专利名称：二氧化碳含量测定方法及二氧化碳诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定二氧化碳(碳酸氢根)含量的方法，同时本发明还涉及二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
血液内二氧化碳的含量对人体内酸碱平衡的调节起着重要的作用。血液pH的恒定是维持生命活动必不可少的条件，血浆中的多种缓冲系统中以碳酸氢盐缓冲系统最为重要，直接影响血液的pH。
血液内二氧化碳的含量变化主要反映代谢性酸碱平衡紊乱。单纯代谢性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根[HCO3-]下降或升高，总二氧化碳也随之下降或升高。而单纯呼吸性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根升高或下降。
总二氧化碳和碳酸氢根的测定方法较可分为直接测定和间接推算两类。直接测定主要有量气法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流动注射气体扩散法等。间接推算是利用血气分析仪测得的PH与PCO2，根据H-H方程的变换形式HCO3-(m mol/L)＝0.03×PCO2(mm Hg)×antilog(PH-p ka)或HCO3-(m mol/L)＝0.225×PCO2(k Pa)×antilog(PH-p Ka)计算获得。
式中PH为37℃时测得值，p ka在37℃为6.10。
目前，以间接推算法应用较普遍，由血液分析仪的微处理计算机并与血气分析结果一起报告，准确性基本可以符合临床要求。
直接测定法以滴定法应用最广泛，但由于受多种因素影响，测定误差较大。
酶法测定适合自动化分析，结果可靠，应当是很有前途的测定方法，但目前尚有待深入研究。
检索中国专利发现，申请号为96190276.0、申请日为1996.02.06的发明专利申请公开了一种用来导出病人血液中气体含量的非侵入性的系统和方法。该系统相应于体积测量呼气中的二氧化碳浓度。然后处理该数据导出动脉血中二氧化碳气体水平。若数据为时间域，处理可将时间域数据转换成体积域。该方法也经迭代评估了多个变量的显著性，所得的关系可供快速和准确地对健康人和患肺病病人进行血中气体含量的测定。近年来，申请号为02282386.7、申请日为2002.10.29的实用新型专利公开了一种医用的血液碳酸氢根测定仪，主要由操作面板、进样检测机构、定滴加液机构、搅拌机构和以单片机为主控元件的电器控制部分组成。
以上专利均与酶法测定无关，这从一个侧面说明，国内此方面的实验研究十分缺乏。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的二氧化碳(碳酸氢根)含量的测定方法。同时本发明还给出实现该方法的二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行二氧化碳(碳酸氢根)含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定二氧化碳(碳酸氢根)含量的步骤如下1)、将样品与主要由磷酸烯醇式丙酮酸、肌苷、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、乙醇、过氧化氢酶、氧化型辅酶、醛脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下方法原理的反应二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢过氧化氢+乙醇过氧化氢酶乙醛+水乙醛+氧化型辅酶+水醛脱氢酶乙酸+还原性辅酶+氢离子2)、检测最终反应物在主波长340nm处吸光度下降的速度，测算出二氧化碳(碳酸氢根)含量的大小。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，测算出二氧化碳(碳酸氢根)的含量的大小。
以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。二氧化碳(碳酸氢根)的含量。
本发明直接应用二氧化碳(碳酸氢根)和磷酸烯醇式丙酮酸经磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用后产生磷酸根，再酶偶联核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、醛脱氢酶等酶偶联反应系统，最终将氧化型辅酶还原成还原性辅酶，因为还原性辅酶在波长340nm有吸收峰，因此测试波长340nm吸收峰的增加程度可以直接反映二氧化碳(碳酸氢根)含量的大小。这个酶偶联反应系统的优点有(1)它利用测量氧化型辅酶被还原成还原性辅酶的生成量来反映二氧化碳(碳酸氢根)含量的大�。趸透冈谌芤褐械奈榷ㄐ员然乖愿父吆芏啵虼苏飧鱿低车奈榷ㄐ院芎�。(2)这个酶偶联反应系统组成的反应成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试结果精确。
用于实现本发明方法的二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.2--20mmol/l肌苷 0.2--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000--20000U/l核苷磷酸酶500--50000U/l黄嘌呤氧化酶 500--50000U/l乙醇 l--30mmol/l过氧化氢酶500--50000U/l氧化型辅酶0.5--20mm0l/l醛脱氢酶 500--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源磷酸根污染试剂I缓冲液40--200mm0l/l肌苷 0.2--10mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黄嘌呤氧化酶 500--50000U/l乙醇 1--30mmol/l过氧化氢酶500--50000U/l氧化型辅酶0.5--20mmol/l醛脱氢酶 500--50000U/l
稳定剂10--80％(总体积)试剂II缓冲液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.2--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000--20000U/l稳定剂10--80％(总体积)双剂的配方不仅限于上述配方。试剂II其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源磷酸根污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40--200mmol/l肌苷 0.2--10mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型辅酶 0.5--20mmol/l稳定剂 10--50mmol/l试剂II缓冲液 40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黄嘌呤氧化酶 500--50000U/l过氧化氢酶 500--50000U/l醛脱氢酶 500--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)
试剂III缓冲液40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 0.2--20mmol/l稳定剂10--50mmol/l三剂的配方不仅限于上述配方。其中的试剂I的成分，肌苷、乙醇、氧化型辅酶可以放在试剂II中。试剂II其中的成分，核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、醛脱氢酶等也可以放在试剂I中。试剂II其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶也可以放在试剂III中，如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-l-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。
以上氧化型辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等氧化型烟酰胺辅酶或其衍生物。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂盒较为理想缓冲液80--120mmol/l
磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l肌苷 1--5mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000--10000U/l核苷磷酸酶6000--20000U/l黄嘌呤氧化酶 5000--20000U/l乙醇 5--15mmol/l过氧化氢酶5000--15000U/l氧化型辅酶2--6mmol/l醛脱氢酶 5000--20000U/l稳定剂20--50％(总体积)由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源磷酸根的污染，消除内、外源磷酸根的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源磷酸根已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试二氧化碳(碳酸氢根)含量所需要的磷酸根都是产生于二氧化碳(碳酸氢根)的作用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂盒包括缓冲液80mmol/l
磷酸烯醇式丙酮酸 1mmol/l肌苷 1mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000U/l核苷磷酸酶6000U/l黄嘌呤氧化酶 5000U/l乙醇 5mmol/l过氧化氢酶5000U/l氧化型辅酶2mmol/l醛脱氢酶 5000U/l稳定剂50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测二氧化碳(碳酸氢根)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢过氧化氢+乙醇过氧化氢酶乙醛+水乙醛+氧化型辅酶+水醛脱氢酶乙酸+还原性辅酶+氢离子将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度上升的幅度，从而测算出二氧化碳(碳酸氢根)的含量。
本实施例直接应用二氧化碳(碳酸氢根)和磷酸烯醇式丙酮酸经磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用后产生磷酸根，再酶偶联核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、醛脱氢酶等酶偶联反应系统，最终将氧化型辅酶还原成还原性辅酶，因为还原性辅酶在波长340nm有吸收峰，因此测试波长340nm 收峰的增加程度可以直接反映二氧化碳(碳酸氢根)含量的大小。
实施例二(双剂)本实施例的二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l肌苷 3mmol/l核苷磷酸酶13000U/l黄嘌呤氧化酶 12500U/l乙醇 10mmol/l过氧化氢酶10000U/l氧化型辅酶4mmol/l醛脱氢酶 12500U/l稳定剂50％(总体积)试剂II缓冲液100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶8000U/l稳定剂50％(总体积)测定二氧化碳(碳酸氢根)含量时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测二氧化碳(碳酸氢根)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
具体测定步骤为
二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢过氧化氢+乙醇过氧化氢酶乙醛+水乙醛+氧化型辅酶+水醛脱氢酶乙酸+还原性辅酶+氢离子将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度上升的幅度，从而测算出二氧化碳(碳酸氢根)的含量。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液120mmol/l肌苷 5mmol/l乙醇 15mmol/l氧化型辅酶6mmol/l稳定剂20mmol/l试剂II缓冲液120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶10000U/l核苷磷酸酶20000U/l黄嘌呤氧化酶 20000U/l过氧化氢酶15000U/l醛脱氢酶 20000U/l稳定剂50％(总体积)
试剂III缓冲液120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 10mmol/l稳定剂20mmol/l在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测二氧化碳(碳酸氢根)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
具体测定步骤为二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢过氧化氢+乙醇过氧化氢酶乙醛+水乙醛+氧化型辅酶+水醛脱氢酶乙酸+还原性辅酶+氢离子将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度上升的幅度，从而测算出二氧化碳(碳酸氢根)的含量。
各反应步骤的反应时间控制在20分钟。
实施例四本实施例的二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l肌苷 1mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶8000U/l核苷磷酸酶10000U/l黄嘌呤氧化酶 10000U/l
乙醇 5mmol/l过氧化氢酶10000U/l氧化型辅酶2mmol/l醛脱氢酶 10000U/l稳定剂50％(总体积)试剂II缓冲液100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l稳定剂20mmol/l在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测二氧化碳(碳酸氢根)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢过氧化氢+乙醇过氧化氢酶乙醛+水，乙醛+氧化型辅酶+水醛脱氢酶乙酸+还原性辅酶+氢离子将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度上升的幅度，从而测算出二氧化碳(碳酸氢根)的含量。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种二氧化碳含量测定方法，包括以下步骤1)、将样品与主要由磷酸烯醇式丙酮酸、肌苷、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、乙醇、过氧化氢酶、氧化型辅酶、醛脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下方法原理的反应二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根肌苷+磷酸根核苷磷酸酶次黄嘌呤+1-磷酸核糖次黄嘌呤+水+氧黄嘌呤氧化酶尿酸盐+过氧化氢过氧化氢+乙醇过氧化氢酶乙醛+水乙醛+氧化型辅酶+水醛脱氢酶乙酸+还原性辅酶+氢离子2)、检测最终反应物在主波长340nm处吸光度下降的速度，测算出二氧化碳(碳酸氢根)含量的大小。
2.根据权利要求1所述二氧化碳含量测定方法，其特征在于所述步骤2)为将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速(程)度，测算出二氧化碳(碳酸氢根)的含量。
3.根据权利要求1或2所述二氧化碳含量测定方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述二氧化碳含量测定方法，其特征在于被测二氧化碳样品与试剂的比例控制在1/10到1/500。
5.一种二氧化碳诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液 40——200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸0.2——20mmol/l肌苷 0.2——10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000——20000U/l核苷磷酸酶500——50000U/l黄嘌呤氧化酶 500——50000U/l乙醇 1——30mmol/l过氧化氢酶500——50000U/l氧化型辅酶0.5——20mmol/l醛脱氢酶 500——50000U/l稳定剂10——80％(总体积)
6.根据权利要求5所述二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述氧化型辅酶是NADP+、NAD+或thio-NAD+氧化型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种测定二氧化碳(碳酸氢根)含量的方法，同时还涉及二氧化碳(碳酸氢根)诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、磷酸烯醇式丙酮酸、肌苷、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、乙醇、过氧化氢酶、氧化型辅酶、醛脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出二氧化碳(碳酸氢根)的含量。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号G01N21/33GK1763539SQ20041006505
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月20日 优先权日2004年10月20日
发明者王尔中 申请人:王尔中
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