专利名称：一种用于猪、人和蚊子中乙型脑炎病毒抗原检测的elisa试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物病毒学与免疫学技术领域。具体涉及一种利用乙型脑炎病毒鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体建立的检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒及应用，该试剂盒可用于快速检测猪、人、蚊子等多种临床样品中乙型脑炎病毒抗原。本发明提供了乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体和兔源多克隆抗体的制备及纯化，以及用该单克隆抗体和多克隆抗体建立的可以检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA检测方法。
背景技术：
乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE，下文称之为JE)是由乙型脑炎病毒 (Japanese encephalitisvirus, JEV，下文称之为JEV)引起的一种严重的人畜共患的虫媒病毒性疾�。昀雌湓诙涎堑牧餍蟹植挤段д诓欢侠┐�。该病毒主要经过蚊子进行传播，猪是该病毒的主要自然宿主和传染源，感染后可引起母猪流产、死胎、木乃伊胎及公猪发生睾丸炎，对公众健康及畜牧业的发展都造成了严重的影响。JEV属于黄病毒科(Flaviridae)，黄病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，长约 111Λ，病毒RNA只含有一个长的开放阅读框架，该框架可分为二个区段近5’末端1/4区段编码病毒的三个结构蛋白基因，主要包括C，M(PrM)以及E蛋白基因；近3’末端3/4区段编码7个非结构蛋白基因，主要包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。其中，E蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，是病毒表面最重要的成分，它与病毒粒子的吸附、穿入、致病和诱导宿主的免疫应答等密切相关，同时E蛋白是体外中和作用的主要靶位点和特异性抗体的作用位点，可激发中和抗体和保护性免疫，针对E蛋白的特异性单克隆抗体具有很高的中和活性，对乙型脑炎的感染有很强的保护作用。我国是乙型脑炎病的高发国家，历来重视对乙型脑炎的检测及防治。迄今，国内用于乙型脑炎检测的方法可以分为抗原检测和抗体检测两大类。对抗原的检测主要包括病毒的分离鉴定、分子生物学方法如RT-PCR等，该类方法检测周期长、操作繁琐、对实验条件要求严格，不适用于临床大规模检测。针对抗体的诊断方法主要指血清学检测方法，如空斑减数中禾口试验(Plaque reduction neutralization test)、补体结合试验(Complement Fixation Test, CFT)、血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test, HIT)等，但这些传统的抗体检测方法也仅能用于疫苗免疫效果的评价，不能用于对病毒感染情况的监测。因而建立一种快速、简便、特异、灵敏的病原检测方法，并能够同时应用于临床患者及感染动物的诊断，就成为了乙型脑炎防治技术研究中的一项重要课题。目前，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙型脑炎抗体的方法已有不少报道。 例如有的是采用抗体捕捉ELISA检测血清中的IgM用于乙型脑炎的早期诊断(张明杰等，快速IgM抗体捕捉ELISA的建立及其在乙型脑炎早期诊断中的初步应用.病毒学杂志.1989，3 =251-154 ；)；有的是应用间接ELISA测定乙型脑炎病人血清中的特异性IgG(顾方舟等，酶联免疫吸附法ELISA测定乙型脑炎病人血清中特异性IgG.北京医学.1981，1-4)；也有应用乙型脑炎病毒的囊膜E蛋白或非结构蛋白建立的检测抗体的间接ELISA方法(张宁等，猪乙型脑炎病毒囊膜E蛋白间接ELISA诊断方法的建立与初步应用.中国畜牧兽医，2010,37(7) :170-175 ；吴鹏等，乙型脑炎病毒非结构蛋白NSl的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的初步建立.畜牧与兽医.2010,42(3) :5_8)。但针对乙型脑炎抗原的检测方法则少有报道，而同时能用于猪、人和蚊子样品中乙型脑炎病毒检测的ELISA方法则未见报道。虽然针对乙型脑炎抗原及抗体的ELISA检测方法国内已开展了以上一些相关研究，但无论是在人医还是兽医领域，至今仍没有一项完善的既能用于人的乙型脑炎抗原检测，又可以用于猪、蚊子等多种动物样品中乙型脑炎抗原检测的成熟方法。因此，建立一套快速、灵敏并面向基层的乙型脑炎抗原检测方法也就成为了防控乙型脑炎课题中的重要内容。已证实，利用乙型脑炎病毒囊膜E蛋白制备的单克隆抗体具有很高的中和活性， 它可以与乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位发生特异性的结合。而利用病毒多个抗原表位制备的多克隆抗体则具有结合力更强、反应效果更好的特性，所以利用这两种抗体构建的检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，并可用于多种临床样品的检测，这将为乙型脑炎的诊断和防治提供有效的工具。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，研制一种利用乙型脑炎病毒鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体建立的检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒及应用，该试剂盒可用于快速检测猪、人、蚊子等多种临床样品中乙型脑炎病毒抗原。本发明提供了乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体和兔源多克隆抗体的制备及纯化，以及用该单克隆抗体和多克隆抗体建立的可以检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA检测方法。本发明的的第一个目的是制备乙型脑炎E蛋白的单克隆抗体，为乙型脑炎双抗体夹心ELISA抗原检测方法提供了包被一抗。本发明的第二个目的是提供一种针对乙型脑炎病毒多抗原表位的多克隆抗体的制备方法，为乙型脑炎双抗体夹心ELISA抗原检测方法提供了第二抗体。本发明的第三个目的是利用该E蛋白单克隆抗体和兔源多克隆抗体制备一种适用于猪、人、蚊子中乙型脑炎病毒检测的双抗体夹心ELISA诊断试剂盒及其在临床诊断中的应用，该试剂盒既可以检测疑似感染动物，同时也可用于感染病人的诊断。本发明通过以下技术方案实现1、乙型脑炎病毒E蛋白的单克隆抗体的制备1)以乙型脑炎病毒感染仓鼠肾细胞(BHK21)后提取的总RNA为模板，通过RT-PCR 方法扩增乙型脑炎病毒外膜蛋白E基因(基因登录号AF315119. 1)，并将其重组到表达载体pGEX-KG(pKG)上，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。将构建得到的原核表达载体pKG-E转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，用氨苄青霉素抗性筛选单个重组菌，该菌株经诱导可以特异性地表达乙型脑炎病毒的E蛋白；2)将步骤1)所述的表达的E蛋白进行纯化后作为免疫原免疫Balb/c小鼠，并采血，用间接ELISA方法检测动物产生的抗体滴度，选择抗体滴度高的Balb/c小鼠进行加强免疫，并从该小鼠体内制备得到免疫脾细胞；3)制备骨髓瘤细胞(SP2/0)悬浮液并注射Balb/c小鼠，待小鼠长出实体瘤后制备骨髓瘤细胞，将骨髓瘤细胞与步骤幻所述的免疫脾细胞进行融合，制备出杂交瘤细胞4D1C，检测筛选出效价较高的杂交瘤细胞株并进行克隆扩大培养，该杂交瘤细胞株 JEV/4D1C于2010年11月11日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，其保藏号为 CCTCC NO :C2010114 ；4)将步骤幻所述的建株后的杂交瘤细胞4D1C扩大培养，收集上清液后腹腔注射小鼠，收集小鼠腹水，纯化后即得到乙型脑炎病毒E蛋白的单克隆抗体。2、兔源乙型脑炎病毒多克隆抗体的制备将乳化好的乙型脑炎弱毒疫苗按推荐剂量免疫兔，分别免疫四次，收集第四次免疫后的血清经纯化后即可获得抗乙型脑炎病毒的多克隆抗体，并测定该纯化的多克隆抗体的蛋白浓度及其反应效价。3、本发明的试剂盒的组装本发明制备的试剂盒由下列部分构成保藏号为CCTCC NO :C2010114的单克隆抗体包被的酶标板和乙型脑炎兔源多克隆抗体构成的双夹心抗体，辣根过氧化酶标记的羊抗兔酶标抗体，标准阳性对照乙型脑炎E蛋白，标准阴性对照大肠杆菌BL-21菌体蛋白，洗涤液，样品稀释液，底物液A、底物液B和终止液，其中所述的洗涤液，样品稀释液，底物液A、底物液B和终止液的组分及配比如下洗涤液=NaCl80. 0g, KH2PO4 2. 7g, Na2HPO4 · 12H20 14. 2g, KCl 2. 0g, Tween20 5mL，，加双蒸水至IOOOmL ；样品稀释液=NaCl0. 8g, KH2PO4 0. 27g, Na2HPO4 · 12H20 1. 42g, KCl 0. 2g, BSA 10g，加双蒸水至IOOOmL ；底物液A:3，3，，5，，5-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇IOOmL,加双蒸水至 IOOOmL ；；底物液B =Na2HPO4 14. 6g，柠檬酸9. 3g，0. 75%浓度的过氧化氢尿素6. 4mL，加双蒸水至IOOOmL,调节pH至5. 0 5. 4 ；终止液2mol/L硫酸溶液。4、乙型脑炎病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA方法该方法包括制备保藏号为CCTCC N0:C2010114的单克隆抗体包被的酶标板，乙型脑炎兔源多克隆抗体，辣根过氧化酶标记的羊抗兔酶标抗体，标准阳性对照乙型脑炎E蛋白，标准阴性对照BL-21菌体蛋白，洗涤液，样品稀释液，底物液A和底物液B和终止液，其步骤包括(1)以乙型脑炎E蛋白作为免疫原；(2)用步骤(1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO :C2010114的单克隆抗体；(3)用步骤(2)所述的单克隆抗体包被酶标板作为一抗；(4)将待检测样品用样品稀释液按体积比为1 10稀释得到待检测物；(5)用乙型脑炎弱毒疫苗免疫兔获得兔源多克隆抗体作为二抗；(6)对步骤(4)所述的待检测物进行检测，于酶标仪上读取630纳米处的吸光光度值；其中洗涤液，样品稀释液，底物液A和底物液B和终止液的组分及配比如下
洗涤液=NaCl80. 0g, KH2PO4 2. 7g, Na2HPO4 · 12H20 14. 2g, KCl 2. 0g, Tween20 5mL，，加双蒸水至IOOOmL ；样品稀释液=NaCl0. 8g, KH2PO4 0. 27g, Na2HPO4 · 12H20 1. 42g, KCl 0. 2g, BSA 10g，加双蒸水至IOOOmL ；底物液A:3，3，，5，，5-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇IOOmL,加双蒸水至 IOOOmL ；；底物液B =Na2HPO4 14. 6g，柠檬酸9. 3g，0. 75%浓度的过氧化氢尿素6. 4mL，加双蒸水至IOOOmL,调节pH至5. 0 5. 4 ；终止液2mol/L硫酸溶液。更详细的技术方案如实施例所述。本发明的有益效果是1、本发明的有益效果之一是构建了检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，为乙型脑炎病毒的抗原检测奠定了一定的基础。目前，ELISA主要是用于乙型脑炎的早期诊断或抗体水平的监测，但由于乙型脑炎病毒感染后，病毒血症时期短，脑脊液中病毒含量少，病毒分离阳性率极低，因此临床上检测该病原一直是个难题，本发明采用双抗体夹心 ELISA方法，探索影响因素，摸索实验条件，建立了有效检测乙型脑炎抗原的诊断方法。2、本发明的有益效果之二是为临床上乙型脑炎病毒感染情况的快速检测提供了有效的工具。ELISA方法实验操作简便易行，检测快速敏感，同时不需要精密的仪器设备，是一种面向基层并适用于大批量检测的有效方法。本发明根据实际应用需要所构建的双抗体夹心ELISA乙型脑炎抗原诊断试剂盒就解决了临床上乙型脑炎病毒难于检测的问题。3、本发明的有益效果之三是建立的双抗体夹心ELISA方法不仅可以用于猪的样品检测，也可以同时用于蚊子和人的样品中乙型脑炎病毒的检测，为本发明提供了更加广阔的应用空间。
序列表SEQ ID NO=I是本发明克隆的乙型脑炎病毒E基因的核苷酸序列。图1 本发明的ELISA反应原理图。图中A为E蛋白单克隆抗体；B为待检测抗原或样品；C为兔源多克隆抗体；D为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体；E为TMB底物。图2 本发明的技术流程图。图3 是本发明的表达乙型脑炎E蛋白重组质粒的构建图。图4 本发明在同一块酶标板上进行的标准阳性对照及标准阴性对照显色后的效果照片。图5 是将乙型脑炎病毒接种仓鼠肾细胞(BHK-21)后，用制备的兔源多克隆抗体进行间接免疫荧光的效果。图中图5A是乙型脑炎病毒接毒组；图5B是正常对照组。
具体实施例方式实施例1乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体及兔抗乙型脑炎多克隆抗体的制备1)乙型脑炎病毒E基因的克隆及原核表达载体的构建按徐高原报道的方法(徐高原等，乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因的克隆、测序与表达，中国人兽共患病杂志.2004，20(1) :22-25)，用包含乙型脑炎病毒E基因(基因登录号AF315119. 1)的重组质粒pKG_E (质粒构建图见图；3)转化大肠杆菌BL21感受态细胞， 涂布浓度为60ug/mL LB/氨苄青霉素(Amp)平皿，挑选多个单菌落放入LB液体培养基中于 37°C下培养12小时后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出乙型脑炎病毒E 蛋白，该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID:1所示。2)免疫脾细胞及骨髓瘤细胞的制备将步骤1)表达的E蛋白纯化后免疫4-6周龄的雌性Balb/c小鼠(购自湖北省疾病预防与控制中心实验动物中心)各5只。每次免疫2周后采血用间接ELISA检测动物产生的抗体滴度；至少间隔一个月后，选择抗体滴度高的Balb/c小鼠加强免疫后眼眶放血处死，分离制备免疫脾细胞；同时用骨髓瘤细胞(SP2/0)悬浮液注射Balb/c小鼠，待9-10天实体瘤生长后，处死小鼠并分离制备出活化的骨髓瘤细胞。3)免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合将步骤2)所述的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，制备得到杂交瘤细胞株4D1C，将获得的该杂交瘤细胞株于2010年11月11日送交武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC N0:C2010114。用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清用E蛋白包被酶标板作为阳性对照，以破碎的BL-21菌体蛋白包被同一块酶标板作为阴性对照，用洗涤液洗涤三次，加封闭液封闭，于37°C温育lh，洗涤三次，然后加入杂交瘤细胞的培养上清，于37°C温育lh，洗涤液洗三次后，加入体积比为1 5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37°C反应lh，用洗涤液洗涤三次后，分别加入底物液A 和B显色lOmin，加终止液终止反应之后，测定0D630值。选取与抗原包备板反应阳性而阴性对照板反应阴性且细胞生长旺盛形态好的细胞生长孔，进行克隆扩大培养杂交瘤细胞。上述包被液，封闭液，洗涤液，底物液A、B的组分及配比见附录。4)单克隆抗体的生产、纯化及效价的测定取8-10周龄的Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡0. 5ml/只，于7_10天后腹腔注射扩大培养的本发明制备的杂交瘤细胞4D1C，接种量为IO5-IO6/只，7-10天后抽取小鼠腹水，该腹水内即含有大量的乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体。使用IgG抗体纯化试剂盒(NAb Protein A/G Spin Kit，购自Thermo公司)纯化获得的E蛋白单克隆抗体(简称E单抗)，使用蛋白质浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit，购自PIERCE公司)测得该抗体浓度为0. 78mg/ml。具体步骤是，用本发明制备的乙型脑炎E蛋白包被酶标板，于4°C过夜，次日取出包被的酶标板洗涤后于37°C内封闭1小时，洗涤液洗涤5次后于孔内加入倍比稀释的乙型脑炎E蛋白单克隆抗体，每个稀释度做两孔重复，37°C内孵育30min，于孔内加入稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(Goat Anti-MouselgG，购自博士德公司)，37°C反应 30min，加洗涤液洗涤后分别再加入底物液A和B避光显色lOmin，终止反应后于酶标仪上读取630纳米处的吸光光度值(即0D630值，下同)，结果表明，本发明制备的单克隆抗体经 10万倍(体积比)稀释后的0D630值仍可达到1，说明本发明制备的单克隆抗体的效价可达到1 10万以上。测定结果见表1表1本发明的单克隆抗体的效价的测定
权利要求
1.一种乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO C2010114的杂交瘤细胞株JEV/4D1C所分泌的。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株JEV/4D1C，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为 CCTCC NO :C2010114o
3.包含权利要求1所述的单克隆抗体和兔源多克隆抗体的乙型脑炎双抗体夹心ELISA 抗原检测试剂盒。
4.一种适用于猪、人、蚊子中乙型脑炎病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒由下列部分构成保藏号为CCTCC NO :C2010114的单克隆抗体包被的酶标板和乙型脑炎兔源多克隆抗体构成的双夹心抗体，辣根过氧化酶标记的羊抗兔酶标抗体，标准阳性对照乙型脑炎E蛋白，标准阴性对照大肠杆菌BL-21菌体蛋白，洗涤液，样品稀释液，底物液A、底物液B和终止液，其中所述的洗涤液，样品稀释液，底物液A、底物液B和终止液的组分及配比如下洗涤液(10X 浓缩):NaCl 80. 0g, KH2PO4 2. 7g, Na2HPO4 · 12H20 14. 2g, KCl 2. Og, Tween205mL，，加双蒸水至 IOOOmL ；样品稀释液:NaCl 0. 8g, KH2PO4 0. 27g, Na2HPO4 · 12H20 1. 42g, KCl 0. 2g, BSA 10g，力口双蒸水至IOOOmL ；底物液A :3，3，，5，，5-四甲基联苯二胺200mg,无水乙醇IOOmL,加双蒸水至IOOOmL ；；底物液B =Na2HPO4 14. 6g，柠檬酸9. 3g，0. 75%浓度的过氧化氢尿素6. 4mL，加双蒸水至 IOOOmL,调节 pH 至 5. 0 5. 4 ；终止液anol/L硫酸溶液。
5.一种适用于猪、人、蚊子等临床样品中乙型脑炎病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA 方法，包括制备保藏号为CCTCC NO :C2010114的单克隆抗体包被的酶标板，乙型脑炎兔源多克隆抗体，辣根过氧化酶标记的羊抗兔酶标抗体，标准阳性对照乙型脑炎E蛋白，标准阴性对照BL-21菌体蛋白，洗涤液，样品稀释液，底物液A和底物液B和终止液，其步骤包括(1)以乙型脑炎E蛋白作为免疫原；(2)用步骤(1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCCNO :C2010114的单克隆抗体；(3)用步骤(2)所述的单克隆抗体包被酶标板作为一抗；(4)将待检测样品用样品稀释液按体积比为1 10稀释得到待检测物；(5)用乙型脑炎弱毒疫苗免疫兔获得兔源多克隆抗体作为二抗；(6)对步骤(4)所述的待检测物进行检测，于酶标仪上读取630纳米处的吸光光度值； 其中洗涤液，样品稀释液，底物液A和底物液B和终止液的组分及配比如下洗涤液(10X 浓缩):NaCl 80. 0g, KH2PO4 2. 7g, Na2HPO4 · 12H20 14. 2g, KCl 2. Og, Tween205mL，，加双蒸水至 IOOOmL ；样品稀释液:NaCl 0. 8g, KH2PO4 0. 27g, Na2HPO4 · 12H20 1. 42g, KCl 0. 2g, BSA 10g，力口双蒸水至IOOOmL ；底物液A :3，3，，5，，5-四甲基联苯二胺200mg,无水乙醇IOOmL,加双蒸水至IOOOmL ；；底物液B =Na2HPO4 14. 6g，柠檬酸9. 3g，0. 75%浓度的过氧化氢尿素6. 4mL，加双蒸水至 IOOOmL,调节 pH 至 5. 0 5. 4 ；终止液anol/L硫酸溶液。
6.权利要求1所述的单克隆抗体在制备乙型脑炎双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒中的应用。
7.权利要求3或4所述的试剂盒在乙型脑炎抗原体外检测中的应用。
全文摘要
本发明属于动物病毒学与免疫学技术领域，具体涉及一种用于猪、人和蚊子中乙型脑炎病毒抗原检测的双抗体夹心ELISA试剂盒。该试剂盒的核心试剂包括乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体作为一抗，兔源多克隆抗体作为二抗。本发明公开了乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体和兔源多克隆抗体的制备及纯化方法。还公开了乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA检测方法。分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NOC2010114。
文档编号G01N33/569GK102464716SQ201010549519
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者吴兵, 曹胜波, 朱碧波, 李么明, 梅力, 邵林, 陈焕春, 陈龙 申请人:华中农业大学
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