专利名称：一种病毒感染检测方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒感染的检测方法，具体涉及一种用多肽作为抗原检测病毒感染的方法。
背景技术：
目前世界各地对病毒类疾病的诊断方法主要有病毒分离、分子生物学诊断(RT -PCR)和基于血清学试验的免疫过氧化物酶细胞单层测定法(IPMA)，中和试验(SN)，间接免疫荧光试验(ILFT)，和酶联免疫吸附试验(ELISA)等等。与其他方法与相比，ELISA检测操作简便，易于标准化，快速敏感，非常适合进行大规模流行病调查和疫病监测。ELISA检测又分为间接ELISA和竞争ELISA。传统的ELISA法检测中，包被抗原的用量大，一般需要5 10μ g/ml。由于抗原的使用量大，使得其检测成本也较为高昂，不利于该方法的推广使用。多年来，研究人员，一直试图将合成多肽更广泛地用于疾病诊断的试剂中，以便缩短产品的研发时间，简化生产程序，降低生产成本，但成功的例子很少。这是由于保持包被多肽在固相(ELISA板)上正确方向性的技术问题一直未解决，从而严重影响了多肽与目标抗体的结合，导致多肽ELISA的灵敏度偏低，非特异背景读值偏高。下面以猪蓝耳病为例，说明现有技术中所存在的问题。猪蓝耳病是一种由属于冠状病毒科动脉炎病毒属的病毒引起的疾病。该病是制约规模化猪场繁殖性能的主要传染性疾�。现赜跋煳夜褪澜缪硪档姆⒄�。猪蓝耳病病毒为单股正链RNA病毒，本病病原有欧洲型LV病毒(I型)和美洲型VR 病毒(II)。中国的蓝耳病毒由国外传入属II型。患病猪以繁殖障碍、呼吸困难、耳朵蓝紫、 并发其他传染病为主要特征。猪蓝耳病的另一显著特点，是病毒很容易发生变异。例如， 1997年以后，蓝耳病(PRRS)发生的特征及临床症状和以往的典型蓝耳病有较大的区别。 2006年，全国大范围暴发的猪“高热病”传染源为一猪蓝耳病病毒变异株，该变异株的致病性更强，因此定名为“高致病性猪蓝耳病毒”。目前对猪蓝耳病的诊断主要是PRRS病毒的实验室诊断，诊断的方法有病毒分离、 分子生物学诊断(RT - PCR)和基于血清学试验的免疫过氧化物酶细胞单层测定法(IPMA)， 中和试验(SN)，，间接免疫荧光试验(ILFT)，和酶联免疫吸附试验(ELISA)等进行PRRS诊断。酶联免疫吸附实验又分为间接ELISA和竞争ELISA。传统的ELISA法检测中，包被抗原的用量大，一般需要5 10μ g/ml。由于抗原的使用量大，使得其检测成本也较为高昂，不利于方法的推广使用。美国IDEXX公司以PRRS全病毒破碎物为包被抗原而生产的ELISA试剂盒是目前用来检测蓝耳病常用的一种方法。但此ELISA的特异性差一些，不能区分欧洲型和美洲型病毒感染。近年来，IDEXX公司以重组PRRSV核蛋白(N蛋白)为包被抗原而生产的ELISA (HerdChek PRRS 2XR)虽然检测灵敏度有所改善，但仍不能区分欧洲型和美洲型。2009 年，美国的 Ying Fan (Clinical And Vaccine Immunology, May 2009，p. 628—635)领导的小组以重组PRRSV非结构蛋白7 (nsp7)为包被抗原而建立的ELISA虽然可以区分欧洲型和美洲型蓝耳病毒感染，但仍不能区分同一型的不同亚型，或鉴别蓝耳病的原毒株和变异株。所以，以PRRS全病毒，或重组病毒蛋白建立的ELISA由于特异性差，不能用于不同亚型蓝耳病病毒的检测，从而不能为生产的决策提供详尽的信息，使蓝耳病的预防变得很困难。如果能根据不同蓝耳病毒亚型所具有的不同免疫表位多肽抗原(印itope)而设计一种多肽ELISA，假设这种ELISA可以鉴别蓝耳病的爆发是由原毒株引起还是变异株引起； 猪场是单一感染还是几种PRRSV毒株同时存在，追溯新毒株的来源；也可鉴别疫苗毒和野毒，鉴定疫苗病毒中和抗体，我们就有可能彻底控制和清除蓝耳病毒感染。Oleksiewicz MB 等 2005 年[J Virol Methods. 2005 Nov;129(2):134-44]用来自PRRSV的4号开放阅读框(0RF4)糖蛋白的免疫活性多肽作为ELISA包被抗原，检测血清中特异PRRSV抗体，以期鉴别抗体的来源，即区分PRRS疫苗毒和PRRS野毒。Plagemarm PG. , 2006使用PRRSV GP5多肽包被的ELISA来测定免疫猪的病毒中和抗体[Viral Immunol. 2006 Summer ； 19 O)沘5_93]，使用PRRSV的N蛋白多肽包被的ELISA来诊断 PRRS [J Virol Methods. 2006 Jun; 134(1-2) :99-118. Epub 2006 Jan 19]。这两实验例均显示多肽ELISA技术的可行性和检测的特异性。但其同样存在如上所述的保持包被多肽在固相(ELISA板)上正确方向性的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种病毒检测方法，该方法是将反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上，从而解决了保持包被多肽在固相(ELISA板)上的正确方向性。本发明所采取的技术方案是 一种病毒感染检测方法，包括如下步骤
1)将病毒反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上，得到偶联多肽；
2)在包被液中加入上述偶联多肽，再加入待检血清样本，进行ELISA检测，根据免疫吸附反应判断病毒及其亚型感染。优选的，所述偶联多肽的制备方法包括如下操作
1)取反应原性多肽溶解，得到多肽溶液；
2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；
3)在多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均勻；
4)将多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均勻，搅拌反应，使多肽偶联到非蛋白多聚体
上；
5)使用透析袋去除未参与结合的偶联剂，纯化，冻干，得到偶联多肽。优选的，所述偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳二亚胺(EDC)、N，N' -二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚基胺盐酸盐(EEDQ)、戊二醛中的至少一种。优选的，所述非蛋白多聚体为具有可偶联基团的非蛋白多聚体，可偶联基团为氨基(-NH2)，羧基(-C00H)，巯基(-SH)中的至少一种。优选的，所述非蛋白多聚体为多糖、脂质体中的至少一种。
本发明的检测方法，通过对非蛋白多聚体的选择，以及对反应原性多肽、非蛋白多聚体、偶联剂三种物质反应顺序的控制，从而将反应原性多肽对免疫不重要的一端定向偶联到非蛋白多聚体上，从而显著提高检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，具有特异性高，操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。本发明的检测方法，包被抗原用量可减至lOng/ml，降低了成本，有利于推广应用。
图1是偶联多肽P4反应原性的ELISA检定结果图2是不同浓度的游离多肽P4和本发明偶联多肽P4的ELISA结果图； 图3是不同偶联多肽的与不同抗血清的ELISA结果图； 图4是偶联多肽P4与PRRS病毒抗血清的EL ISA结果图。
具体实施例方式一种病毒感染检测方法，包括如下步骤
1)将病毒反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上，得到偶联多肽；
2)在包被液中加入上述偶联多肽，再加入待检血清样本，进行ELISA检测，根据免疫吸附反应判断病毒及其亚型感染。优选的，所述偶联多肽的制备方法包括如下操作
1)取反应原性多肽溶解，得到多肽溶液；
2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；
3)在多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均勻；
4)将多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均勻，搅拌反应，使多肽偶联到非蛋白多聚体
上；
5)使用透析袋去除未参与结合的偶联剂，纯化，冻干，得到偶联多肽。优选的，所述偶联剂为1-乙基-3-(3_二甲基氨丙基)_碳二亚胺(EDC)、N，N' -二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚基胺盐酸盐(EEDQ)、戊二醛中的至少一种。优选的，所述非蛋白多聚体为具有可偶联基团的非蛋白多聚体，可偶联基团为氨基(-NH2)，羧基(-C00H)，巯基(-SH)中的至少一种。优选的，所述非蛋白多聚体为多糖、脂质体中的至少一种。下面，根据猪蓝耳病病毒的检测方法为实施例对本发明作进一步的说明。当然，根据本领域技术人员的理解范围，本发明方法同样可以应用于其它病毒的检测，因此，本发明的保护范围并不局限于此。实施例1 1.多肽的筛选
有效多肽段的选择和确定，是通用计算机分析软件对猪蓝耳病毒蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇(印itopes)。使用 ELISA检测不同多肽与猪蓝耳病毒抗血清的反应，最后选出具有良好反应原性的多肽。
本实施例根据美洲/中国型蓝耳病毒(PRRSV)蛋白序列，筛选出8条具有良好反应原性的多肽，序列如下所示
Pl iKKEKKKTKSVKSLPGNKPVPC (SEQ ID NO 1)； P2 :KKCQPVKDSWMSSRGFDE (SEQ ID NO 2)； P3 :CSAGTGGADLPTDLPPKK (SEQ ID NO 3)； P4 :KRCSEDDHDDLGFMVPK (SEQ ID NO 4)； P5 :CGFMVPPGLSSEGHLTKK (SEQ ID NO 5)； P6 :CLKSLVLGGRKAVKQGKK (SEQ ID NO 6)； P7 :KAVKQGVVNLVKYAKC (SEQ ID NO 7)； P8 :KEKAVKQGVVNLVKYAKC (SEQ ID NO :8)。2.多肽的合成
多肽是由全自动多肽合成仪合成，根据Fmoc化学合成方法，先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，即可得到多肽。3.多肽的纯化
由HPLC仪完成，其基本过程是，使用反相柱(如C8，C18等)，214nm，缓冲体系为含TFA 的溶剂，PH 2. 0，缓冲液A为含0. 1%TFA/双蒸水，缓冲液B为1%TFA/ACN/ pH 2. 0。多肽纯化前用缓冲液A溶解；如果溶解不好，先用缓冲液B溶解，然后用缓冲液A稀释；使用HPLC 样本注射器将多肽溶液注射到HPLC仪内进行纯化和分析。4.偶联多肽的制备
称取IOmg的多肽，加50 μ 1 DMSO溶解，然后加入IOml双蒸水.称取Img的多糖葡糖胺，加Iml PBS溶解，在多糖溶液内加10 mg偶联剂EDC混勻，然后与多肽溶液混合， 室温搅拌反应3小时。使用透析袋(孔径MWCO 10000-12000)去除未参与结合的偶联剂 (EDC)，纯化、冻干，得到偶联多肽。上述步骤中的多肽可选自ΡΓΡ8 ；多糖葡糖胺还可以替换成其他具有可偶联基团的非蛋白质多聚体，如脂质体、人工合成多糖等，可偶联基团为氨基(-NH2),羧基(-C00H)， 巯基(-SH)中的至少一种。这些偶联基团可与多肽上的自由氨基或羧基偶联，形成偶联多肽。偶联剂EDC可活化非蛋白多聚体或多肽的-C00H，将非蛋白多聚体的-C00H/-NH2和多肽的-NH2/-C00H连起来，此外，还可以选用其他具有相同功能的偶联剂，如N，N' - 二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚基胺盐酸盐(EEDQ)等。同样地，本领域技术人员还可以根据实际情况及需要(如多肽、非蛋白多聚体、偶联剂的性质) 来决定多肽、非蛋白多聚体、偶联剂的反应量及三种物质的反应顺序。5.偶联多肽反应原性的ELISA检定
其基本过程如下包被液5. 3 g Na2CO3和4. 2 g NaHCO3加1 L双蒸水，pH 9. 6 ；稀释液PBS/0.1% BSA;洗涤液PBS/0.05% Tween-20 (PBST)。在包被液中添加偶联多肽，使包被 液中的偶联多肽浓度为5Pg/ml ；将含有偶联多肽P4的包被液加入抗原包被板中(100 μ /孔)，37°C作用2小时，PBST洗涤5次，然后将同一型或不同型的猪PRRSV阳性抗血清 (猪PRRSV不同阴阳性抗血清是购于美国农业部动物制品标准实验室)用PBS/0. 1% BSA倍比稀释后，加入每孔中，37°C作用30分钟，PBST洗涤5次，山羊抗猪的碱性磷酸酶标二抗用 PBS进行1 :2000稀释，加入每孔中，37°C作用30分钟，PBST洗涤5次，加入PNPP底物，37°C 作用10分钟，然后在分光光度仪上读405nm值。ELISA检定结果如图1所示，偶联后的多肽 P4仍具有反应原性。6.对比实验 按同样的浓度将未偶联的多肽与包被液混合，同样条件下检测其与抗体反应，检测其吸附值。其结果如图2所示。图中，试验抗体来自猪抗多肽P4血清，抗血清按1 5000稀释， 山羊抗猪碱性磷酸酶按1:2000稀释。图2的图例中，左侧为游离多肽P4，右侧为偶联多肽 P4。从图2中可以看出，通过将多肽P4偶联后，在低浓度下，其反应活性明显高于游离多肽，可见，本发明的检测方法在保证检测结果的同时，可以显著降低多肽的用量。7.特异性实验
将不同偶联多肽与不同的不同抗血清进行ELISA反应，其结果如图2所示。图2的图例中，从左到右依次为1 100稀释的美洲PRRSV阴性猪血清、1 :50稀释的美洲PRRSV阴性猪血清、1 200稀释的美洲PRRSV阳性猪血清、1 100稀释的美洲PRRSV阳性猪血清、1 50稀释的美洲PRRSV阳性猪血清、1 200稀释的欧洲PRRSV阳性猪血清、1 100稀释的欧洲PRRSV 阳性猪血清、1 50稀释的欧洲PRRSV阳性猪血清；偶联多肽中使用的多肽Pl P8来自美洲PRRSV ；偶联多肽的包被浓度为10 ng/ml。从图3中可以看出，本发明的检测方法具有很好的特异性。8.灵敏性实验
将来自美洲PRRSV的多肽P4经偶联后得到偶联多肽P4，将不同浓度包被的P4与美洲 PRRSV阴性和阳性猪血清进行ELISA反应。其结果如图4所示，图4的图例中，从左到右依次为以 104ng/ml、103ng/ml、102ng/ml、10 ng/ml 浓度包被的抗原。从图4中可知，使用10 ng/ml的包被浓度足以正确地区分不同的猪血清。
权利要求
1.一种病毒感染检测方法，其特征在于包括如下步骤1)将病毒反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上，得到偶联多肽；2)在包被液中加入上述偶联多肽，再加入待检血清样本，进行ELISA检测，根据免疫吸附反应判断病毒及其亚型感染。
2.根据权利要求1所述的一种病毒感染检测方法，其特征在于所述偶联多肽的制备方法包括如下操作1)取反应原性多肽溶解，得到多肽溶液；2)取非蛋白多聚体溶解，得到非蛋白多聚体溶液；3)在多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂，混合均勻；4)将多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均勻，搅拌反应，使反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上；5)使用透析袋去除未参与结合的偶联剂，纯化，冻干，得到偶联多肽。
3.根据权利要求2所述的一种病毒感染检测方法，其特征在于，所述偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)、Ν,Ν' -二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚基胺盐酸盐(EEDQ)、戊二醛中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的一种病毒感染检测方法，其特征在于所述非蛋白多聚体为具有可偶联基团的非蛋白多聚体，可偶联基团为氨基(-NH2),羧基(-C00H)，巯基 (-SH)中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的一种病毒感染检测方法，其特征在于所述非蛋白多聚体为多糖、脂质体中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了一种病毒感染检测方法，包括如下步骤(1)将病毒反应原性多肽偶联到非蛋白多聚体上，得到偶联多肽；(2)在包被液中加入上述偶联多肽，再加入待检血清样本，进行ELISA检测，根据免疫吸附反应判断病毒及其亚型感染。本发明的检测方法，可显著提高检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，具有特异性高，操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。本发明的检测方法，包被抗原用量可为10ng/ml，用量少，有利于推广应用。
文档编号G01N33/569GK102323409SQ20111021773
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年1月17日
发明者李其昌, 王贵平, 陈克宏 申请人:广东现代农业集团研究院有限公司
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