亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：一种高通量法检测人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法
技术领域：
本发明属于医学技术领域，涉及ー种高通量法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法。
背景技术：
人免疫球蛋白G(Human Immunoglobulin G, IgG),抗体分子,血衆免疫球蛋白中占75%,由血衆B细胞合成和分泌。免疫球蛋白Fe片段(Fragment crystallizable region),是细胞表面受体和某些补体系统蛋白相互作用的抗体尾部区域部分，能激活免疫系统，与人IgG的药物有效性相关。生产过程中的纯化、病毒灭活、超滤、过滤，以及制品存放都能够导致IgG分子生物活性降低和退化。主要表现为IgG的Fe功能改变，并最终导致抗体活性包括中和病毒、细菌和毒素(白喉、破伤风)及调理作用和诱发吞噬作用衰减。一般通过特异性抗体(免疫球蛋白)Fab段与红细胞上已包被的相应抗原结合，抗体暴露出Fe段补体Clq的结合位点，从而激活后续的补体各成分，最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂，释放出血红蛋白。通过溶血反应动力学曲线，计算IgG激活补体活性的功能指数(IFc)，以此測定IgG供试品Fe段生物学活性。据统计，2011年我国各种人IgG制品市场销售额占血液制品总额的约50%，大于60亿元。2008-2011年，我国血液制品各种人IgG市场批签发供应量大于5100万瓶，但是对于人IgG活性功能检测暂时还未开展。IgG的最主要的生物学功能是对微生物的调理作用，正常的调理作用需要IgG能识别吞噬细胞表面Fe受体，这首先要求IgG要有完整的Fe段功能，与微生物特异结合的抗体(Fab)通过IgG完整的Fe段与吞噬细胞的受体相结合，形成抗原-抗体-吞噬细胞的连锁结合，促成吞噬细胞对微生物的接触及吞噬(调理作用)。IgG对自身免疫性疾病的免疫调节机制也往往通过Fe片段来完成，包括效应细胞Fe受体的竞争性抑制、抑制性Fe Y R IIB受体的诱导及FcRn受体饱和作用等。目前文献报道的方法无论从检测成本还是检测通量都不适合实现人IgG的Fe段生物学活性測定可行性和普及性。现行人IgG的Fe段生物学活性測定情况，例如欧洲药典7. O用风疹抗原和鞣酸化的压积红细胞制备敏化红细胞用于人IgG的Fe生物学活性检测，该法要求风疹抗原凝血単位要求大于256个单位，而浓缩的风疹抗原国内难以购买，国外产品Aalto BioAW6088风疹病毒抗原Img价格大约是15000人民币，其检测成本非常惊人；2010版中华人民共和国药典用白喉类毒素或腮腺炎病毒鞣酸化的压积红细胞用于人IgG生物学活性检测，该法缺点ー是没有办法提高检测通量只能单个样品检测，浪费人力和物力，不利于IgG活性检测的普及；缺点ニ是白喉类毒素使用和购买存在原料试剂来源的问题，而腮腺炎病毒使用需要安全级别BSL-2生物安全实验室，对于专业技术操作和实验室硬件条件要求较高，也不利于人IgG的Fe段生物学活性检测的普及；2000年Ramasamy I等发现了流式细胞方法评估IgG的Fe片段功能活性检测，对于专业技术操作和实验室硬件条件要求较高，也不利于人IgG的Fe段生物学活性检测的普及；2004年Vrdoljak A等用破伤风类毒素作为抗原代替难以获得的高滴度的风疹病毒抗原，測定人IgG制剂Fe段生物学功能的方法；2009年Georgakopoulos T等用冰冻的红细胞代替需要连续的新鲜人红细胞测定人IgG制剂Fe段生物学功能的方法；2012年，Georgakopoulos T等用Kodecyte技术将CMV抗原包被到红细胞上，得到标准化制备敏化红细胞，用于快速检测人IgG制剂Fe段的方法。以上各种方法在敏化红细胞的病毒抗原标记和人IgG的Fe段生物学活性检测通量方面均作了不同程度的探索，但是均未能成功建立一种廉价且高通量检测人IgG的Fe段生物学活性的方法。

发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种高通量法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，用于替代现行2010年版第3部中华人民共和国药典 附录X P人免疫球蛋白Fe段生物学活性測定法。具体而言，通过修改原測定法中敏化红细胞标记抗原选用品种，降低测定过程中各种样品上样量，另外样品检测用全自动酶联免疫检测仪替代紫外分光光度计单个样品的測定。该方法有效降低检测成本，缩短样品检测时间，提高检测样品的通量，为实现人免疫球蛋白Fe段生物学活性測定可行性和普及性奠定基础。具体技术方案为一种高通量法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，包括以下步骤I)敏化红细胞的制备A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量积压红细胞悬浮于I. 3mg/L鞣酸PBS (I 40)，置于37°C水浴中轻摇30分钟后再用PBS洗涤3次，最后用PBS制备成2. 5%红细胞悬浮液；B液，用吸附无细胞百白破联合疫苗与I %氯化铬溶液O. 25ml (10 I)混合后，置于37 °C水浴中轻摇15分钟；将A液、B液按I : 4混合，置于37°C水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用PBS将沉淀(敏化红细胞)洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液悬浮红细胞，调节至适宜浓度；2)參考品和供试品溶液的制备用O. 5mol/L氢氧化钠溶液将參考品和样品pH调节至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每Iml含40mg蛋白含量；3)取供试品溶液O. 225ml，加入敏化红细胞悬液O. 025ml，混匀，置于37°C水浴中轻摇30分钟；4)离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液Iml洗涤红细胞，共洗3次，末次离心后弃上清液200 μ 1，向沉淀中加入150 μ I预热到37°C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，加入到96孔酶标板上；6) 2分钟后，再加入已稀释至每Iml含150units的CH5tl的豚鼠补体50 μ 1，混匀后在波长541nm处测定起始吸光度(As)；7)每隔I分钟测定I次，即得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线，当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止測量；8)按公式S’ = Sexp/As分别计算出參考品、供试品和阴性对照曲线斜率；
按公式IF。= 100% X [(Ss^ -sc，)/(s/ -sc，)]计算供试品激活补体的功能指数(Ifc)公式中S’为用As修正Sexp得到的曲线斜率；As分别为供试品、參考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度；Sexp分别为根据供试品、參考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的曲线最大斜率；Ifc为供试品激活补体的功能指数；Ss’为供试品曲线斜率；S。’为阴性对照曲线斜率； S/为參考品曲线斜率。本发明所述方法中，数据采集处理选用MD公司M2e软件softMax pro 5. 3或Bio-Tek Synergy Hl软件Gen5,辅助数据分析处理选用originlab origin V8. 6和微软Office excel2003o步骤2)所述參考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)可平行处理，同法操作。本发明的有益效果本发明的技术方案使现行人IgG Fe段生物学活性測定，降低检测成本，缩短检测时间，检测通量从原来单个样品检测提高32倍以上，而且其检测结果和2010版第3部中华人民共和国药典附录X P人免疫球蛋白Fe段生物学活性測定法数据比较，新发明的检测结果在合理的理论范围内。在一种廉价高通量检测人IgG Fe段生物学活性的方法发明中，用吸附无细胞百白破联合疫苗替代欧洲药典7. O提及的风疹抗原或2010版第3部中华人民共和国药典提及的白喉类毒素或腮腺炎病毒，用MD公司M2e或Bio-Tek SynergyHl全自动酶联免疫检测仪测定替代紫外分光光度计单个样品的測定，既能有效降低用于敏化红细胞标记抗原成本，又能提高人IgG Fe段生物学活性检测的通量32倍以上。该方法有效降低检测成本，缩短样品检测时间，提高检测样品的通量，为实现人免疫球蛋白Fe段生物学活性測定可行性和普及性奠定基础。


图lUltrospec 6300pro紫外分光光度法和全自动酶联免疫检测法比较图；图2Ultrospec 6300pro紫外分光光度法反应动カ曲线图；图3全自动酶联免疫检测法反应动カ曲线图。
具体实施例方式下面结合附图具体实施方式
对本发明的方法作进ー步详细地说明。实施例lUltrospec 6300pro紫外分光光度法I.敏化红细胞的制备A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量积压红细胞悬浮于I. 3mg/L鞣酸PBS (I 40)，置于37°C水浴中轻摇30分钟后再用PBS洗涤3次，最后用PBS制备成2. 5%红细胞悬浮液。B液，用吸附无细胞百白破联合疫苗与I %氯化铬溶液0.25ml (10 I)混合后，置于37 °C水浴中轻摇15分钟。将A液、B液按I : 4混合，置于37°C水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用PBS将沉淀(敏化红细胞)洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液悬浮红细胞，调节至适宜浓度。2.參考品和供试品溶液的制备用O. 5mol/L氢氧化钠溶液将參考品和样 品pH调节至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每Iml含40mg蛋白含量(根据溶液实际情况操作)。3.测定法取供试品溶液O. 9ml，加入敏化红细胞悬液O. 1ml，混匀，置于37°C水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液Iml洗涤红细胞，共洗3次。末次离心后弃上清液800 μ 1，向沉淀中加入600 μ I预热到37°C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每Iml含150units的CH5tl的豚鼠补体200 μ 1，混匀后立即照紫外-可见光分光光度法在波长541nm处测定起始吸光度(As)，每隔I分钟测定I次，既得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止測量。分别取參考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)O. 9ml，自“加敏化红细胞悬液O. lml”起，同法操作。按公式(I)分别计算出參考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IF。)S，= Sexp/As(I)Ifc = 100% X [(Ss，_SC，)/(S/ -Sc，)] (2)公式中S’为用As修正Sexp得到的曲线斜率；As分别为供试品、參考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度；Sexp分别为根据供试品、參考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的曲线最大斜率；Ifc为供试品激活补体的功能指数；Ss’为供试品曲线斜率；S。’为阴性对照曲线斜率；S/为參考品曲线斜率。实施例2全自动酶联免疫測定法I.敏化红细胞的制备同实施例I2.參考品和供试品溶液的制备同实施例I3.测定法全自动酶联免疫測定法取供试品溶液O. 225ml，加入敏化红细胞悬液O. 025ml,混匀，置于37°C水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液Iml洗涤红细胞，共洗3次。末次离心后弃上清液200 μ 1，向沉淀中加入150 μ I预热到37°C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，加入到96孔酶标板上，2分钟后再加入已稀释至每Iml含150units的CH5tl的豚鼠补体50 μ 1，混匀后立即在波长541nm处测定起始吸光度(As)，之后，每隔I分钟测定I次，既得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止測量。參考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)可平行处理，同法操作。按公式(I)分别计算出參考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IF。)S，= Sexp/As(I)Ifc = 100% X [(Ss，_SC，)/(S/ -Sc，)] (2)公式中S，为用As修正Sexp得到的曲线斜率；As分别为供试品、參考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度；Sexp分别为根据供试品、參考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的曲线最大斜率；Ifc为供试品激活补体的功能指数；Ss’为供试品曲线斜率； S。’为阴性对照曲线斜率；S/为參考品曲线斜率。4.全自动酶联免疫检测法数据验证我们为了验证全自动酶联免疫检测法可行性和准确性，一共做过四次实验，设计16个检测样本(包括ー个空白对照)，分别计算相关实验数据。通过Ultrospec 6300pro紫外分光光度法检测法数据和全自动酶联免疫检测法比较，对我们新建实验方法可行性和准确性进行数学统计学分析。数据统计结果见表I。表lUltrospec 6300pro紫外分光光度法和全自动酶联免疫检测法数据比较表

Octaga Oclaiia
201 201 201 201 201 m-A10 m-B14 201020102010 2010 20102010 2011 201权利要求
1.一种高通量法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)敏化红细胞的制备 A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞，取积压红细胞以I : 40的比例悬浮于I. 3mg/L鞣酸PBS，置于37°C水浴中轻摇30分钟后再用PBS洗涤3次，最后用PBS制备成2. 5%红细胞悬浮液； B液，用吸附无细胞百白破联合疫苗与I %氯化铬溶液O. 25ml以10 : I的比例混合后，置于37°C水浴中轻摇15分钟； 将A液、B液按I : 4混合，置于37°C水浴中轻摇30分钟，离心，去上清液，用PBS将敏化红细胞沉淀洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液悬浮红细胞，调节至适宜浓度； 2)參考品和供试品溶液的制备 用O. 5mol/L氢氧化钠溶液将參考品和样品pH调节至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每Iml含40mg蛋白含量； 3)取供试品溶液O.225ml，加入敏化红细胞悬液O. 025ml，混匀，置于37°C水浴中轻摇30分钟； 4)离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液Iml洗涤红细胞，共洗3次，末次离心后弃上清液200 μ 1，向沉淀中加入150 μ I预热到37°C的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀,加入到96孔酶标板上； 6)2分钟后，再加入已稀释至每Iml含150units的CH5tl的豚鼠补体50 μ 1，混匀后在波长541nm处测定起始吸光度(As)； 7)每隔I分钟测定I次，即得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动カ学曲线，当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止測量； 8)按公式S’=Sexp/As分别计算出參考品、供试品和阴性对照曲线斜率； 按公式Ifc = 100% X [(S/-S/)/(S/-S/)]计算供试品激活补体的功能指数(Ifc) 公式中S’为用As修正Sexp得到的曲线斜率； As分别为供试品、參考品及阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度； Sraip分别为根据供试品、參考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出相邻3点间的曲线最大斜率； Ifc为供试品激活补体的功能指数； S/为供试品曲线斜率； S。’为阴性对照曲线斜率； S/为參考品曲线斜率。
2.根据权利要求I所述的高通量法检测人免疫球蛋白Fe段生物学活性的方法，其特征在于，步骤2)所述參考品及牛白蛋白-巴比妥缓冲液阴性对照可平行处理，同法操作。
全文摘要
本发明公开了一种高通量法检测人免疫球蛋白Fc段生物学活性的方法，包括以下步骤1)敏化红细胞的制备；2)参考品和供试品溶液的制备；3)测定。具体而言，通过修改原测定法中敏化红细胞标记抗原选用品种，降低测定过程中各种样品上样量，另外样品检测用全自动酶联免疫检测仪替代紫外分光光度计单个样品的测定。该方法有效降低检测成本，缩短样品检测时间，提高检测样品的通量，为实现人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定可行性和普及性奠定基础。
文档编号G01N33/68GK102721817SQ20121021400
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者喻洪跃, 张学俊, 李长清, 肖小璞 申请人:中国医学科学院输血研究所