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专利名称：一种检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶联免疫吸附测定法，特别是涉及一种检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法。
背景技术：
酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)可用于测定抗原，也可用于测定抗体。间接竞争ELISA法是检测小分子物质常用的方法之一，其原理为将小分子物质的标准样品与载体蛋白的偶联物作为包被抗原吸附于固相载体上，加入待测样品和小分子物质特异性抗体，待测样品中的小分子物质和固相载体上的小分子物质竞争特异性抗体，再加入酶标二抗，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中小分子物质含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出待测样品中小分子物质的含量。检测小分子物质的间接ELISA法一般由以下步骤组成1)包被；2)洗板；3)加标准样品或待测样品、小分子物质特异性抗体；4)洗板；5)加酶标二抗；6)洗板；7)加底物显色和终止反应。

发明内容
本发明的目的是提供一种简化的检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法。
本发明所提供的检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法由以下步骤组成1)包被；2)洗板；3)依次加入标准样品和待测样品，酶标二抗和小分子物质特异性抗体；4)洗板；5)加底物显色和终止反应。
本发明方法中所加入的酶标二抗和小分子物质特异性抗体的量与常规方法相比，酶标二抗浓度增加6到8倍左右，小分子抗体浓度增加1到2倍。
该方法中的包被、洗板、显色和终止步骤、以及制备包被抗原、酶标二抗等方法均可按照本领域的常规方法进行。
所述包被步骤为将小分子物质与载体蛋白的偶联物固定于固相载体表面；所述载体蛋白为卵清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白或血兰蛋白，优选为卵清白蛋白(OVA)；所述小分子物质与载体蛋白的偶联物是小分子物质和载体蛋白用过碘酸钠法或其它方法进行偶联得到；所述固定方法可采用物理吸附或共价交联的方法；所述固相载体可为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等多种材料制成的微量反应板，优选为聚苯乙烯材料的微量反应板。
所述用于标记二抗的酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸钠法交联在二抗上；所述二抗可为抗鼠或抗兔抗抗体。
本发明的检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附剂测定法中，采用了加入酶标二抗之后立即加入小分子物质特异性抗体的步骤，与现有的方法(加入小分子物质特异性抗体，然后洗板，再加入酶标二抗)相比，不但省去了一步洗板的步骤，而且节省了酶标二抗与一抗温育结合所需的半小时，使测定时间缩短半小时以上，且能提高灵敏度3-5倍。该法更为简便、快捷、灵敏，具有较高的实际应用价值。


图1为常规间接竞争酶联免疫吸附测定法检测玉米素核苷(ZR)结果的标准曲线图2为简化的间接竞争酶联免疫吸附测定法检测玉米素核苷(ZR)结果的标准曲线具体实施方式
材料、试剂和仪器1、包被抗原所用的载体蛋白为卵清白蛋白，将玉米素核苷(ZR)和卵清白蛋白采用过碘酸钠法进行偶联，得到联接物(ZR-OVA)，用蒸馏水稀释成lmg/ml作为包被抗原。
2、抗体一抗用ZR-BSA(用过碘酸钠法偶联)免疫新西兰大耳白兔制备的抗玉米素核苷(ZR)的多克隆抗体。
酶标抗体(二抗)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(辣根过氧化物酶用过碘酸钠法与羊抗兔IgG交联)。
3、底物溶液A液过氧化脲1.0g，Na2HPO4·12H2O 35.8g，柠檬酸·H2O 10.3g，Tween-80 100μl，加1000ml蒸馏水，4℃保存备用。
B液TMB 700mg，DMSO 40ml，充分溶解，然后加蒸馏水960ml，柠檬酸·H2O 10.3g，4℃保存备用。
4、底物缓冲液取B液，再和相同体积的A液混合得到底物缓冲液。
5、包被缓冲液称取1.5g Na2CO3和2.93g NaHCO3，溶于1000ml蒸馏水，pH9.6。
6、磷酸盐缓冲液(PBS)称取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.5。
7、样品稀释液1000ml PBS中加入1ml Tween-20，1g明胶(稍加热溶解)。
8、洗涤液1000ml PBS中加入1ml Tween-20。
9、终止液2mol/L的硫酸溶液。
10、酶标板(Costar)11、酶联免疫分光光度计(MULTISKAN MK3，Thermo)12、待测样品处理称取1.0g新鲜棉花叶片，加2ml样品提取液(80％甲醇内含1mM的二叔丁基对甲酚)，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml样品提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。4℃下提取4h，1000g离心15min，取上清液。沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4℃下再提取1h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是80％甲醇(1ml)平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100％甲醇(5ml)洗柱→100％乙醚(5ml)洗柱→100％甲醇(5ml)洗柱→循环。将过柱后的样品转入5ml塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容至1.5ml，待测。
实施例1、用间接竞争酶联免疫吸附测定法检测小分子物质1、常规的间接酶联免疫吸附测定法检测玉米素核苷(ZR)检测过程包括以下步骤1)包被将包被抗原按1∶4000的比例用包被缓冲液稀释、混匀后，在酶标板的每孔中加入稀释后的抗原200μl，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘，37℃温育3hr。
2)洗板将包被好的酶标板取出，放在室温下平衡，甩掉包被液，用乳胶管将洗涤液均匀加入酶标板使每孔充满洗涤液，放置约0.5min，甩掉洗涤液，洗4次，最后将板内残留的洗涤液在吸水纸上甩干。
3)竞争a)加标准ZR样品和待测样品先将ZR标准物用样品稀释液稀释成2000ng/ml，再将其依次稀释为500ng/ml，100ng/ml，20ng/ml，4ng/ml，2ng/ml，1ng/ml和0ng/ml，共8个浓度，再将上述不同浓度的溶液加入96孔酶标板中，每个浓度平行做6个孔，每孔20μl；在另外48孔中每孔加入20μl待测样品；b)加抗体将ZR抗体(一抗)按1∶7200的比例用样品稀释液稀释、混匀后，向每孔中各加180μl。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘，37℃温育0.5hr。
4)洗板方法同步骤2)，洗4次。
5)加酶标二抗将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG用样品稀释液按1∶3000的比例稀释、混匀后，向酶标板每孔中各加200μl，然后将其放入内铺湿纱布的带盖瓷盘，37℃温浴0.5hr。
6)洗板方法同步骤2)，洗5次。
7)显色将底物缓冲液加入到酶标板中，每孔200μl，常温下显色15min，然后向每孔中加入100μl 2mol/L硫酸溶液终止反应。
8)结果测定用酶联免疫分光光度计依次测定各浓度标准物的OD450值。并将测定结果绘制成曲线图(图1)，图1中，纵坐标表示ZR标准样品的浓度(ng/ml)，横坐标表示B/B0(B0表示0ng/ml浓度标准样品的显色值，B表示其它各浓度标准样品的显色值)。根据图1得到曲线方程y＝34823e-10.035x，相关系数R2＝0.9808，由曲线得知I50为230.69ng/ml，I80为11.37ng/ml，检测极限为11.37ng/ml。待测样品的OD值为0.622，根据标准曲线算出待测样品中含有51.83ng/ml的ZR。
2、本发明的简化的间接竞争酶联免疫吸附测定法检测玉米素核苷(ZR)检测过程包括以下步骤1)包被将包被抗原按1∶4000的比例用包被缓冲液稀释、混匀后，在酶标板的每孔中加入稀释后的抗原200μl，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘，37℃温浴3hr。
2)洗板将包被好的酶标板取出，放在室温下平衡，甩掉包被液，用乳胶管将洗涤液均匀加入酶标板使每孔充满洗涤液，放置约0.5min，甩掉洗涤液，洗4次，最后将板内残留的洗涤液在吸水纸上甩干。
3)竞争a)加标准ZR样品和待测样品先将ZR标准物用样品稀释液稀释成2000ng/ml，再将其依次稀释为500ng/ml，100ng/ml，20ng/ml，4ng/ml，2ng/ml，1ng/ml和0ng/ml，共8个浓度，再将上述不同浓度的溶液加入96孔酶标板中，每个浓度平行做6个孔，每孔20μl；在另外48孔中每孔加入20μl待测样品；b)加酶标二抗将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG用样品稀释液按1∶900的比例稀释、混匀后，向酶标板每孔中各加90μl；c)加抗体将ZR抗体(一抗)按1∶1800的比例用样品稀释液稀释、混匀后，向每孔中各加90μl。然后将加入了标准样品、酶标二抗和抗体的酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘，37℃温浴0.5hr。
4)洗板方法同步骤2)，洗5次。
5)显色将底物缓冲液加入到酶标板中，每孔200μl，常温下显色15分钟，然后向每孔中加入100μl 2mol/L硫酸溶液终止反应。
6)结果测定用酶联免疫分光光度计依次测定各浓度标准物的OD450值。并将测定结果绘制成曲线图(图2)，图2中纵坐标表示ZR标准样品的浓度(ng/ml)，横坐标表示B/B0(B0表示0ng/ml浓度标准样品的显色值，B表示其它各浓度标准样品的显色值)。根据图2得到曲线方程y＝7345.9e-10.014x，相关系数为R2＝0.987，由曲线得知I50为49.17ng/ml，I80为2.44ng/ml，检测极限为2.44ng/ml。待测样品的OD值为0.742，根据标准曲线算出待测样品中含有51.59ng/ml的ZR，与常规方法的结果一致，说明本发明方法的准确度可靠。
整个过程与步骤1的方法相比，节省了酶标二抗与一抗结合所需的0.5小时。
上述实验结果表明常规的间接酶联免疫吸附测定法与简化后的间接酶联免疫吸附测定法的检测极限提高3到5倍，证明简化后的间接酶联免疫吸附测定法可更好的用于小分子物质的免疫检测。
权利要求
1.一种检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法，由以下步骤组成1)包被；2)洗板；3)依次加入标准样品和待测样品，酶标二抗和小分子物质特异性抗体；4)洗板；5)加底物显色和终止反应。
2.根据权利要求2所述的间接竞争酶联免疫吸附测定法，其特征在于所述载体蛋白为卵清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或血兰蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的间接竞争酶联免疫吸附剂测定法，其特征在于所述小分子物质与载体蛋白的偶联物是将小分子物质和载体蛋白用过碘酸钠法或戊二醛法偶联得到。
4.根据权利要求1或2所述的间接竞争酶联免疫吸附剂测定法，其特征在于所述用于标记二抗的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
5.根据权利要求4所述的间接竞争酶联免疫吸附剂测定法，其特征在于所述用于标记二抗的酶为辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求5所述的间接竞争酶联免疫吸附剂测定法，其特征在于所述辣根过氧化物酶用戊二醛法或过碘酸钠法交联在二抗上；所述二抗为抗鼠或抗兔抗抗体。
全文摘要
本发明公开了一种检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法。其目的是提供一种简化的检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法。该检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法，由以下步骤组成1)包被；2)洗板；3)依次加入标准样品和待测样品，酶标二抗和小分子物质特异性抗体；4)洗板；5)加底物显色和终止反应。本发明的检测小分子物质的间接竞争酶联免疫吸附测定法中，采用了加入酶标二抗之后立即加入小分子物质特异性抗体的步骤，与现有的方法相比，不但省去了一步洗板的步骤，而且节省了酶标二抗与抗体结合所需的半小时，使测定时间缩短半小时以上，而且提高了检测灵敏度3－5倍。
文档编号G01N33/535GK1766622SQ20041008625
公开日2006年5月3日 申请日期2004年10月28日 优先权日2004年10月28日
发明者王保民, 赵静, 俞彩霞, 何素平, 李召虎, 李刚, 何钟佩 申请人:中国农业大学