专利名称：抗人n-乙酰氨基半乳糖转移酶2双抗体夹心elisa试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种ELISA试剂盒，具体涉及一种抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用，属于病毒检测技术领域。
背景技术：
N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)家族是催化蛋白质肽链上丝氨酸或苏氨酸残基以合成O-糖链的起始酶之一,在肿瘤标志抗原(Tn antigen)合成中扮演重要角色。其中ppGalNAc-T2负责血清IgAI铰链区的糖基化(参见J Biol Chem，2003, 278
(8):5613)，近年来研究表明，ppGalNAc-T2在多种人肿瘤组织中存在异常表达，例如在鳞状癌变组织中ppGalNAc-T2表达升高；在结肠癌中发现了 ppGalNAc-T2表达的异常升高；郭向红应用RT PCR法研究白血病细胞株k562与SH1-1糖基转移酶mRNA表达的差异而探讨了白血病细胞株K562与SH1-1糖基转移酶表达的差异，发现在K562和SH1-1中存在ppGalNAc-T2较高水平的表达(参见:郭向红等中国血液流变学杂志2005; 15(1):32);重要的是针对这些发现可以推断，这些存在于肿瘤中ppGalNAc-T2的异常表达情况可成为潜在的肿瘤诊断依据。来自日本的Takuhiro Kohsaki等用兔抗人ppGalNAc_T2多克隆抗体检测结肠癌细胞及组织，发现PpGalNAc_T2存在明显高表达(参考:J Gastroenterol 2000 35:840)；丹麦的Ulla Mandel研究小组就成功制备了鼠抗人ppGalNAc_T2单克隆抗体并命名为UH4(IgGl)，可用于间接免疫酶联吸附试验(ELISA)、免疫荧光流式细胞分析法和免疫共沉淀法，该研究小组还对该抗体作了较为细致深入的研究(参考=Glycobiology 19999(1):43)。另一方面，应用双抗体夹心ELISA试剂盒的方法对各种蛋白质等大分子的检测，受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于其余测试方法，具有操作简单、快速、灵敏、准确的特点。应用双抗体夹心ELISA法对肿瘤患者的糖基转移酶筛查已经有相关报道，如像岩藻糖转移酶、唾液酸转移酶等ELISA试剂盒已经用于肿瘤患者血清的筛查，均表现出了良好的应用价值与前景。但是尚未见到有关于抗人ppGalNAc-T2双抗体夹心ELISA试剂盒以及利用其对抗人ppGalNAc-T2蛋白体外检测的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、精确度高、操作简便、检测快速的抗人ppGalNAc-T2双抗体夹心ELISA试剂盒，并公开了其应用方法。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2双抗体夹心ELISA试剂盒，包括洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液，其特征在于，它还包括:
(I)包被抗体的酶标板:以抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2单克隆抗体为包被抗体，用包被液将单抗稀释到lOPg/ml，每孔加入lOOPL，4°C冰箱中过夜，用洗涤液洗涤2 4次，再向酶标板中加入封闭液，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反应I 2h，洗涤液洗涤2 4次制得；所述封闭液为1%牛血清白蛋白、5%牛血清白蛋白、1%马血清、5%马血清或者5%脱脂奶
粉；
(2)检测抗体:兔源抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2多克隆抗体；
(3)酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体；
(4)标准对照蛋白:包括标准阳性对照N-乙酰氨基半乳糖转移酶2蛋白，标准阴性对照大肠杆菌菌体蛋白。上述技术方案中，所述抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2010106的杂交瘤细胞株LW-5F3分泌制得，制备方法已被中国发明专利CN102061287B 公开。上述技术方案中，所述抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2多克隆抗体的制备方法为:将抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2蛋白与弗氏完全佐剂进行1:1混合进行纯化，选择2.0 2.5 kg之间的大白兔进行四次免疫，时间分别为第I天，第14天，第28天和第42天，第4次免疫后一周进行颈动脉采血，分离血清，即得兔源抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2多克隆抗体。上述技术方案中，所述包被液的制备方法为:1.59g Na2C0jP2.93g NaHCO3加水充分溶解后，加去离子水定容为1L。本发明还公开了上述双抗体夹心ELISA试剂盒在抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2蛋白体外检测中的应用， 包括以下步骤:
(1)加待检样品:取试剂盒中的包被抗体的酶标板，向其中加入经过处理的待检样品，IOOPL/孔，同时分别设立阳性对照和阴性对照，37°C下反应45 75min，洗涤液洗涤2 4次；
(2)添加检测抗体:取试剂盒中的检测抗体，与样品稀释液按1: 100的体积比稀释后加入到上述酶标板中，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反应25 35min，洗涤液洗涤2 4次；
(3)添加酶标抗体:取试剂盒中的酶标抗体，用洗涤液按照1: 500的比例进行稀释并混匀，IOOPL/孔，37°C下反应45 75min，以洗涤液洗涤2 4次；
(4)显色:加入显色液，ΙΟΟμ ν孔,在室温下显色10 15min,用终止液终止显色；
(5)测光密度值:用酶标仪进行测量，测光密度值。本发明中洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液属于现有技术，本领域技术人员可以根据需要配置，本发明优选:
洗涤液-M NaCl 8g、KH2PO4 0.27g、Na2HPO4 1.42g、KCl 0.2g，用 800mL 双蒸水溶解后加入0.5mL Tween-20，充分混匀，调整PH至7.2，定容至IOOOmL ；
样品稀释液-M NaCl 8g、KH2PO4 0.27g、Na2HPO4 1.42g、KCl 0.2g，用 800mL 双蒸水溶解后加入IOg标准牛血清蛋白BSA，充分溶解混匀，调整PH至7.2，定容至IOOOmL ；
显色液包括底物液A和底物液B，其中底物液A:取3，3’，5’，5-四甲基联苯二胺0.2g，无水乙醇IOOmL,加双蒸水定容至IOOOmL ;底物液B:取Na2HPO4 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75%过氧化氢尿素溶液6.4mL,加双蒸水800mL,调节PH至5.2,补充双蒸水定容至IOOOmL ；终止液:2M H2SO4溶液。
本发明利用抗人ppGalNAc_T2单克隆抗体和抗人ppGalNAc_T2多克隆抗体，制备抗人PpGalNAc-T2双抗体夹心ELISA试剂盒；采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)方法，用该试剂盒定量检测患者血清中抗人ppGalNAc-T2的含量，尤其是白血病患者。通过对不同类型白血病患者血清中抗人PpGalNAc-T2的含量，并与正常人血清抗人ppGalNAc-T2含量比较，借助这些差异给白血病早期发现提供一个重要的参考依据。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:
1.本发明采用抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体和抗人ppGalNAc_T2多克隆抗体作为试剂盒的主要试剂，有力地排除了多种非特异性的干扰，特异性强，并且能够检测同一抗原的不同表位，使检测结果更准确。2.本发明的检测仪器简单，操作步骤简便、快速，检测成本低，适用于大量样品的检测，易于推广普及。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述:
实施例一:兔源抗人ppGalNAc-T2多克隆抗体的制备
用中国发明专利CN102061287B公开的重组抗人ppGalNAc_T2蛋白(lmg/mL)作为免疫原，取该抗原100 μ L，与弗氏完全佐剂进行1:1混合。在旋涡振荡仪上将抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂(油包水)，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射，每个区域大约用1/4的免疫原，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。抗原注射以前需要收集一些正常血清，用于检测抗体时作为阴性对照。注射四天后进行兔耳动脉取血，取血量3ml。首次免疫用FCA，以后都用FIA。采用初次免疫的注射方法，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量相同，免疫四次。可在初次免疫一周后，兔耳缘静脉取血ImL检测抗体效价。采用ELISA方法，具体操作步骤:取免疫兔血清和正常兔血清各50μ L作为待检抗体，检测前一天将ppGalNAc-T2重组蛋白用包被液按1:20稀释以100 μ L每孔包被至酶标板中，4°C过夜包被，然后用0.01 PBS洗涤液洗涤3次，然后封闭孵育2h，经洗涤后加入100 μ L (1:500)辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，显色15min后终止反应，酶标仪测0D450，以阴阳孔OD比值作阳性标准，P/N > 2.1为阳性，其中P为待检样品的OD值，N为阴性对照的OD值。最后一次免疫后取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下:家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢，头部略放低以暴露颈部，剃毛并消毒皮肤，沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突�。弥蓖分寡掷胄厮橥患∮肫芗涞木比乔杷勺橹┞冻鼍弊芏龊笥猛渫费劭颇魇怪卫耄肷窬徒岬拮橹诙鱿绿兹肓礁谒肯撸直鹬糜谠缎募敖亩耍嵩缎亩说乃肯撸亩说亩鲇醚芗屑凶。眯∧粗傅嬖谘芟拢眉馔费劭剖质跫粼诹礁肯呒涞亩鲨瞪霞粢恍】�(勿剪断)，插入塑料放血管，再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱，松开止血钳，使血液流入容器中。将血样室温静置2h，然后3000rpm离心20min,吸取上层透明血清即可，将血清分装，_80°C保存。实施例二:酶标抗体的制备 取40ml兔血清置于烧杯中，加入40ml 0.0lM pH7.2 PBS混匀，然后逐滴加入80ml饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，室温静置30分钟，3000rpm离心30分钟，去上清留沉淀。在沉淀中加入80mlPBS溶解沉淀，再加饱和硫酸铵溶液达到33%饱和度，边加边搅拌，室温静置30分钟，3000rpn离心20分钟去上清留沉淀，如此反复2 3次。再将沉淀物溶于12ml水中.对0.07M pH6.3磷酸盐缓冲液4°C透析，直至外液与奈氏试剂或I %的BaCl反应呈阴性为IP。透析完毕，3000rpm离心5分钟，去上清即为粗提的IgG溶液(酶标抗体)。实施例三:酶标板反应均一性检测
随机选择3块酶标板，按照I μ g/ml兔的IgM (G)UOO μ L/孔加入，4°C过夜，弃去进行洗涤，重复洗涤3次，将酶标板拍干，加入牛血清封闭液(10%)200 μ L/孔进行37°C封闭I小时，洗去封闭液(同上)，然后100 μ L/孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1:500)，37°C孵育lh，洗涤；然后加入100 μ L/孔显色液避光15min，加入50 μ L/孔终止液，酶标仪测OD值，计算各孔间变异系数，检测酶标板均一性。实施例四:包被单抗最佳包被浓度和多抗最佳工作浓度确定
用包被液将纯化的抗人PpGalNAc-T2单克隆抗体进行稀释，比例依次为:1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:10000、1:12800、1:25600 ;分别包被板过夜(4°C )。用含1%胎牛血清的PBS稀释液将纯化的兔多抗按照1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:10000 进行稀释，按照方阵进行加样。用 L929-ppGalNAc_T2 细胞裂解蛋白做阳性样品、L929-M0CK做阴性对照，进行夹心ELISA，每组设3复孔。比较各组的OD平均值，按照阴阳性比值P/N > 2.1确定最适单抗包被浓度和最适多抗浓度。实施例五:封闭液和封闭时间优化
以最适单抗浓度4°C过夜包被酶标板，洗涤后，分别以1% BSA、5%BSA、1%马血清、5%马血清、5%脱脂奶粉5种不同的封闭液封闭，200 μ I/孔，37°C封闭2小时，进行双抗夹心ELISA，比较各组阴阳性样品的OD值，以确定不同封闭液的封闭效果。以最适单抗浓度4°C过夜包被酶标板，洗涤后，200 μ I/孔加入最佳封闭液37°C封闭，封闭时间选择0.5、1.0、1.5、2、3小时，分别进行ELISAdIU OD值。比较各组阴阳性样品的OD值，以确定最佳封闭时间。实施例六:抗体稀释液优化
以最适单抗浓度和包被条件包被酶标板，经过封闭后加入阴阳性样品，多抗和酶标二抗分别三各比例稀释液1:100、1:500和1:3000稀释，第I组用I % BSA PBST，第2组用5 %，第3组用5%马血清PBST，37〃C下反应2小时后，经洗涤，加底物显色15分钟终止反应，酶标仪测定0D450值，以确定最佳抗体稀释液。实施例七:检测极限确定
用5pg/ml的单抗包被好的酶标板，将临床血清进行1:10、1:50,1 =IOOU:500、1:1000、1:2000,1:5000,1:10000的8个稀释度进行ELISA测定，同时设立阴阳性对照。实施例八:重复性试验鉴定
板内重复性验证:用单抗包被板置于37°C lh，然后4°C过夜，洗涤后封闭，在同一块板内检测6份不同的样品:3份阳性对照品和3份阴性样品，每份样本重复3孔，按照优化的最佳条件进行ELISA检测，计算同一份样本0D450值的变异系数CV%，用来评价板内检测样品的重复性。
板间重复性验证:用6块包被好的酶标板在相同条件下，不同时间点重复检测6份样品:3份阳性对照品和3份阴性样品，每份样本重复3孔，按照优化的最佳条件进行ELISA检测，计算同一份样本0D450值的变异系数CV%，用来评价板内检测样品的重复性。以CV%低于10%，且无显著性差异为临界判断标准。
权利要求
1.一种抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2双抗体夹心ELISA试剂盒，包括洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液，其特征在于，它还包括: (1)包被抗体的酶标板:以抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2单克隆抗体为包被抗体，用包被液将单抗稀释到lOPg/ml，每孔加入lOOPL，4°C冰箱中过夜，用洗涤液洗涤2 4次，再向酶标板中加入封闭液，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反应I 2h，洗涤液洗涤2 4次制得； 所述封闭液为1%牛血清白蛋白、5%牛血清白蛋白、1%马血清、5%马血清或者5%脱脂奶粉； (2)检测抗体:兔源抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2多克隆抗体； (3)酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体； (4)标准对照蛋白:包括标准阳性对照N-乙酰氨基半乳糖转移酶2蛋白，标准阴性对照大肠杆菌菌体蛋白。
2.根据权利要求1所述的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2010106的杂交瘤细胞株LW-5F3分泌制得。
3.根据权利要求1所述的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2多克隆抗体的制备方法为，将抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2蛋白与弗氏完全佐剂进行1:1混合进行纯化，选择2.0 2.5Kg之间的大白兔进行四次免疫，时间分别为第I天，第14 天，第28天和第42天，第4次免疫后一周进行颈动脉采血，分离血清，即得兔源抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被液的制备方法为:1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3加水充分溶解后，加去离子水定容为1L。
5.根据权利要求1 4中任意一项所述的双抗体夹心ELISA试剂盒在抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2蛋白体外检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)加待检样品:取试剂盒中的包被抗体的酶标板，向其中加入经过处理的待检样品，IOOPL/孔，同时分别设立阳性对照和阴性对照，37°C下反应45 75min，洗涤液洗涤2 4次； (2)添加检测抗体:取试剂盒中的检测抗体，与样品稀释液按1: 100的体积比稀释后加入到上述酶标板中，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反应25 35min，洗涤液洗涤2 4次； (3)添加酶标抗体:取试剂盒中的酶标抗体，用洗涤液按照1: 500的比例进行稀释并混匀，IOOPL/孔，37°C下反应45 75min，以洗涤液洗涤2 4次； (4)显色:加入显色液，ΙΟΟμ ν孔,在室温下显色10 15min,用终止液终止显色； (5)测光密度值:用酶标仪进行测量，测光密度值。
全文摘要
本发明公开了一种抗人N-乙酰氨基半乳糖转移酶2双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液、包被抗体的酶标板、检测抗体、酶标抗体以及标准对照蛋白；其检测方法为将待检样品放入包被抗体的酶标板，再依次添加捕获抗体、酶标抗体反应后加显色剂显色，测OD值。本发明采用单克隆抗体和多克隆抗体作为试剂盒的主要试剂，有力地排除了多种非特异性的干扰，特异性强，并且能够检测同一抗原的不同表位，使检测结果更准确；本发明的检测仪器简单，操作步骤简便、快速，检测成本低，适用于大量样品的检测，易于推广普及。
文档编号G01N33/577GK103163300SQ20131006596
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者吴士良, 刘春亮, 林丹丹, 华东, 徐岚, 姜智 申请人:苏州大学
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