专利名称：一种动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法
技术领域：
本发明涉及分析化学、食品安全领域，具体地说，是一种动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，尤其涉及杆菌肽、多粘菌素B、粘杆菌素、维吉尼霉素等四种兽药残留量的液相色谱-质谱/质谱检测方法。
背景技术：
多肽类抗生素(/7印iii/M)是由多粘杆菌或产气孢子杆菌的培养液中提取制得。常用的多肽类抗生素有杆菌肽(feciiraci/ )、多粘菌素B {Polymyxin召)、粘杆菌素 (CWiWi/ )、维吉尼霉素(yirginiamycin)等。每种多肽类抗生素都是一种含有多种组分的化合物。多肽类抗生素可分别抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、绿脓杆菌、真菌、病毒、螺旋体、原虫的感染，对败血症、呼吸道感染、泌尿系统感染、牛乳腺炎等疾�。〖亮渴币志� 大剂量时杀菌，被广泛用于家禽、猪、牛等的饲料添加剂和兽药，用来促进动物的生长和治疗畜禽疾病。
随着多肽类抗生素应用的增加，人们逐渐发现其在动物体内的残留，可通过肉、蛋、奶等动物源食品传递给人类。多肽类抗生素的毒性较大，除对细菌细胞膜损伤外，对动物细胞膜也起作用，主要对肾、神经系统有一定毒性。因此，多肽类抗生素在动物源产品中的残留问题给人们身体健康带来了较大的隐患，
目前，多肽类兽药残留量的检测方法主要有微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法、 毛细管电泳法和液相色谱-质谱等方法。GB/T 20743-2006《猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定液相色谱-串联质谱法》公开了猪组织中杆菌肽残留量的检测方法；GB/T 22981-2008《牛奶和奶粉中杆菌肽残留量的测定液相色谱-串联质谱法》公开了牛奶和奶粉中杆菌肽残留量的检测方法；SN(^95-93《出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法杯碟法》 公开了禽肉中杆菌肽残留量检测方法；SN0668-1997《出口肉及肉制品中粘菌素残留量检验方法杯碟法》公开了肉及肉制品中粘菌素残留量检测方法；GB/T 20765-2006《猪肝脏、肾脏、肌肉组织中维吉尼霉素Ml残留量的测定液相色谱-串联质谱法》公开了猪组织中维吉尼霉素Ml残留量的检测方法；GB/T 22991-2008《牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》公开了牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的检测方法；SN/ T1134-2002《进出口肉及肉制品中维吉尼霉素残留量检验方法杯碟法》公开了肉及肉制品中维吉尼霉素残留量检测方法。
上述多肽类兽药残留分析方法中，大多只限于单个抗生素残留量的检测，且前处理方法繁琐。本发明旨在利用LC-MS/MS检测技术，建立一种可同时检测动物源食品中杆菌肽A、 粘杆菌素、多粘菌素B、维吉尼霉素Ml等多种多肽类抗生素残留量检测和确证方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有不足问题，提供一种液相色谱/串联质谱法检测动物源食品中多种多肽类兽药残留量的方法，可方便、准确、高效地同时检测动物源食品中杆菌肽、多粘菌素B、粘杆菌素、维吉尼霉素等四种兽药残留量。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，包括以下步骤
1、样品提取
(1)称取已切碎的肌肉、肾脏或肝脏样品1.0 3. 0 g于50mL具帽离心管中，加入适量无水硫酸钠，再加入5 15mL三氯乙酸溶液和1 ;3mL乙腈，9 500 rpm均质2 min后， 4°C下8 500 rpm离心10 min。上清液经快速定量滤纸转移至另一离心管。残渣中加入提取液超声提取10 min，振荡提取10 min，4°C下8 500 rpm离心10 min，上清液经快速定量滤纸转移至同一离心管(合并两次提取上清液)，待脱脂。
(2)乳样品称取牛奶样品1 3.0 g于50mL具帽离心管中，加入适量无水硫酸钠和 0. 5 1. 5 mL盐酸溶液，涡旋1 min后再加入20 30 mL提取液，超声提取10 min,振荡提取10 min，然后4°C下8 500 rpm离心10 min。上清液经快速定量滤纸过滤于另一离心管，待脱脂。
2、提取液脱脂
向上步所得提取上清液离心管中加入正己烷5 15mL，涡旋2 min，4°C下6 000 rpm 离心5 min。去掉上层(正己烷层)液，得下层液待固相萃取柱净化。
3、固相萃取柱净化
将上步经脱脂的样品提取液转移至已活化好的HLB固相萃取柱(甲醇、水各6mL活化)，上样后先用5 mL水洗涤，弃去流出液。再用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL刻度试管中，整个固相萃取净化过程控制流速不超过2 mL/min。洗脱液在40°C水浴上用氮气吹干，残留物用标样溶解液溶解定容到1.0 mL，混勻，过0.22 Mm微孔滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
4、液相色谱-质谱/质谱仪测定
按照液相色谱一质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描。通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。定量测定时采用标准曲线法。 作为优�。诓街�1 (1)中所述三氯乙酸的使用浓度为1%。 作为优�。诓街�1 (2)中所述盐酸溶液的使用浓度为6 mol/L。 作为优�。诓街�1中所述提取液为甲醇-0. 1 %甲酸水溶液体系(2 5, V/V)。 作为优选，在步骤3中所述HLB固相萃取柱为Oasis，500 mg/6 mL。 作为优�。诓街�3中所述标样溶解液为甲醇-0. 1%甲酸水溶液体系(1 :4, V/V)。 作为优�。诓街�4中所述液相色谱分析条件为
a)色谱柱反相C18色谱柱
b)流动相A 乙腈；流动相B 0. 1%甲酸水溶液，梯度洗脱。
c)柱温30°C
d)流速0. 5 1 mL/min
e)进样量10 20 μ
作为优选，所述反相C18柱为Eclipse XDB-C18分析柱(150_X4. 6 mm, 5Mm)。作为优�。鎏荻认赐殉绦蛭�
0 2分钟，流动相A10%,流动相B90% ；
2 4分钟，流动相AlO 60%，流动相B90 40% ；
4 7分钟，流动相A60%，流动相B40% ；
7. 01 10分钟，流动相A10%，流动相Β90%·
作为优�。诓街�4中所述质谱条件为
a)离子源电喷雾离子源
b)扫描方式正离子扫描
c)检测方式多反应监测(MRM)
d)电喷雾电压(IS):5500. 00 V
e)雾化气(GSl)55. 00 Psi
f)辅助气(GS2) :；35. 00 L/min
g)气帘气(CUR):12. 00 Psi
h)离子源温度(TEM):650°C
i)分别设定母离子、子离子、去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)、碰撞气能量(CE)。
作为优�。诓街�4中标准工作溶液的配置方法为配置单个标准储备液时，杆菌肽A、 粘杆菌素、多粘菌素B选用0. 1%甲酸水溶液为溶剂，维吉尼霉素储备液选用甲醇为溶剂；配置混合标准储备液时，选用甲醇-0. 1%甲酸水溶液体系(1 :4, V/V)为溶剂。 进一步地，所述动物源食品选自猪肉、猪肝、猪肾和牛奶。
进一步地，所述多肽类兽药包括杆菌肽、多粘菌素B、粘杆菌素、维吉尼霉素至少一种。 由于采用上述技术方案，本发明的有益效果在于
1、建立了动物组织(肌肉、肝脏、肾脏、牛奶冲粘杆菌素、杆菌肽A和多粘菌素B和维吉尼霉素Ml等多肽类抗生素残留量的液相色谱-串联质谱法检测方法。实现了对四种多肽类兽药的同时检测。
2、对动物组织、肝脏、肾脏和牛奶等富含蛋白质的样品采用1%三氯乙酸水溶液和乙腈去除蛋白质，对乳样品采用6 mol/L盐酸溶液去除蛋白质，结合均质法提取、低温高速离心分离，再利用甲醇一 0. 1 %甲酸水溶液采用超声、振荡提取、低温高速离心的方式进行提取和分离，提取效率高，提取液中杂质溶出少。
3、提取液采用正己烷液脱脂、HLB固相萃取柱净化，通过对HLB固相萃取柱净化条件的优化，具有较好的净化效果，并保证四种多肽类兽药都有较高的回收率。
4、利用液相色谱-质谱/质谱多反应模式(MRM)检测，具有抗干扰能力强的特点。
5、与以往的方法比较，具有简单、快速、准确、高效等优点，四种多肽类抗生素检测低限分别为粘杆菌素25 Pg/kg，杆菌肽A 100 |ag/kg，多粘菌素B 25(^g/kg，维吉尼霉素Ml 20 Pg/kg。平均回收率分别为粘杆菌素74. 9 88. 1%，杆菌肽A 76. 2 89. 0%，多粘菌素B 76. 6 81. 2%，维吉尼霉素77. 3 86. 9%。变异系数(CV%)分别为粘杆菌素5. 7 15. 1%，杆菌肽A 7. 2 15. 7%，多粘菌素B 6. 0 8. 0 %，维吉尼霉素9. 5 18.6%。方法的检测低限满足国内外相关法规的要求，精密度、回收率等技术指标符合相关标准的规定。6、本发明可应用于动物产品中多肽类兽药残留的检验中，对促进我国动物源食品的进出口贸易，确保食品安全，保障人类身体健康都具有十分重要的意义。
图1为多肽类兽药标准溶液的提取离子流图2 图5分别为空白猪肉、猪肝、猪肾、牛奶样品添加多肽类兽药标准溶液(杆菌肽A lOOPg/kg、粘杆菌素25Pg/kg、多粘菌素B 2(^g/kg、维吉尼霉素Ml 25(^g/kg)提取离子流图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1猪肝中多种多肽类兽药残留量的检测方法
1、样品提取称取已切碎的猪肝样品2.0 g于50mL具帽离心管中，加入适量无水硫酸钠，再加入10 mL 1%三氯乙酸和2 mL乙腈，9 500 rpm均质2 min后，4°C下8 500 rpm 离心10 min0上清液经快速定量滤纸转移至另一离心管。残渣中加入15 mL提取液超声提取10 min，振荡提取10 min，4°C下8 500 rpm离心10 min。合并两次提取上清液，待脱脂。
2、提取液脱脂向上步所得提取上清液离心管中加入正己烷5 15mL，涡旋2min, 4°C 下6 000 rpm离心5 min。去掉上层(正己烷层)液，得下层液待固相萃取柱净化。
3、固相萃取柱净化将上述所得样品提取液转移至已活化好的OasisHLB净化柱(甲醇、水各6mL活化)，上样后先用5 mL水洗涤，弃去流出液。再用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL刻度试管中，整个固相萃取净化过程控制流速不超过2 mL/min。洗脱液在40°C 水浴上用氮气吹干，残留物用标样溶解液溶解定容到1.0 mL，混勻，过0.22 Mm微孔滤膜， 供仪器测定。
4、液相色谱-质谱/质谱仪测定
按照液相色谱一质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描。通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。定量测定时采用标准曲线法。
液相色谱分析条件
a)色谱柱EclipseXDB-C18 柱(150mmX4. 6 mm, 5Mm)
b)流动相乙腈一0. 1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1。
c)柱温:30°C
d)流速0.8 mL/min
e)进样量10μ
表1梯度洗脱程序
权利要求
1.一种动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤(1)样品提�、俪迫∫亚兴榈募∪狻⑸鲈嗷蚋卧嘌�1.0 3. 0 g于50mL具帽离心管中，加入适量无水硫酸钠，再加入5 15mL三氯乙酸溶液和1 :3mL乙腈，9 500 rpm均质2 min后， 4°C下8 500 rpm离心10 min，上清液经快速定量滤纸转移至另一离心管，残渣中加入提取液超声提取10 min，振荡提取10 min，4°C下8 500 rpm离心10 min，上清液经快速定量滤纸转移至同一离心管(合并两次提取上清液)，待脱脂；②乳样品称取牛奶样品1 3.0 g于50mL具帽离心管中，加入适量无水硫酸钠和 0. 5 1. 5 mL盐酸溶液，涡旋1 min后再加入20 30 mL提取液，超声提取10 min,振荡提取10 min，然后4°C下8 500 rpm离心10 min，上清液经快速定量滤纸过滤于另一离心管，待脱脂；(2)提取液脱脂向上步所得提取上清液离心管中加入正己烷5 15mL，涡旋2 min，4°C下6 000 rpm 离心5 min，去掉上层(正己烷层)液，得下层液待固相萃取柱净化；(3)固相萃取柱净化将上步经脱脂的样品提取液转移至已活化好的HLB固相萃取柱(甲醇、水各6mL活化)，上样后先用5 mL水洗涤，弃去流出液，再用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL刻度试管中，整个固相萃取净化过程控制流速不超过2 mL/min，洗脱液在40°C水浴上用氮气吹干，残留物用标样溶解液溶解定容到1.0 mL，混勻，过0.22 Mm微孔滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定；(4)液相色谱-质谱/质谱仪测定按照液相色谱一质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描，通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果，定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物，定量测定时采用标准曲线法。
2.根据权利要求1所述的动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(1)中所述三氯乙酸的使用浓度为1% ；所述盐酸溶液的使用浓度为6 mol/L ；所述提取液为甲醇-0. 1 %甲酸水溶液体系(2 :5，V/V)。
3.根据权利要求1所述的动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述HLB固相萃取柱为Oasis，500 mg/6 mL。
4.根据权利要求1所述的动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述标样溶解液为甲醇-0. 1%甲酸水溶液体系(1 :4，V/V)。
5.根据权利要求1所述的动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(4)中所述液相色谱分析条件为色谱柱反相C18色谱柱流动相A 乙腈；流动相B 0. 1%甲酸水溶液，梯度洗脱柱温30°C流速0· 5 1 mL/min 进样量10 20 μ 。
6.根据权利要求5所述的动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于所述反相 C18 柱为 Eclipse XDB-Cw 分析柱(150mmX4. 6 mm, 5Mm)。
7.根据权利要求5所述的动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于所述梯度洗脱的梯度变化为0 2分钟，流动相A10%,流动相B90% ； 2 4分钟，流动相AlO 60%，流动相B90 40% ； 4 7分钟，流动相A60%，流动相B40% ；7.01 10分钟，流动相A10%，流动相B90%。
8.根据权利要求1所述的一种动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(4)中所述质谱条件为离子源电喷雾离子源扫描方式正离子扫描检测方式多反应监测(MRM) 电喷雾电压(IS) :5500. 00 V 雾化气(GSl) 55. 00 Psi 辅助气(GS2) 35. 00 L/min 气帘气(CUR) 12. 00 Psi 离子源温度(TEM) 6500C分别设定母离子、子离子、去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞室出口电压 (CXP)、碰撞气能量(CE)。
9.根据权利要求1所述的动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(4)中标准工作溶液的配置方法为配置单个标准储备液时，杆菌肽A、粘杆菌素、多粘菌素B选用0. 1%甲酸水溶液为溶剂，维吉尼霉素储备液选用甲醇为溶剂；配置混合标准储备液时，选用甲醇-0. 1%甲酸水溶液体系(1 :4，V/V)为溶剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，其特征在于所述动物源食品选自猪肉、猪肝、猪肾和牛奶的至少一种；所述多肽类兽药包括杆菌肽、多粘菌素B、粘杆菌素、维吉尼霉素的至少一种。
全文摘要
本发明涉及分析化学、食品安全领域。一种动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法，样品经TCA-乙腈体系沉淀蛋白、甲醇-0.1%甲酸水溶液体系提�。琌asisHLB固相萃取柱净化后，采用EclipseXDB-C18分析柱，以乙腈—0.1﹪甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，电喷雾、正离子扫描模式分离与检测四种多肽类抗生素。四种多肽类抗生素检出限分别为粘杆菌素25μg/kg，杆菌肽A100μg/kg，多粘菌素B 250μg/kg，维吉尼霉素M120μg/kg。回收率粘杆菌素74.9～88.1％，杆菌肽A76.2～89.0％，多粘菌素B76.6～81.2%，维吉尼霉素77.3～86.9％。变异系数(CV%)分别为粘杆菌素5.7～15.1％，杆菌肽A7.2～15.7％，多粘菌素B6.0～8.0%，维吉尼霉素9.5～18.6％。检测限、回收率和精密度等技术指标满足国内外检测的有关要求。
文档编号G01N30/34GK102236005SQ201110096739
公开日2011年11月9日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者孙兴权, 林维宣, 董伟峰, 蒋维旗 申请人:林维宣
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