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专利名称：一种高精度荧光各向异性显微成像装置及方法
技术领域：
本发明涉及到荧光显微成像的方法和仪器，特别是借助反射式宽场荧光显微镜，对生物样品进行高精度荧光各向异性显微成像的装置及方法。
背景技术：
光学显微成像技术可以在样品正常状态下，进行活体细胞的观察，最大程度地保持样品真实环境。但是，由于Abbe原则的限制，因此无法使用常规的宽场显微成像技术对纳米尺度下分子之间相互作用进行研究。荧光各向异性显微成像技术，是基于荧光偏振的光学现象，可以对纳米尺度的荧光分子间的相互作用进行功能成像，信号选择性强，与其他功能显微成像方法比，系统造价低。荧光各向异性的测量原理如

图1所示，通过测得的荧光水平发射光强度和垂直发射光强，计算出荧光分子的偏振度进而推导出荧光各向异性图像 KuO ο 而在〃Imaging lifetime and anisotropy spectra in the frequency domain, in Journal of Microscopy-Oxford, vol. 234，2009，pp. 80-88 所述，采用传统荧光偏振显微成像方法对不同样品进行观测可知罗丹明6G和59%甘油溶液的光强光谱分布均勻，但是在荧光偏振的荧光各向异性图上，可以明显看出噪声。而对于观察罗丹明6G和 50%甘油溶液和670nm的荧光球的一维空间分布光强光谱，从光强光谱上可以明显分辨出各自对应的谱线位置，但是在各向异性光谱上，噪声极其明显，对荧光球位置的辨识有一定白勺困难° 在 〃Wide_field time-resolved fluorescence anisotropy imaging (TR-FAIM): Imaging the rotational mobility of a fluorophore, “ in Review of Scientific Instruments, vol. 74，2003，pp. 182-192 中所述，对于 CHO 细胞表达 erbBl - eGFP 荧光图像和各向异性图像谱，在光强度图像上可以分辨细胞的内部细节，而在荧光偏振的各向异性图像上，基本分辨不出细胞的内部细节，预示着现有的荧光各向异性显微成像方法的分辨率还不足于支持对细胞内进行更精细的观测。

发明内容
针对困扰荧光各向异性显微成像分析的“低分辨率难题”，本发明提出一种新型高精度荧光各向异性显微成像装置及方法，可以大幅度提高荧光各向异性的偏振参数——各向异性值r的测量分辨率，并且装置具有更高的稳定性和更好的抗干扰能力。为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案
一种高精度荧光各向异性显微成像装置，依次包括激发光源、透镜组、反射式荧光显微镜、相机、计算机，所述反射式荧光显微镜包括激发滤波片、物镜、分光镜、发射滤波片；所述透镜组和激发滤波片之间包括一个起偏器，发射滤波片和相机之间包括一个可调角度检偏器，相机与计算机连接。所述起偏器与可调角度检偏器均为线偏振片。所述激发光源、透镜组以及起偏器组成荧光激发光路，可调角度检偏器、相机组成荧光成像光路。在荧光激发光路中不包含任何光学波片；在荧光成像光路中不包含任何光学波片，在发射滤波片和相机像平面之间的光路中，不包含任何光束分数装置。所述可调角度检偏器与计算机连接。所述透镜组由两个透镜组成，相机为CXD相机。本项发明的可调角度检偏器的回转中心与反射荧光光路的光轴中心重合；通过计算机控制线偏振光旋转控制器，每回转一个角度，相机拍下一帧样品反射的荧光显微图像， 并将荧光显微图像转换成为显微图像数据，经过图像采集卡送入计算机处理。一种高精度荧光各向异性显微成像装置的成像方法，包括以下步骤
1)激发光源发出的照明光通过透镜组转化为高斯光强分布，经线起偏器、激发滤波片、 分光镜后，由物镜聚焦于样品上；
2)样品反射的荧光经过物镜、分光镜、发射滤波片及可调角度检偏器后，在相机上成
像；
3)可调角度检偏器回转一个角度，相机拍下一帧荧光显微图像，并保存在计算机中；
4)计算可调角度检偏器P2角度变化的光强分布为
权利要求
1.一种高精度荧光各向异性显微成像装置，依次包括激发光源(1)、透镜组(2)、反射式荧光显微镜(3)、相机(4)、计算机(5)，所述反射式荧光显微镜(3)包括激发滤波片(31)、 物镜(32)、分光镜(36)、发射滤波片(33);其特征在于所述透镜组(2)和激发滤波片(31)之间包括一个起偏器(34)，发射滤波片(33)和相机(4)之间包括一个可调角度检偏器(35)， 相机(4)与计算机(5)连接。
2.根据权利要求1所述荧光各向异性显微成像装置，其特征是在于所述起偏器(34)与可调角度检偏器(35)均为线偏振片。
3.根据权利要求1所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述激发光源(1)、 透镜组(2)以及起偏器(34)组成荧光激发光路，可调角度检偏器(35)、相机(4)组成荧光成像光路。
4.根据权利要求1所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述可调角度检偏器(35)与计算机(5)连接。
5.根据权利要求1所述荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述透镜组(2)由两个透镜组成，相机(4)为CXD相机。
6.一种高精度荧光各向异性显微成像装置的成像方法，其特征在于包括以下步骤1)激发光源(1)发出的照明光通过透镜组(2)转化为高斯光强分布，经线起偏器(34)、 激发滤波片(31)、分光镜(36)后，由物镜(32)聚焦于样品上；2)样品反射的荧光经过物镜(32)、分光镜(36)、发射滤波片(33)及可调角度检偏器 (35)后，在相机(4)上成像;3)可调角度检偏器(35)回转一个角度，相机(4)拍下一帧荧光显微图像，并保存在计算机(5)中；4)计算可调角度检偏器(35)角度变化的光强分布为
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤3)的可调角度检偏器(35)回转角度由计算机(5)控制的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述可调角度检偏器(35)每回转一个角度，相机(4)拍下一帧图像。
全文摘要
本发明涉及一种高精度荧光各向异性显微成像装置及方法。在反射式荧光显微镜上，光源发出的光通过起偏器、激发滤波片和分光镜后，被显微物镜聚焦于样品上；样品反射的荧光通过物镜、分光镜和发射滤波片后，又通过一个可调角度检偏器，在CCD相机的像平面上成像；计算机控制可调角度检偏器绕成像光路的光轴步进回转，每旋转一个角度，CCD拍摄一帧偏振荧光图像，共计拍摄M幅图像；最后利用傅里叶变换，从M幅图像中计算出荧光各向异性的图像。本发明的特点是建立一种单通道荧光检偏光路，使荧光各向异性的测量分辨率大幅度提高，并且该显微成像系统具有更高的稳定性和更好的抗干扰能力。
文档编号G01N21/64GK102539400SQ20111045852
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者周延周, 王钦若, 白玉磊, 陈辞 申请人:广东工业大学