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专利名称：一种检测血清结缔组织生长因子用试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种用于肝纤维化实验室检测的试剂盒，特别涉及一种检测血清结缔组织生长因子用试剂盒。
背景技术：
目前，在肝纤维化的实验室诊断方面，多以检测细胞外间质(extracellulatrix,ECM)及其代谢产物作为辅助诊断指标。目前，临床较为常用的实验项目有111型前胶原(Procollagen III, PC III )、IV型胶原(Collagen IV,CIV)、层粘蛋白(Laminin, LN)和透明质酸(Hyaluronicacid, HA)。但在临床上，由于多种原因使得这些实验项目其诊断肝纤维化灵敏度与特异性均不够理想。因此，对于肝纤维化的实验室诊断寻找新的指标仍是临床上亟待解决的问题。 肝纤维化的辅助诊断的另外一些重要实验室指标，如细胞因子类项目可在大多数肝纤维化患者发生显著变化，但是目前临床实际应用的并不普遍。所以，仍需探索在诊断肝纤维化方面特异性好、灵敏度高且操作方便的方法。发明内容为了探索现有技术存在的诊断肝纤维化的特异性不好、灵敏度不高的缺点，本实用新型公开了一种检测血清结缔组织生长因子用试剂盒，具有较好的特异性和灵敏度，操作简便。本实用新型的技术方案为一种检测血清结缔组织生长因子用试剂盒，所述试剂盒由盒体和盒盖组成，盒体内分隔为试剂区和设备区，在试剂区设有9个试剂储液单元，分别为CTGF标准品储液单元、1:100生物素标记的CTGF抗体储液单元、1:100链霉亲和素-辣根过氧化物酶储液单元、标准品和标本用稀释液储液单元、生物素化抗体稀释液储液单元、酶结合物稀释液储液单元、浓缩洗涤液储液单元、TMB显色剂储液单元、终止剂储液单元，在设备区设有封口膜、若干包被板条和一个包被板条支架。所述的包被板条活动设于包被板条支架上。所述的包被板条为矩形板,板上设有12个盛液孔。所述的CTGF标准品储液单元的容积为O. 5ml、所述的1:100生物素标记的CTGF抗体储液单元的容积为150 μ I、所述的1:100链霉亲和素-辣根过氧化物酶储液单元的容积为150 μ I、所述的标准品和标本用稀释液储液单元的容积为16ml、所述的生物素化抗体稀释液储液单元的容积为16ml、所述的酶结合物稀释液储液单元的容积为16ml、所述的浓缩洗涤液储液单元的容积为20ml、所述的TMB显色剂储液单元的容积为12ml、所述的终止剂储液单元的容积为12ml。有益效果I.应用CTGF诊断肝纤维化患者的灵敏度可以达到65. 5%，特异度达到91. 1%0CTGF为诊断肝纤维化较为敏感的实验室指标。操作简便。
图I为本实用新型试剂盒打开状态下的结构示意图。其中I为试剂区，2为设备区。
具体实施方式
检测原理CTGF是ー种具有多种生理功能的细胞因子，作为转化生长因子(TGF-β)的下游作用因子，它主要由成纤维细胞等间质细胞产生，反过来又介导TGF-β对间质细胞的作用，可促进细胞增生和细胞外基质(ECM)合成、分泌胶原成份等。通过免疫组化和原位杂交等方法已经证实，当肝纤维化时CTGF水平明显增高，并可分泌进入外周血中，血清中的
CTGF主要来自于肝脏。当患者为肝纤维化患者时，患者的CTGF会出现大幅的升高。本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人结缔组织生长因子(CTGF)水平。首先用纯化的CTGF单体包被微孔板，制成固相抗体；向包被单抗的微孔中加入血清，血清中CTGF与单抗结合后，再与生物素标记的CTGF单体结合，形成抗体-抗原-生物素标记抗体复合物，经过彻底洗涤后，再加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)结合物，最后形成抗体-抗原-生物素标记抗体-链霉亲和素标记HRP的结合物。经过再次彻底洗涤后，カロTMB底物，TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的CTGF呈正比。用酶标仪在450nm波长下測定吸光度(Α值)，通过标准曲线计算样品中CTGF浓度。一种检测血清结缔组织生长因子用试剂盒，所述试剂盒由盒体和盒盖组成，盒体内分隔为试剂区和设备区，在试剂区设有9个试剂储液单元，分别为CTGF标准品储液单元、I 100生物素标记的CTGF抗体储液单元、1:100链霉亲和素-辣根过氧化物酶储液単元、标准品和标本用稀释液储液単元、生物素化抗体稀释液储液単元、酶结合物稀释液储液単元、浓缩洗涤液储液単元、TMB显色剂储液单元、终止剂储液单元，在设备区设有封ロ膜、若干包被板条和ー个包被板条支架。所述的CTGF标准品储液单元的容积为O. 5ml、所述的1:100生物素标记的CTGF抗体储液单元的容积为150μ I、所述的1:100链霉亲和素-辣根过氧化物酶储液単元的容积为150 μ I、所述的标准品和标本用稀释液储液単元的容积为16ml、所述的生物素化抗体稀释液储液单元的容积为16ml、所述的酶结合物稀释液储液单元的容积为16ml、所述的浓缩洗涤液储液单元的容积为20ml、所述的TMB显色剂储液单元的容积为12ml、所述的终止剂储液单元的容积为12ml。所述的包被板条活动设于包被板条支架上。所述的包被板条为矩形板，板上设有12个盛液孔。所述的包被板条一般每盒配置8条。包被板条和包被板条支架均为PP或是PE制成，包被板条支架的形状与包被板条的形状相适应。试剂盒中的各个试剂储液单元可以内设具有不同顔色瓶盖的试剂瓶，以示区分。具体使用方法为将标本或是CTGF标准品以标准品和标本用稀释液稀释到合适浓度，洗涤液以浓缩洗涤液按要求配制，I 100生物素标记的CTGF单抗以生物素化抗体稀释液稀释到合适浓度，I 100链霉亲和素-辣根过氧化物酶以酶结合物稀释液稀释到合适浓度得到酶结合物工作液。从试剂盒中取出包被板条，将稀释好的标本或是CTGF标准品按50 μ I/孔加入到相应的包被板孔中，空白孔除外。用封ロ膜封孔，37°C 60min后用洗涤液洗涤包被板条4次。再加入稀释好的生物素化抗体100 μ I/孔。用封ロ膜封孔，37°C 30min后用洗涤液洗涤包被板条4次。加入酶结合物工作液ΙΟΟμ I/孔，用封口膜封孔，37°C 30min后用洗涤液洗涤包被板条4次。然后各孔加100 μ I的TMB显色剂，37°C避光15min。每孔再加终止液50 μ 1，充分混合后以空白调零，在450nm波长处测量吸光度(A)值。以标准品的浓度为横坐标，标准品对应A值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的A值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，即为样品CTGF的实际浓度。采用本实用新型所述的试剂盒进行实验，结果如下I.检测线性范围0 64 ug/L范围内CTGF和A值呈良好的线性关系(R2=O. 995，P<Q. 001)。2.检测灵敏度与精密度检测灵敏度O. 2 ug/L ;高、低2 份不同CTGF标准品的批内CV分别为4. 5%、9. 8%，批间CV分别为10. 1%、12. 8%，符合ELISA试验批内、批间CV分别不超过10%和15%要求。3.回收实验低值、中值和高值的回收率分别为为98. 2%、101. 9%和103. 8%，均在95% 105%范围内。4.特异性试验结果按优化的 ELISA 条件，取 10 ug/L LPDGF_BB、EGF、IGF_I、FGF以及10名健康人混合血清作为被检标本，所有孔的A45tl值与标准曲线上空白孔A值相近，与加入10 ug/L CTGF标准品孔的A450值差异有统计学意义U= 11. 321，P=O. 000)，表明未发生交叉反应，该方法有较强的特异性。5.血清CTGF与4项肝纤维化指标的相关性分析264例慢性肝病(CHB)血清CTGF和4项肝纤维化指标相关性分析，结果显示，CTGF与HA、PCIII、CIV、LN均呈正相关(r值分别为O. 367,0. 424,0. 528和O. 434，产均〈O. 05)。CHB患者血清CTGF含量与其肝纤维化分期显著相关(rM). 689，/X0. 001)。6. CTGF临床应用肝纤维化诊断效率分析将CTGF与HA、PCIII、LN和CIV实验数据通过受试工作曲线(ROC)分析，结果经ROC曲线分析比较，264例CHB患者CTGF及4项肝纤维化相关指标的诊断性能显示，CTGF区分轻度肝纤维化(S0 SI)和明显肝纤维化组(S2 S4)的曲线下面积(AUC)为 0.841 (95% Cl O. 762 O. 920)，高于 HA 的 O. 797(95% Cl 0. 703 O. 891)，PCIII 的 O. 777 (95% Cl 0. 680 O. 873)，LN 的 O. 767 (95%Cl :0· 670 O. 863 )和 CIV 的 O. 744 (95 % Cl 0. 643- 0.845)。用 ROC 曲线分析比较CTCF, HA、PC III、C IV及LN在诊断最佳临界值时的敏感度、特异度、预测值(阳性和阴性)和约登指数。当CTGF在临界值为10. 3 ug/L时，敏感度为70. 5%，其特异度(82. 4%)、阳性预测值(79. 8%)和约登指数(O. 53)在5项指标中最高，且预测明显纤维化的ROC曲线下面积最大。
权利要求1.一种检测血清结缔组织生长因子用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由盒体和盒盖组成，盒体内分隔为试剂区和设备区，在试剂区设有9个试剂储液单元，分别为CTGF标准品储液单元、I 100生物素标记的CTGF抗体储液单元、1:100链霉亲和素-辣根过氧化物酶储液単元、标准品和标本用稀释液储液単元、生物素化抗体稀释液储液単元、酶结合物稀释液储液单元、浓缩洗涤液储液単元、TMB显色剂储液单元、终止剂储液单元，在设备区设有封ロ膜、若干包被板条和ー个包被板条支架。
2.根据权利要求I所述检测血清结缔组织生长因子用试剂盒，其特征在于，所述的包被板条活动设于包被板条支架上。
3.根据权利要求I或2所述检测血清结缔组织生长因子用试剂盒，其特征在于，所述的包被板条为矩形板，板上设有12个盛液孔。
4.根据权利要求I所述检测血清结缔组织生长因子用试剂盒，其特征在于，所述的CTGF标准品储液单元的容积为O. 5ml、所述的1:100生物素标记的CTGF抗体储液单元的容积为150 μ I、所述的1:100链霉亲和素-辣根过氧化物酶储液単元的容积为150 μ I、所述的标准品和标本用稀释液储液单元的容积为16ml、所述的生物素化抗体稀释液储液单元的容积为16ml、所述的酶结合物稀释液储液単元的容积为16ml、所述的浓缩洗涤液储液单元的容积为20ml、所述的TMB显色剂储液单元的容积为12ml、所述的终止剂储液単元的容积为 12ml。
专利摘要本实用新型公开了一种检测血清结缔组织生长因子用试剂盒，所述试剂盒由盒体和盒盖组成，盒体内分隔为试剂区和设备区，在试剂区设有9个试剂储液单元，分别为CTGF标准品储液单元、1:100生物素标记的CTGF抗体储液单元、1:100链霉亲和素-辣根过氧化物酶储液单元、标准品和标本用稀释液储液单元、生物素化抗体稀释液储液单元、酶结合物稀释液储液单元、浓缩洗涤液储液单元、TMB显色剂储液单元、终止剂储液单元，在设备区设有封口膜、若干包被板条和一个包被板条支架。具有操作简便，灵敏度高，特异性好的优点。
文档编号G01N33/68GK202661471SQ20122034521
公开日2013年1月9日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者王念跃 申请人:南京市第二医院