专利名称：可控释放生物分子的方法及可控释放生物分子的生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及可控释放生物分子的方法及可控释放生物分子的生物芯片。
背景技术：
生物芯片以其分析速度快、微型化、易于集成的优点，被广泛应用于基因研究领 域，其中扩增芯片作为生物芯片的一个重要部分，在疾病检测、药物筛选、法医鉴定等方面 已经显出巨大的应用前景。在扩增芯片中，由于装置微型化大大降低了样品量，因此如何实现在微观尺度上 的生物分子的有效释放直接决定了生物反应效率的高低。目前的扩增技术中，各种生物样 品的释放方式主要有几种方式。一种是直接释放，即在反应前将生物样品混合均勻后加入 到芯片中，不在反应过程中额外引入释放步骤。另一种是加入释放，即通过流体控制，在不 同时刻单独加入反应样品进行释放。但是直接释放方式不能实现多种样品同时独立扩增， 而加入释放方式需要另外加入控制流体的装置，如并行的进样管道等，提高了芯片制作的 复杂性。也有研究人员提前将一种反应物固定于芯片中，再加入其它反应物，以实现PCR反 应。但是这种预先固定一种反应物的做法也有缺陷若反应物是通过非共价方式固定于芯 片中，则在后续进样过程中由于流体冲刷导致反应物损失或污染；若通过共价方式固定于 芯片中，则可能会导致生物分子反应效率降低。在这种情况下，急需一种能在扩增芯片中简 便、可控、又不影响反应效率的生物分子释放方式，以满足高通量、高效、廉价的扩增芯片发 展要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种可控释放生物分子的方法。本发明所提供的可控释放生物分子的方法，包括如下操作步骤将生物分子与高 分子聚合物通过静电吸附或范德华力结合，得到生物分子-高分子聚合物结合物；通过 控制外部条件，再将所述结合物中的生物分子与高分子聚合物分开，从而释放所述生物分 子；所述高分子聚合物为与所述生物分子发生静电吸附作用或范德华力作用的高分 子聚合物。上述方法中，所述将生物分子与高分子聚合物通过静电吸附或范德华力结合的方 法包括如下步骤将所述生物分子和所述高分子聚合物混合或将所述生物分子和所述高分 子聚合物分层叠放在一起，孵育。上述方法中，所述孵育的条件包括温度为10°C _95°C或25°C _80°C和孵育时间为 0. lh-2月或0. lh-2h ；所述温度具体为25°C、50°C或80°C;所述孵育的时间具体为0. lh、lh 或2h。上述方法中，所述孵育的条件包括真空。上述方法中，所述生物分子为DNA、RNA或蛋白质；所述高分子聚合物为壳聚糖、琼
4脂、多聚赖氨酸、聚二醇、明胶或聚乙烯醇。上述方法中，多聚赖氨酸的数均分子量为25000-40000g/mol。上述方法中，所述高分子聚合物和所述生物分子的配比如下1)或2)或3)所示1)壳聚糖与每种 DNA 的配比为(1.0yg-156g)壳聚糖(0. 01pmol-50pmol) 每种 DNA、(1. 0 μ g-156 μ g)壳聚糖(1. OpmoI-IOpmo 1)每种 DNA、(1. 0 μ g-100 μ g) 壳聚糖(1. OpmoI-IOpmo 1)每种 DNA 或(13. 3 μ g-156 μ g) 1. 5pmol 每种 DNA,具 体为 13.3yg 1. 5pmol、97. 5 μ g 1. 5pmol>50 μ g 1. 5pmol>20 μ g 1. 5pmol 或 156 μ g : L 5pmol ；2)琼脂糖与每种DNA的配比为(1. O μ g-200 μ g)琼脂糖(0. 01pmol-50pmol)每 种 DNA 或(1. O μ g-200 μ g)琼脂糖(1. Opmo 1-1 Opmo 1)每种 DNA,具体为(75 μ g-150 μ g) 琼脂糖1. 2pmol，再具体为 150μ g 1.2pmol 或 75yg 1. 2pmol ；3)多聚赖氨酸与每种DNA的配比为(0. 1 μ g-10. O μ g)多聚赖氨 酸(0. 01pmol-50pmol)每种 DNA 或(0. 1 μ g-10. O μ g)多聚赖氨酸(1. Opmol-IOpmol) 每种DNA，具体为(3 μ g-10. Oyg)多聚赖氨酸1. 2pmol每种DNA，再具体为 3 μ g 1. 2pmol gJc 10 μ g 1.2pmol。上述方法中，所述通过控制外部条件，再将所述结合物中的生物分子与高分子聚 合物分开是通过向所述结合物中加入溶液和调节所述结合物所处环境的温度实现的，或通 过向所述结合物中加入溶液并进行超声实现的。上述方法中，所述调节所述结合物所处环境的温度为如下1)、2)或3)所示1)所述高分子聚合物为壳聚糖，将所述结合物所处环境的温度调节至 50 0C -70 0C，并在此温度下保持 5min-60min 或 10min_60min 或 15min_60min 或 10min_15min 或5min-15min，具体是如下a)或b)或c)所示a)将所述结合物所处环境的温度调节至 670C -70°C，并在此温度下保持IOmin ；b)将所述结合物所处环境的温度调节至50°C，并 在此温度下保持15min ；c)将所述结合物所处环境的温度调节至70°C，并在此温度下保持 IOmin ；2)所述高分子聚合物为琼脂糖，将所述结合物所处环境的温度调节至 500C -70°C，并在此温度下保持20min-60min ；3)所述高分子聚合物为多聚赖氨酸，将所述结合物所处环境的温度调节至 500C -70°C，并在此温度下保持20min-60min。上述方法中，包括如下步骤将所述结合物通过范德华力吸附在固相载体上，得到 包被有所述结合物的固相载体；所述固相载体为芯片片基、酶联免疫酶标板、试管或离心管；所述固相载体的材质选自下金属、玻璃、石英、硅、陶瓷、塑料、橡胶和硅铝酸盐化 合物。上述方法中，所述将结合物通过范德华力吸附在固相载体上的方法为如下1)或2) 所示1)将所述生物分子的溶液和所述高分子聚合物的溶液混合，将得到的混合物加到 所述固相载体上，再在温度为10°c -95°c或25°C -80°C和真空的条件下孵育0. lh-2month, 具体为在50°C和真空的条件下孵育Ih或在25°C和真空的条件下孵育0. Ih或在80°C和真 空的条件下孵育2h ；
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2)将所述生物分子的溶液加到所述固相载体上，除去生物分子的溶液中的溶剂， 再加入高分子聚合物的溶液，再在温度为10°c -95°c或25°C -80°C和真空的条件下孵育 0. lh-2month，具体为在50°C和真空的条件下孵育Ih或在25°C和真空的条件下孵育0. Ih 或在80°C和真空的条件下孵育2h。所述除去生物分子的溶液中的溶剂的方法为在50°C和真空的条件下放置1分钟。由上述任一所述方法得到的包被有所述结合物的固相载体也属于本发明的保护 范围。所述固相载体为用于扩增目的生物分子的芯片，所述目的生物分子为DNA或RNA。本发明提供的在扩增芯片内可控释放生物分子的方法以高分子聚合物为材料，利 用了高分子聚合物可以在某种条件下形成较为致密的形态、而在另一种条件下改变为较为 疏松形态的性质，来实现生物分子在扩增芯片内的可控释放。首先通过在一定条件使高分 子聚合物形成较致密的形态来固定生物分子，然后在另一条件下使高分子聚合物改变为较 疏松的形态，在扩增芯片内释放生物分子。同时，整个过程对生物分子活性无影响，对扩增 反应无影响。本发明实现过程包括先将待固定的生物分子与高分子聚合物加入到扩增芯片中 (加入方式可以是两种溶液充分混合后加入，或者是呈覆盖关系地依次加入)，然后使高分 子聚合物形成一定的形态，从而将生物分子固定在扩增芯片中；再向芯片中加入扩增反应 液后改变高分子聚合物的形态使生物分子被释放；释放的生物分子参与扩增反应。高分子聚合物在一种形态下固定生物分子时，可以是致密的网状结构，也可以是 致密的薄膜结构；在另一种形态下释放生物分子时，其形态由所选择的实验条件决定，可以 是疏松的网状结构，也可以是疏松的薄膜结构，或者是无规卷曲结构。高分子聚合物和待 固定的生物分子结合形成复合物时，其状态可以是高分子聚合物与生物分子的均勻混合溶 液、薄膜或凝胶，也可以是形成覆盖关系的独立组分颗粒、薄膜或凝胶。高分子聚合物在固 定生物样品前不需要进行特殊处理或者修饰，只需要制备相应的溶液即可。将待固定的生 物分子与高分子聚合物加入到扩增芯片中，可以是通过手工加入(如移液器、毛细管等)， 也可以是借助仪器加入(如接触式或非接触式点样仪等)。通过环境温度和湿度的改变使 高分子聚合物的形态发生变化，可以可控地释放生物分子。本发明可控释放生物分子的方法中，高分子聚合物形态改变可以通过外界条件变 化来进行控制。通过改变环境条件，高分子聚合物可以形成较致密的状态，也可以形成较疏 松的形态。壳聚糖是一种线性高分子聚合物，同时具有丰富的侧链氨基，可以与多种分子 (如DNA、RNA等)形成静电吸附；另外还能在溶液中与生物分子形成纳米颗粒或纳米颗粒 的聚集体(Hai-Quan Mao, et al，2001)，使高分子聚合物与生物分子之间结合更加牢固。利 用壳聚糖实现本发明的具体操作步骤如图1和图2所示。其中图1，首先将待固定的生物 分子102与高分子聚合物103的溶液充分混合，然后将混合物加入到扩增芯片101中，在一 定条件下(如加热、抽真空等)，使高分子聚合物在芯片表面形成致密的形态，固定生物分 子。生物分子被固定后，当加入包含DNA模板在内的扩增反应液104时，由于高分子聚合物 具有一定的抗液体冲刷性，可以避免生物分子在进样过程中因冲刷作用导致的流失或交叉 污染。在扩增反应过程中，在一定条件下(如加热、加湿等)高分子聚合物会改变为较疏松
6的形态。由于生物分子与高分子为非共价固定，生物分子会在高分子聚合物形态改变后被 释放出，不会影响生物分子的活性及扩增反应的正常进行。图2为通过呈覆盖关系的高分 子聚合物与生物分子薄膜可控释放生物分子原理示意图。与图1所示方式不同点在于，待 固定的生物分子102的溶液先加入到扩增芯片101中，然后去除溶剂，使生物分子颗粒吸附 于芯片底部，再加入高分子聚合物103的溶液，在一定条件下(如加热、抽真空等)，可以使 高分子聚合物在芯片表面形成与生物分子颗粒呈覆盖关系的致密的形态，从而固定生物分 子。实验证明，通过本方法制备的芯片中，生物分子的释放是可以人为控制的，如通过 温度、超声控制，从而使其应用更便捷；包被后的生物分子的活性没有明显改变；包被的生 物分子在高分子聚合物的保护下具有抗冲刷能力。本发明的芯片可用于目的生物分子(如DNA、RNA)的扩增，包括但不限于等温扩增 反应(如LAMP，SDA, NASBA等)和变温扩增反应(如PCR，LCR等)。本发明制得的芯片， 使包被后的芯片产品化，使用者直接拿来便可用，使操作更加方便快捷，更重要的是，把参 与反应的不同试剂分别局限在各自的空间，从而可以同时进行多个不同的检测反应。本发 明的芯片及其制备方法，所需的材料及仪器廉价、易得、简便，且有普适性，因此极具推广潜 力，对扩增芯片的设计和制造有着重要意义。
图1为先将高分子聚合物与生物分子混合后，再点样制备的芯片的可控释放生物 分子原理示意图。其中，101为扩增芯片，102为生物分子，103为高分子聚合物，104为包含 DNA模板在内的扩增反应液。图2为将高分子聚合物与生物分子依次加入芯片反应池中得到的芯片的可控释 放生物分子原理示意图。其中101为扩增芯片，102为生物分子，103为高分子聚合物，104 为包含DNA模板在内的扩增反应液。图3为利用壳聚糖可控释放引物与均勻混合溶液的等温扩增反应荧光图比较。图4为利用壳聚糖固定引物抗冲刷性实验的等温扩增反应荧光图。图5为利用琼脂糖可控释放引物实验的等温扩增反应荧光图。图6为利用多聚赖氨酸可控释放引物实验的等温扩增反应荧光图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中使用的芯片的材质均是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。本发明中使用的 芯片结构只需要具备进行扩增反应的反应池和加入反应液的通道即可，对其他结构没有特 殊限定。实施例1、壳聚糖与DNA的结合物包被芯片壳聚糖为日本东京化成工业株式会社生产，产品目录号为C0831 ；壳聚糖的黏度 (20°C，0. 5%质量百分含量下)为200-500mPa. s。本实施例中的DNA弓丨物均生物合成得到。
一、包被芯片的制备方法I 1、高分子聚合物种类壳聚糖。2、生物分子的种类短链DNA，具体序列如下ATTGTAAAACGACGGCCAGTG,BGACCATGATTACGCCAAGCG,CGCTTATCGATACCGTCGACCTCGTACGACTCACTATAGGGCGAAT,D:CAGCCCGGGGGATCCACTAGCCTCACTAAAGGGAACAAAAGC ；3、高分子聚合物与生物分子的配比将壳聚糖溶于水，得到壳聚糖水溶液(壳聚糖的浓度为0.65%，质量百分含量)； 将引物A、B、C、D溶于水，得到含有4种引物的水溶液(A、B、C、D在溶液中的浓度均为 0. 1 μ mol/L)；将2. 05 μ L壳聚糖水溶液与15 μ L引物水溶液混合，得到混合溶液，混合溶液 中，壳聚糖与4种引物的配比均为13. 3yg 1.5pmol ；取0.7yL混合溶液点样于芯片的 反应池中。4、包被的条件将点样后的芯片置于50°C真空烘箱中，在50°C、抽真空的条件下 孵育lh(抽真空目的是为了使壳聚糖成膜更紧密。具体操作时是将真空烘箱连接真空泵， 一直抽真空，面板压力示数为OmPa。)5、将芯片封装，室温保存。方法II 1、高分子聚合物种类壳聚糖2、生物分子的种类短链DNA，具体序列如下A TTGTAAAACGACGGCCAGTG,B GACCATGATTACGCCAAGCG,C GCTTATCGATACCGTCGACCTCGTACGACTCACTATAGGGCGAAT,D CAGCCCGGGGGATCCACTAGCCTCACTAAAGGGAACAAAAGC ；3、高分子聚合物与生物分子的配比将壳聚糖溶于水，得到壳聚糖水溶液(壳聚糖的浓度为0. 65%，质量百分含量)； 将引物A、B、C、D溶于水，得到引物水溶液(A、B、C、D在溶液中的浓度均为0. 1 μ mol/L)；先 向反应池中加入引物水溶液，0.7 μ L/池，50°C抽真空Imin以去除溶剂(除去溶剂就是通 过抽真空和加热使溶剂挥发、引物析出后固定在反应池中)。再向反应池中加入壳聚糖水 溶液，1.2 μ L/池，50°C抽真空lh，以除去溶剂，使高分子聚合物析出形成薄膜覆盖于前面 析出的引物上，即使壳聚糖与DNA结合。池中壳聚糖与引物A(或B或C或D)的配均比为 156 μ g 1.5pmolο5、将芯片封装，室温保存。方法III一、芯片的制备1、高分子聚合物种类壳聚糖2、生物分子的种类DNA，与方法I中所述一致。3、高分子聚合物与生物分子的配比将壳聚糖溶于水，得到浓度为0. 65% (w/w)于水，得到引物水溶液(A、B、C、D在溶液中的浓度均 为0. lymol/L)；将不同体积的壳聚糖水溶液与15μ L引物水溶液混合，得到混合溶液，再 根据壳聚糖与引物的配比取不同体积混合溶液点样于芯片的反应池中。混合溶液中，壳聚糖与引物的配比不同；具体如下实验组1)混合溶液中壳聚糖浓度为0.32%，壳聚糖与4种引物的配比为 97. 5 μ g 1. 5pmol，滴加混合液量为1. 5 μ L/池。25°C且抽真空条件下孵育0. Ih ；实验组2):混合溶液中壳聚糖终浓度为0.20% ；壳聚糖与4种引物的配比为 50 yg 1. 5pmol，滴加混合液量为0. 9 μ L/池。80°C且抽真空条件下孵育2h ；实验组3)混合溶液中壳聚糖终浓度为0.08% ；壳聚糖与4种引物的配比为 20 yg 1. 5pmol，滴加混合液量为0. 85 μ L/池。50°C且抽真空条件下孵育Ih.4、将芯片封装，室温保存。上述方法制备的芯片中，壳聚糖与DNA通过静电吸附作用结合，形成的复合物记 作壳聚糖-DNA复合物；壳聚糖-DNA复合物通过范德华力吸附在芯片上。
反应。
二、芯片的效果
将方法I、II、III制备得到的芯片分别进行如下实验。 (一)生物分子的生物活性检测
将所得芯片封装后放置3天，再向反应池中加入扩增反应液7μ L，进行等温扩增 扩增反应液的组成由体系和模板组成。体系组成如下
序 号
反应物成分
终浓度
Bst DNA聚合酶大片 1 段0.32U/μΙBst酶反应缓冲液2 (ThermoPoI1XReaction Buffer)脱氧核糖核苷三磷酸 3 (dNTPs)0.4mmol/L(各)4 EvaGreen 染料0.6X5 牛血清白蛋白(BSA)0.5mg/ml6 甜菜碱(betaine)0.8mol/L模板是EZ-T载体质粒DNA购自北京康润诚业生物科技有限公司，货号Τ168_10， 浓度为 IO5Copies/μ L。。体系模板=23 2，ν/ν。等温扩增反应的条件67°C进行扩增反应，反应lh。同时以直接混合的方法进行对照，比较二者之间的扩增时间差异即阳性扩增时间
9(Tp值)。直接混合方法为配制引物-体系-模板的均勻混合溶液，进行等温扩增反应，引 物_体系_模板的均勻混合溶液的组成及浓度与实验组相同，等温扩增反应的条件与实验 组相同。生物分子的扩增反应效果通过实时荧光检测来检验。荧光染料可以指示反应进行程度。方法I得到的芯片的荧光强度随反应时间变化的扩增曲线如图3。其中A为对照 组，B为实验组结果。结果显示，两条扩增反应荧光图形状、荧光背景及平台区荧光强度均 类似，说明实验组和对照组均发生了有效的扩增反应。对照组扩增时间约为19分钟，实验 组扩增时间约为20分钟，此差别在实验误差范围内可以接受，两组扩增时间没有明显实质 差别；因此，在利用本方法对生物样品进行固定后再可控释放时，生物分子扩增能力没有减 弱，活性没有明显改变，生物样品活性没有受到明显影响。方法II得到的芯片的阳性扩增时间(Tp值)为约22min。方法III得到的芯片的结果实验组1)中阳性扩增时间(Tp值)为约21min，实验 组2)中阳性扩增时间(Tp值)为约21min，实验组3)中阳性扩增时间(Tp值)为与方法1 接近，约20min。实验所得不同壳聚糖浓度下等温扩增时间最大差异约为1分钟，壳聚糖浓 度越高，扩增时间越长。说明本方法适用于较宽范围的壳聚糖浓度，壳聚糖浓度对扩增时间 有一定影响，浓度越高，生物分子释放越慢，扩增时间越长。( 二 )释放可控检测取保存3天后的芯片进行实验。向芯片的反应池中加入纯水，室温放置，观察DNA释放情况。再加热到不同温度， 观察DNA释放情况。比较不同条件下DNA释放情况，其中室温条件下观测了 30分钟，50°C 条件下观测了 15分钟，70°C条件下观测了 10分钟。上述三种方法制备的芯片反应池内均具有带有颜色的薄膜，目测观察壳聚糖与引 物的结合物的扩散情况。以薄膜边缘变�：蛘叻从Τ啬谇逅飨员渖卸峡际头诺� 标准，以反应池内清水颜色变均勻为判断释放均勻的标准。方法I得到的芯片的检测结果如表1所示。表1壳聚糖释放生物分子条件
温度/°c开始释放/min释放均匀/min室温> 20> 305051570310结果显示(1)加入纯水后，室温放置20分钟后才观察到有生物分子开始释放，室温放置30 分钟时也没有释放均勻。这说明室温下，壳聚糖对生物分子的固定牢固，被固定的生物分子 具有抗冲刷能力。
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(2)加入纯水后，在50°C条件下，放置5分钟后，生物分子开始释放；在50°C条件 下，放置15分钟后，生物分子均勻释放。(3)加入纯水后，在70°C条件下，放置3分钟后，生物分子开始释放；在70°C条件 下，放置10分钟后，生物分子均勻释放。(2)和(3)说明，该芯片，70°C和50°C均可以释放生物分子，但达到均勻释放所需 的时间不同，温度越高，达到均勻释放所需时间越短，该释放是可控的，具体可以通过调节 温度来控制。方法II和方法III得到的芯片的检测结果与方法I得到的芯片的检测结果无显著差别。(三)抗冲刷取保存3天后的芯片进行实验。向反应池中加入扩增反应液7 μ L，室温静置5分钟后取出溶液，将此溶液进行等 温扩增反应。扩增反应液的组成与实验二(一)中所述一致。等温扩增反应的条件67°C扩增，lh。同时以直接混合的方法进行对照，比较二者之间的扩增时间差异。直接混合方法 为配制引物_体系_模板的均勻混合溶液，进行等温扩增反应，引物_体系_模板的均勻 混合溶液的组成及浓度与实验组相同，等温扩增反应的条件与实验组相同。方法I得到的芯片的荧光强度随反应时间变化的扩增曲线如图4。图4中A为对 照引物_体系_模板混合液等温扩增反应荧光图，B为加入到芯片后再取出的体系_模板 混合液等温扩增反应荧光图。结果显示，加入到芯片后再取出的体系-模板混合液没有发 生明显扩增，说明在混合液加入芯片、室温静置、取出的过程中，固定于芯片内部的引物没 有因液体冲刷而被溶解出，证明本方法固定的引物有较好的抗冲刷性，引物DNA没有因为 液体的冲刷而被释放出来，也就不会在芯片内扩散引起反应池间污染。方法II和方法III得到的芯片的检测结果与方法I得到的芯片的检测结果无显著 差别。实施例2、琼脂糖与DNA的结合物包被芯片琼脂糖购自Promega公司，产品目录号为V3841一、制备方法1、高分子聚合物种类琼脂糖；琼脂糖的凝固温度(4% ) ^ 35°C;熔点(1. 5% ) 彡 650C ；凝胶强度(4% )彡 500g/cm2。2、生物分子的种类DNA，具体序列如下A TTGTAAAACGACGGCCAGTG,B GACCATGATTACGCCAAGCG,C GCTTATCGATACCGTCGACCTCGTACGACTCACTATAGGGCGAAT,D CAGCCCGGGGGATCCACTAGCCTCACTAAAGGGAACAAAAGC ；3、高分子聚合物与生物分子的配比将琼脂糖溶于水，得到琼脂糖水溶液(琼脂糖的浓度为5%，质量百分含量)；将引 物A、B、C、D溶于水，得到引物水溶液(A、B、C、D在溶液中的浓度均为0. lymol/L)；将不同得到混合溶液。混合溶液中，琼脂糖与4种引物的配比不同，具体如下实验组1)将3yL 5%的琼脂糖水溶液与12yL引物水溶液混合，得到混合溶液， 琼脂糖与4种引物的配比均为150 μ g 1.2 11101;滴加混合液量为0.77 4 17池；实验组2)将1. 5 μ L 5%的琼脂糖水溶液及1. 5 μ L水与12 μ L引物水溶液混合， 得到混合溶液，琼脂糖与4种引物的配比均为75 μ g 1.2 11101;滴加混合液量为0.77口17 池。4、包被的条件将点样后的芯片置于50°C真空烘箱中，50°C抽真空lh。5、将芯片封装，室温保存。琼脂糖与DNA通过范德华力结合，形成的复合物记作琼脂糖-DNA复合物；琼脂 糖-DNA复合物通过范德华力吸附在芯片上。二、芯片效果(一)生物活性检测将所得芯片封装后放置3天，再向反应池中加入扩增反应液7μ L，进行等温扩增 反应。其中实验组1)、2)各重复做3次，即每个实验组各做4条曲线，一共8条扩增曲线。扩增反应液的组成与实施例1中实验二( 一)中所述一致。等温扩增反应的条件67°C扩增，lh。结果实验得到的芯片的荧光强度随反应时间变化的扩增曲线图如图5。结果显 示，8条扩增反应荧光图形状、荧光背景及平台区荧光强度均类似，说明实验组1)、2)均发 生了有效的扩增反应。同时，两个实验组中8条曲线扩增时间均约为20分钟，曲线间差别 在实验误差范围内可以接受，8条扩增曲线时间没有明显实质差别；因此，在利用本方法对 生物样品进行固定后再可控释放时，生物分子扩增能力没有减弱，活性没有明显改变，生物 样品活性没有受到明显影响，在一定琼脂糖浓度区间内均适用，且实验重复性很好。实施例3、多聚赖氨酸与DNA的结合物包被芯片多聚赖氨酸购自Sigma，产品目录号为P9011。一、制备方法1、高分子聚合物种类多聚赖氨酸；多聚赖氨酸的数均分子量为25000-40000g/
mol ο2、生物分子的种类DNA具体序列如下A TTGTAAAACGACGGCCAGTG,B GACCATGATTACGCCAAGCG,C GCTTATCGATACCGTCGACCTCGTACGACTCACTATAGGGCGAAT,D CAGCCCGGGGGATCCACTAGCCTCACTAAAGGGAACAAAAGC ；3、高分子聚合物与生物分子的配比将多聚赖氨酸溶于水，得到多聚赖氨酸水溶 液(多聚赖氨酸的浓度为10mg/mL)；将引物A、B、C、D溶于水，得到引物水溶液(A、B、C、D 在溶液中的浓度均为0. 1 μ mol/L)；将不同体积多聚赖氨酸水溶液与12 μ L引物水溶液混 合，得到混合溶液。混合溶液中，多聚赖氨酸与4种引物的配比不同，具体如下实验组1)将0. 3 μ L 10mg/mL的多聚赖氨酸水溶液与12 μ L引物水溶液混合，
12得到混合溶液，多聚赖氨酸与4种引物的配比均为3yg 1.2pmol ；滴加混合液量为 0. 77 μ L/ 池;实验组2)将1 μ L 10mg/mL的多聚赖氨酸水溶液与12 μ L引物水溶液混合，得到 混合溶液，多聚赖氨酸与4种引物的配比均为10 μ g 1. 2pmol ；滴加混合液量为0. 9 μ L/ 池。4、包被的条件将点样后的芯片置于50°C真空烘箱中，50°C抽真空lh。5、将芯片封装，室温保存。多聚赖氨酸与DNA通过范德华力结合，形成的复合物记作多聚赖氨酸-DNA复合 物；多聚赖氨酸-DNA复合物通过范德华力吸附在芯片上。二、芯片效果(一)生物活性检测将所得芯片封装后放置3天，再向反应池中加入扩增反应液7μ L，进行等温扩增 反应。扩增反应液的组成与实施例1中实验二( 一)中所述一致。等温扩增反应的条件67°C扩增，lh。结果检测结果与壳聚糖及琼脂糖可控释放生物分子的扩增结果类似，实验得到 的芯片的荧光强度随反应时间变化的扩增曲线图如图6，其中A为实验组1)结果，B为实验 组2)结果。实验组1)扩增时间约为20分钟；实验组2)扩增时间约为21分钟。因此，在 利用本方法对生物样品进行固定后再可控释放时，生物分子扩增能力没有减弱，活性没有 明显改变，生物样品活性没有受到明显影响。
1权利要求
一种可控释放生物分子的方法，包括如下操作步骤将生物分子与高分子聚合物通过静电吸附或范德华力结合，得到生物分子 高分子聚合物结合物；通过控制外部条件，再将所述结合物中的生物分子与高分子聚合物分开，从而释放所述生物分子；所述高分子聚合物为与所述生物分子发生静电吸附作用或范德华力作用的高分子聚合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述将生物分子与高分子聚合物通过静 电吸附或范德华力结合的方法包括如下步骤将所述生物分子和所述高分子聚合物混合或 将所述生物分子和所述高分子聚合物分层叠放在一起，孵育。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述孵育的条件包括温度为10°C-95°C 或25°C -80°C和孵育时间为0. lh-2月或0. lh_2h ；所述温度具体为25°C、50°C或80°C ；所 述孵育的时间具体为0. lh、lh或2h。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述孵育条件包括真空。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述生物分子为DNA、RNA或蛋 白质；所述高分子聚合物为壳聚糖、琼脂糖、多聚赖氨酸、聚乙二醇、明胶或聚乙烯醇。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述高分子聚合物和所述生物 分子的配比如下1)或2)或3)所示1)壳聚糖与每种DNA的配比为(1.0yg-156yg)壳聚糖(0.01pmol-50pmol)每 种 DNA、(1. 0 μ g-156 μ g)壳聚糖(1. OpmoI-IOpmo 1)每种 DNA、(1. 0 μ g-100 μ g)壳 聚糖(1. OpmoI-IOpmo 1)每种 DNA 或(13. 3 μ g-156 μ g) 1. 5pmol 每种 DNA,具体 % 13. 3 μ g 1. 5pmol、97. 5 μ g 1. 5pmol>50 μ g 1. 5pmol>20 μ g 1. 5pmol 或 156 μ g : L 5pmol ；2)琼脂糖与每种DNA的配比为(1.O μ g-200 μ g)琼脂糖(0. 01pmol-50pmol)每种 DNA 或(1. O μ g-200 μ g)琼脂糖(1. OpmoI-IOpmo 1)每种 DNA,具体为(75 μ g-150 μ g)琼 脂糖1. 2pmol，再具体为 150μ g 1.2pmol 或 75yg 1. 2pmol ；3)多聚赖氨酸与每种DNA的配比为(0.1 μ g-10. O μ g)多聚赖氨 酸(0. 01pmol-50pmol)每种 DNA 或(0. 1 μ g-10. O μ g)多聚赖氨酸(1. Opmol-IOpmol) 每种DNA，具体为(3 μ g-10. Oyg)多聚赖氨酸1. 2pmol每种DNA，再具体为 3 μ g 1. 2pmol gJc 10 μ g 1.2pmol。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述通过控制外部条件，再将所 述结合物中的生物分子与高分子聚合物分开是通过向所述结合物中加入溶液和调节所述 结合物所处环境的温度实现的，或通过向所述结合物中加入溶液并进行超声实现的；所述 溶液为水或扩增反应液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述调节所述结合物所处环境的温度为 如下1)、2)或3)所示1)所述高分子聚合物为壳聚糖，将所述结合物所处环境的温度调节至50°C -70 并在此温度下保持 5min-60min 或 10min_60min 或 15min_60min 或 10min_15min 或 5min-15min，具体是如下a)或b)或c)所示a)将所述结合物所处环境的温度调节至 670C -70°C，并在此温度下保持IOmin ；b)将所述结合物所处环境的温度调节至50°C，并 在此温度下保持15min ；c)将所述结合物所处环境的温度调节至70°C，并在此温度下保持IOmin ；2)所述高分子聚合物为琼脂糖，将所述结合物所处环境的温度调节至50°C-70°C，并 在此温度下保持20min-60min ；3)所述高分子聚合物为多聚赖氨酸，将所述结合物所处环境的温度调节至 500C -70°C，并在此温度下保持20min-60min。
9.根据权利要求2-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，包括如下步骤将 所述结合物通过范德华力吸附在固相载体上，得到包被有所述结合物的固相载体；所述固相载体为芯片片基、酶联免疫酶标板、试管或离心管；所述固相载体的材质选自下金属、玻璃、石英、硅、陶瓷、塑料、橡胶和硅铝酸盐化合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述将结合物通过范德华力吸附在固相 载体上的方法为如下1)或2)所示1)将所述生物分子的溶液和所述高分子聚合物的溶液混合，将得到的混合物加到所述 固相载体上，再在温度为10°C -95°C或25°C _80°C和真空的条件下孵育0. lh-2month，具体 为在50°C和真空的条件下孵育Ih或在25°C和真空的条件下孵育0. Ih或在80°C和真空的 条件下孵育2h ；2)将所述生物分子的溶液加到所述固相载体上，除去生物分子的溶液中的溶剂，再 加入高分子聚合物的溶液，再在温度为10°C -95°C或25°C -80°C和真空的条件下孵育 0. lh-2month，具体为在50°C和真空的条件下孵育Ih或在25°C和真空的条件下孵育0. Ih 或在80°C和真空的条件下孵育2h。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述除去生物分子的溶液中的溶剂的 方法为在50°C和真空的条件下放置1分钟。
12.由权利要求10或11所述方法得到的包被有所述结合物的固相载体；所述固相载体为用于扩增目的生物分子的芯片，所述目的生物分子为DNA或RNA。
全文摘要
本发明公开了可控释放生物分子的方法及可控释放生物分子的生物芯片。该方法包括如下步骤将生物分子与高分子聚合物通过静电吸附或范德华力结合，得到生物分子-高分子聚合物结合物；通过控制外部条件，再将所述结合物中的生物分子与高分子聚合物分开，从而释放所述生物分子；所述高分子聚合物为与所述生物分子发生静电吸附作用或范德华力作用的高分子聚合物。实验证明，通过本方法制备的芯片中，生物分子的释放是可以认为控制的，如通过温度、超声控制，从而使其应用更便捷；包被后的生物分子的活性没有明显改变；包被的生物分子在高分子聚合物的保护下具有抗冲刷能力。本发明的芯片及其制备方法，所需的材料及仪器廉价、易得、简便，且有普适性，因此极具推广潜力，对扩增芯片的设计和制造有着重要意义。
文档编号G01N33/535GK101956000SQ20101023364
公开日2011年1月26日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者刘淼, 张国豪, 张锦秀, 王国青, 王璨, 程京, 邓涛, 邢婉丽, 郭素, 韩蓓 申请人:博奥生物有限公司;清华大学
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