将样本试管混合物倒入样本容器内进行测定。实验结果如图7所示。实施例4参照实施例3制备含不通体细胞数的模拟乳腺炎牛奶，分别为，2. 4千万/ml，1. 2 千万/ml和0. 6千万/ml，加0. 5ml每一样本于一玻璃试管内，加0. 5ml体细胞数低于5万 /ml的优质牛奶于一玻璃试管内，作为空白对照(零)，将上述每一样本试管内加0. 5ml的 2%试剂SDS,混合均勻1分钟。将孔径为15 μ m的样本凝胶纤维过滤膜通过检测部件放入拿出帮助口放入样本容器内，开启检测仪，将样本试管混合物倒入样本容器内进行测定。实验结果如图8所示。
权利要求
1.一种快速检测泌乳家畜乳腺炎，包括临床和亚临床乳腺炎的新方法，其特征在于，将反应试剂SDS加入患病家畜奶液中，反应试剂SDS与奶液中体细胞的DNA相互作用，改变了奶液的粘稠度，通过测定反应奶液被样本容器纤维膜吸附的时间来检出乳腺炎。使用微处理器来自动计录时间，算出奶液中的体细胞数。
2.如权利要求1所述的乳腺炎检测方法，其中试剂SDS的浓度为-5%。
3.如权利要求1所述的乳腺炎检测方法，其中样本纤维过滤膜的孔径为1-20μ m。
4.如权利要求1所述的乳腺炎检测方法，其中样本容器为漏斗状，可以是各种漏斗形状，不限于图3和图4所示的圆形。其中样本容器样本通过孔径00)为l-10mm。
5.如权利要求1所述的乳腺炎检测方法，其中测定反应奶液被样本容器纤维膜吸附的时间，所采用的方法可以是任何电磁、电容中断、光感中断等信号，不限于如图3和图4所示的直接采用电流中断的方法。
6.如权利要求1所述的乳腺炎检测方法，包括样本容器。其中样本容器有快速连接件 (信号输入输出端与仪器接口件13和19)，可以和测量装置快捷的连接。
7.如权利要求1所述的乳腺炎检测方法，包括样本容器。其中样本容器有过滤膜支撑件，支撑件和样本收容器底端有通口，可以使过滤液体通过。
8.如权利要求1所述的乳腺炎检测方法，包括测量装置。其中测量装置有快速连接件 (样本容器信号输入输出端与微处理器接口件3和7)，可以和样本容器快捷的连接。
9.如权利要求1所述的乳腺炎检测方法，测量装置上有样本放置台(样本容器台5)， 样本容器放置于样本放置台上，样本容器可以方便取放，便于样本的准备和样本容器的清洗。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测泌乳家畜乳腺炎，包括临床和亚临床乳腺炎的新方法，它是通过测定把在患病家畜奶液中加入反应试剂后形成的混合凝胶通过一层纤维过滤膜的时间，来检测患病家畜奶液中的体细胞数，从而进一步评估家畜感染乳腺炎的程度。它的原理是，奶中体细胞的核酸DNA与一种带负电的皂化物(SDS)结合形成凝胶，体细胞的数量越多则凝胶形成越多，从而导致奶液的粘稠度增加，通过纤维膜的时间也成比例延长。以本发明所提供的方法而设计的检测仪可以快速定量得测出奶中的体细胞数，从而为快速辨别临床和亚临床乳腺炎，早期有效的控制乳腺炎在家畜群中的蔓延，提供简捷有效的方法和工具。
文档编号G01N33/50GK102213715SQ201010161970
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月8日 优先权日2010年4月8日
发明者张全有, 李其昌, 陈克红, 陈永波 申请人:内蒙古硕高生物科技有限责任公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
