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专利名称：利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，一种利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌。
背景技术：
随着人类基因组大部分测序工作的完成，基因框架图已经绘就，但是，基因的功能不仅由其本身的序列决定，它给予生命的信息之多，变异之广，使患病机制成为一个极其复杂的问题，而基因功能的最终执行者是蛋白质，因此，研究蛋白质的结构和性质是揭示基因和病症链条中的最关键一环。既往对基因组学的研究，发现了一些与大肠癌形成发展密切相关的基因，如ras，p53，p16，nm23等等，其中ras基因的过表达和p16基因的缺失表达可作为大肠癌诊断的重要线索，继续进行深入研究，但上述基因组改变在大肠癌的早期诊断和预后判断方面缺乏特异性，且敏感性较差。
近年来，蛋白质组学改变在肿瘤的形成发展过程中的作用引起人们的极大关注，并取得了一定的研究成果。以往有关蛋白质的研究多采用色谱分离纯化，二维电泳，光谱，质谱定量定性等分析化学的研究技术。运用这些手段进行研究所必需的技术条件要求高，仪器昂贵，步骤繁琐，耗时冗长，不适合大规模临床筛选和检测。蛋白芯片的诞生为今天蛋白质的研究提供了一条快速发展的高速通道，它在识别特定蛋白质的表达物，进行蛋白质水平的药物筛选，揭示蛋白酶的作用，测定血清中小分子物质的含量以及肿瘤特异性蛋白标记物的识别等方面，均已证实较现有技术更为迅速准确。
蛋白芯片在癌症相关蛋白的研究领域内进展最快，国外学者将前列腺癌、卵巢癌患者与非癌对照者的血清或排泄物的样本通过蛋白芯片仪进行了研究，Petricoin III EF等用C16疏水性蛋白芯片分析了66例健康妇女、50例卵巢癌患者，图谱采用534、989、2，111、2,251、2,465质荷比(M/Z)蛋白峰综合分析，灵敏度100％、特异性95％、预测准确率94％，同样的标本用CA125阳性预测值只有35％，且主要反映在年轻人组中，而CA125在良性盆腔疾病中的假阳性率亦很高。Bao-Ling Adam应用SELDI蛋白芯片系统在金属表面芯片上确定了4.475kD，5.074kD，5.382kD，7.024kD，7.82kD，8.141kD，9.149kD，9.507kD，9.656kD等九个蛋白质用于检测前列腺癌，其灵敏度为83％，特异性为97％；而用PSA的灵敏度高于90％，但其特异性仅仅为25％。
目前，用于临床和正在探索的大肠癌早期诊断方法有1.粪便检查常用的有多骤酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)对粪便中脱落细胞进行的抑癌基因P53突变检测，但缺乏特异性。
2.大肠癌的血清学检查主要有血清中癌胚抗原(CEA)的放射免疫法检测，源于大肠癌的单克隆抗体如CEA，CA-50，CA195，CA199等的检测，其缺点仍是特异性较差，且不适合大规模普查。
3.生物学检查主要采用流式细胞术法，检测大肠癌组织中非整倍体细胞的数目来诊断大肠癌，其致命缺点仍是诊断特异性差。
4.用免疫组化法以及多骤酶链反应(PCR)，PCR-SSCP，核酸探针杂交法检测ras，p53，p16，nm23等基因的蛋白表达和基因突变，来诊断大肠癌，但对早期大肠癌的诊断及大肠癌肝转移的诊断特异性及敏感性均有待进一步提高。
5.内镜检查、超声内镜检查及影象学检查，虽能发现较早期的大肠癌，但因无症状的原位癌患者不易接受此类检查而不适合于大规模的普查。
到目前为止所有的相关研究都是以结直肠癌病人为样本，究竟这些检测指标在结直肠高危人群或普通人群的筛查中效果如何还有待进一步的验证。由于结直肠癌从细胞发生癌变到形成临床病灶需较长时间，如果能够在人体甚至细胞未出现任何病变前诊断出结直肠癌前兆，将大大提高结直肠癌患者的生存期。由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血清中发现并检测结直肠癌早期生物标志物将把结直肠癌的早期诊断提高到一个新的水平，从而最终降低结直肠癌的发病率和死亡率。

发明内容
本发明的目的是提供一种利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌的方法，能够在人体甚至细胞未出现任何病变前诊断出结直肠癌前兆，大大提高结直肠癌患者的生存期；由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血清中发现并检测结直肠癌早期生物标志物，将把结直肠癌的早期诊断提高到一个新的水平，从而最终降低结直肠癌的发病率和死亡率。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案所述的利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌，首先制取蛋白质组指纹图谱，取一定量临床病理确诊的结直肠癌患者、结直肠良性病患者及正常对照人员外周血，4℃冷藏析出血清后，离心吸取血清，分装，-80℃备用；检测时按一定浓度稀释；用美国赛弗吉公司的金属芯片；置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组波谱；对比分析结直肠癌患者、结直肠良性病患者及健康人员血清蛋白质组波谱，获得结直癌患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成蛋白质指纹图谱，采用此指纹图谱双盲法进行临床筛选试验，确定该指纹图谱的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。
本发明利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌，经试验结果证明，具有如下社会及经济效益本专利将为结直肠癌的早期发现、早期诊断提供准确、高效的检测方法。
本专利是本医疗单位在该领域的重要突破，可推广到医院做临床检测或对社区高危人群的定期监测，从而为结直肠癌高危人群的健康提供有利保障。本发明大大降低医疗费用的开支，促进医疗保险制度的改革。我们粗略估算一张蛋白芯片60美元，加上前处理费20美元，可作8个样品，每个样品10美元，每检测一人80元人民币，比传统诊断方法(电子肠镜、常规病检、CEA等方法综合诊断才可确诊)要便宜得多，且后者难以做出早期诊断。
操作简便，成本低，可重复性好，患者痛苦小，可大幅度提高早期结直肠患者的检出率，使结直肠患者的生存期进一步延长，甚至治愈。便于对高危人群进行大规模的检测。
图面说明

图1是利用血清特异性蛋白质组指纹图谱测定的病人与正常人在质荷比为8939Da处的蛋白质含量的差别示意图如图1中所示三组8939Da蛋白质含量差异正常人质荷比为8939Da蛋白质含量明显高于结直肠癌患者和结直肠息肉病患者，而结直肠癌患者又比结直肠息肉病患者要高。经方差分析，三组蛋白质含量差异有显著性(P≤0.01)图2是用Biomarker wizard软件分析结果图示
图2中所示各组相同质荷比蛋白质的相对含量的比较。
图3是分组示意及各节点所含样本的组成图3中所示终节点4，满足M822＜2.213终节点5；错误分组率1.67％。
表1三组在质荷比为8939Da处蛋白质的相对含量组别 例数蛋白质的相对含量(％)结直肠癌组 146 3.53±2.32正常人组 62 32.15±3.79结直肠良性病 32 0.99±0.46注三组蛋白质相对含量两两比较P≤0.01。
具体实施例利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌，首先制取蛋白质组指纹图谱，取一定量临床病理确诊的结直肠癌患者、结直肠良性病患者及正常对照人员外周血，4℃冷藏析出血清后，离心吸取血清，分装，-80℃备用。检测时按一定浓度稀释；用美国赛弗吉公司的金属芯片；置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组波谱；对比分析结直肠癌患者、结直肠良性病患者及健康人员血清蛋白质组波谱，获得结直癌患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成蛋白质指纹图谱，采用此指纹图谱双盲法进行临床筛选试验，确定该指纹图谱的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。
利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌，其操作步骤如下1)、血清的制备融解冰冻血清并4℃，20000g离心10min；每个样品取20ml血清，分别置于1.5ml离心管中；每管加40μl U9缓冲液(含9mol/L尿素，2％CHAPS，50mmol/L Tris-HCl pH9.0)；4℃振荡20min，使蛋白变性；取20μl变性后的样品，每管加入240μl U1缓冲液(U9缓冲液9倍稀释而成)；4℃振荡30min。
2)、芯片的制备芯片的预平衡芯片每孔加100mmol/L硫酸铜50μl，室温下200rpm振荡5min，倒除硫酸铜；用去离子水冲洗5次后甩干，每孔中加入100mmol/L醋酸钠(pH4.0)50μl，室温下200rpm振荡5min；芯片每孔加入结合/洗脱缓冲液(含100mmol/L磷酸钠，500mmol/L氯化钠pH7.0)150μl，置于振荡器上，室温孵育5min后除去缓冲液，重复1次。
加样每孔加入50μl稀释好的样品，置于振荡器上，4℃孵育60min。
洗脱用150μl结合/洗脱缓冲液冲洗3次，每次振荡5min，最后1次用1mmol/L HEPES pH7.0快速冲洗。
加EAM在EAM(SPA)中加入75μl乙氰，75μl 1％TFA，充分振荡5min确保SPA全部溶解，离心1min；每孔分2次加SPA(1μl/次)，2次之间允许各孔风干。
3)、血清蛋白质组波谱分析设定参数分别对三组所得质谱图进行分析，共测三组有差异的蛋白质峰为36个，其中病人组与正常人组及良性病组在35处蛋白质含量存在统计学显著性()。
4)、结直肠癌患者特异性蛋白质峰的获得146例病人与62例正常人和32例结直肠息肉病患者血清中蛋白质的组成，结果发现4467Da，8131Da，8939Da，9000Da，9134Da，8221Da，5369Da，5928Da，8324Da，15122Da10个蛋白质组成的生物标志物可将正常人与结直肠癌患者及结直肠息肉病患者准确的分组。用这个生物标志物分析数据共产生7个终节点其中终节点1、2、6均只包含结直肠癌患者，共142例，满足-0.147(M5928)-0.467(M7941)+0.527(M8131)-0.695(M8221)≤-1.050(括号代表相应蛋白质相对含量，下同)为终节点1，满足0.044(M5342)-0.060(M6632)+0.467(M7574)+0.024(M7768)-0.860(M8324)-0.193(M9192)≤0.211为终节点2，满足M8221_36≥2.213为终节点6；终节点3只包含结直肠良性病患者，共32例，满足0.044(M5342)-0.060(M6632)+0.467(M7574)+0.024(M7768)-0.860(M8324)-0.193(M9192)≥0.211；终节点7只包含正常人，共48例，满足0.288(M4467)-0.958(M8604)≥0.373；终节点4和5被软件识别为正常人，分别为12例和6例，其中各有2例直肠癌患者，满足M11732≤0.721为终节点4，满足M8221≤2.213为终节点5。错误分组率1.67％。
5)、阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度的确定用BioMarker Pattern软件统计学分析三组，结果显示用这10个蛋白质组成的生物标志物进行检测，发现142/146例结直肠癌患者与60/62例正常人及32/32例结直肠良性病患者被正确分组，准确率为98.33％(236/240)。146例患者中有142例患者被本方法诊断为结直肠癌患者，94例正常人及良性病患者均被本方法诊断为非结直肠癌患者。灵敏度和特异性分别为97.26％(142/146)，100％(94/94)。
6)、与结直肠部其他肿瘤及结直肠部炎性疾患的关系我们同时研究了家族性多发性息肉病、结直肠腺瘤及结直肠非肿瘤性息肉等结直肠部疾患，尚未发现以上9种特异性蛋白。
7)、实验的重复性从我们的试验结果看，SELDI-TOF-MS方法[4，5，6]的重复性很好，实验结果可靠，两样品孔测定的结果满足。y＝0.9865x+0.098；R2＝0.9583。
权利要求
1.一种用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌，其特征在于所述的用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌，首先制取蛋白组模板，取一定量临床病理确诊的结直肠癌患者、结直肠良性病患者及正常对照人员外周血，4℃冷藏析出血清后，离心吸取血清，分装，-80℃备用；检测时按一定浓度稀释；用美国赛弗吉公司的金属芯片；置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组波谱；对比分析结直肠癌患者、结直肠良性病患者及健康人员血清蛋白质组波谱，获得结直癌患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成蛋白质模板，采用此模板双盲法进行临床筛选试验，确定该指纹图谱的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。
2.实施如权利要求1所述的用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌，其特征在于所述早期诊断结直肠癌，其操作步骤如下1)、血清的制备融解冰冻血清并4℃，20000g离心10min；每个样品取20ml血清，分别置于1.5ml离心管中；每管加40μl U9缓冲液(含9mol/L尿素，2％CHAPS，50mmol/L Tris-HCl pH9.0)；4℃振荡20min，使蛋白变性；取20μl变性后的样品，每管加入240μl U1缓冲液(U9缓冲液9倍稀释而成)，4℃振荡30min。2)、芯片的制备芯片的预平衡芯片每孔加100mmol/L硫酸铜50μl，室温下200rpm振荡5min，倒除硫酸铜；用去离子水冲洗5次后甩干，每孔中加入100mmol/L醋酸钠(pH4.0)50μl，室温下200rpm振荡5min；芯片每孔加入结合/洗脱缓冲液(含100mmol/L磷酸钠，500mmol/L氯化钠pH7.0)150μl，置于振荡器上，室温孵育5min后除去缓冲液，重复1次。加样每孔加入50μl稀释好的样品，置于振荡器上，4℃孵育60min。洗脱用150μl结合/洗脱缓冲液冲洗3次，每次振荡5min，最后1次用lmmol/L HEPES pH7.0快速冲洗加EAM在EAM(SPA)中加入75μl乙氰，75μl1％TFA，充分振荡5min确保SPA全部溶解，离心1min；每孔分2次加SPA(1μl/次)，2次之间允许各孔风干。3)、血清蛋白质组波谱分析设定参数分别对三组所得质谱图进行分析，共测三组有差异的蛋白质峰为36个，其中病人组与正常人组及良性病组在35处蛋白质含量存在统计学显著性()。4)、结直肠癌患者特异性蛋白质峰的获得146例病人与62例正常人和32例结直肠息肉病患者血清中蛋白质的组成，结果发现4467Da，8131Da，8939Da，9000Da，9134Da，8221Da，5369Da，5928Da，8324Da，15122Da10个蛋白质组成的生物标志物可将正常人与结直肠癌患者及结直肠息肉病患者准确的分组；用这个生物标志物分析数据共产生7个终节点其中终节点1、2、6均只包含结直肠癌患者，共142例，满足-0.147(M5928)-0.467(M7941)+0.527(M8131)-0.695(M8221)≤-1.050(括号代表相应蛋白质相对含量，)为终节点1，满足0.044(M5342)-0.060(M6632)+0.467(M7574)+0.024(M7768)-0.860(M8324)-0.193(M9192)≤0.211为终节点2，满足M8221_36≥2.213为终节点6；终节点3只包含结直肠良性病患者，共32例，满足0.044(M5342)-0.060(M6632)+0.467(M7574)+0.024(M7768)-0.860(M8324)-0.193(M9192)≥0.211；终节点7只包含正常人，共48例，满足0.288(M4467)-0.958(M8604)≥0.373；终节点4和5被软件识别为正常人，分别为12例和6例，其中各有2例直肠癌患者，满足M11732≤0.721为终节点4，满足M8221≤2.213为终节点5。错误分组率1.67％。5)、阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度的确定用BioMarker Pattern软件统计学分析三组，结果显示用这10个蛋白质组成的生物标志物进行检测，发现142/146例结直肠癌患者与60/62例正常人及32/32例结直肠良性病患者被正确分组，准确率为98.33％(236/240)。146例患者中有142例患者被本方法诊断为结直肠癌患者，94例正常人及良性病患者均被本方法诊断为非结直肠癌患者。灵敏度和特异性分别为97.26％(142/146)，100％(94/94)。6)、与结直肠部其他肿瘤及结直肠部炎性疾患的关系我们同时研究了家族性多发性息肉病、结直肠腺瘤及结直肠非肿瘤性息肉等结直肠部疾患，尚未发现以上9种特异性蛋白。7)、实验的重复性从我们的试验结果看，SELDI-TOF-MS方法[4，5，6]的重复性很好，实验结果可靠，两样品孔测定的结果满足。y＝0.9865x+0.098；R2＝0.9583。
全文摘要
利用血清特异性蛋白质组指纹图谱早期诊断结直肠癌，首先制取蛋白组模板，取一定量临床病理确诊的结直肠癌患者、结直肠良性病患者及正常对照人员外周血，4℃冷藏析出血清后，离心吸取血清，分装，－80℃备用；检测时按一定浓度稀释；用美国赛弗吉公司的金属芯片；置入美国赛弗吉公司飞行质谱仪，分析样品血清蛋白质组波谱；对比分析结直肠癌患者、结直肠良性病患者及健康人员血清蛋白质组波谱，获得结直癌患者血清中特异的蛋白质波峰；将发现的血清中特异的蛋白质波峰进行组合后形成蛋白质模板，采用此模板双盲法进行临床筛选试验，确定该指纹图谱的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。
文档编号G01N33/68GK1547030SQ200310110188
公开日2004年11月17日 申请日期2003年11月28日 优先权日2003年11月28日
发明者高春芳, 赵光, 宋国英 申请人:高春芳